一、常用微生物檢測技術

1.染色技術

染色技術則是對微生物細胞進行染色后，對微生物進行觀察檢測的一種技術，不過由于染色后微生物標準基本是死的，其形態和結構會在染色過程中發生一定變化，無法切實反應出活細胞的真實情況，因此通常只作為輔助檢測手段。在實際操作中，整個流程也較為繁瑣，染色、脫色都需要嚴格控制，否則將會影響檢測結果的準確性。

2.分離純化技術

自然環境中的微生物通常是雜居混生的，在微生物檢測中需要對混生微生物群體進行分離純化，以對純微生物進行檢測的技術，分離純化技術常用于菌種鑒定中，分離純化技術是微生物檢測的一項重要技術，是微生物檢測的重要基礎。

3.其它技術

在微生物常規檢測中，通常對微生物進行形態結構、培養特性方面的觀察，再利用化學反應來測定微生物的代謝物，以鑒別一些形態和其它方面不易區別的微生物，以更好的進行微生物分類鑒定。近年來，在環境監測中，微生物檢測技術運用方法較為廣泛，如運用細菌總數和糞便污染指示菌監測水質，運用發光細菌檢測環境有毒物質，運用水中藻類生長量監測水質或物質霉性等等，這些方法都已經有了較為成熟的操作手段和檢驗標準，具有較強的實踐價值。

0引言   酯酶（Esterases，EC3．1．1．X）是一種催化酯鍵水解和合成的酶的總稱，水解時催化酯鍵產生甘油和脂肪酸；合成時，把酸的羧基與醇的羥基脫水縮合，產物為酯類及其他香味物質．它廣泛存在于動物、植物和微生物中．動物胰臟酯酶和微生物酯酶是酯酶的主要來源．1834年Eberle在兔胰臟中首次發現脂肪酶，微生物酯酶則以1935年Kirsh發現產脂肪酶的草酸青霉（PenicilliumOxalicum）為最早．由于微生物資源豐富，同時利用微生物發酵產酶具有便于工業化生產等優點，微生物酯酶得到關注，并且已經廣泛應用于農業、食品釀造、醫藥化學、污水處理和生物修復等領域，又由于酯酶的酶促反應具有較高的底物專一性、區域選擇性或者對映選擇性，它是合成手性化合物（如手性藥物，農藥等）的高效生物催化劑，微生物酯酶已成為研究熱點．   1微生物酯酶的組成及來源   1．1酯酶的組成   酯酶主要包括脂肪酶（Lipase，triacylglycerolhydrolases，EC3．1．1．3）和羧酸酯酶（carboxylesterases，arboxylesterhydrolases，EC3．1．1．1）［1－2］，兩者在生化方面沒有本質區別，只是在底物特異性上，羧酸酯酶傾向于水解酰基鏈長度小的底物（≤10），而脂肪酶傾向于水解酰基鏈長度大的底物（≥10）［3－4］，在結構上，酯酶屬于α／β水解酶超家族，具有Ser－His－Asp構成的催化中心三組合（catalytictriad），其中Ser通常位于具有保守的Gly－Xaa－Ser－Xaa－Gly五肽結構內［1－2］．細菌脂肪酶又包括八大家族：truelipase，GDSL，FamilyIII，thehormone－sensitivelipase（HSL），FamilyV－VIII，其中truelipase又包括7個亞族SubfamilyI．1－I．7［2，5］．阿魏酸酯酶（Ferulicacidesterase，EC．3．1．1．73）又稱為肉桂酸酯酶，是最近分離出一種酯酶，它是羧酸酯水解酶的一個亞類，它能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯鍵［6］．   1．2微生物酯酶的來源   在自然界中能產生酯酶的微生物資源是非常豐富的，從分類上看主要是真菌，真菌中主要是青霉、鏈孢霉、紅曲霉、黑曲霉、黃曲霉、根霉、毛霉、酵母菌、犁頭霉、須霉、白地霉和核盤菌等12屬23種；其次是細菌，在細菌中主要是芽孢桿菌屬、假單胞菌屬以及伯克霍爾德菌屬等；另外，放線菌中的個別種類也能產生一定量的酯酶．2產酯酶微生物的篩選及酶活力的測定一般篩選流程為：樣品→富集培養→平板分離→平板初篩（觀察透明圈）→搖瓶復篩（測酶活力大小），三油酸甘油酯是產酯酶微生物初篩加入培養基中的常用底物，因為初篩選用平板培養基，而在培養基中存在不互溶的油、水兩相，所以要對它們先進行乳化，乳化劑可選用聚乙烯醇或者吐溫．溴甲酚紫由于反應后pH變化顯色，而RhodamineB由于可以和分解后的物質結合形成顯色物質，它們被用作常用指示劑加入培養基內［7］．對于酯酶活力的測定，常見方法有以下幾種：酯酶活力比色法，即以對硝基苯酚為底物，分光光度計測定400nm處吸光度值［7］；酯酶活力滴定法，以NaOH滴定三醋酸甘油酯在酯酶作用下釋放的醋酸來測定；α－乙酸萘酯比色法，即先繪制α－萘酚標準曲線，然后在pH10的Tris－HCl緩沖液中，以α－乙酸萘酯為底物和粗酶液反應，在595nm處測其吸光度值［8］．   3微生物酯酶與基因克隆   隨著分子生物學和宏基因組學的發展，越來越多的研究人員從不同環境樣品中篩選產酯酶微生物，克隆酯酶基因，構建高產的基因工程菌為進行后續的工業化生產打下基礎．其中的環境樣品的主要來源是土壤以及海洋，特別是海洋環境樣品，因為海洋環境包括低溫、高溫、高靜水壓、強酸、強堿以及營養條件極為貧乏的各種極端環境，微生物要在這樣的環境中生存，生理結構、代謝方式等都會發生一系列改變，所以從海洋中篩選到的微生物可能具備某些特殊的代謝產物，另外低溫酯酶的研究也十分廣泛，近年來已純化或克隆表達了從南北極、深海、高山凍土中分離到的低溫微生物產生的低溫脂肪酶，如菌株PseudomonasfragiIFO3458（PFL），Pseudomonassp．KB700A，Pseudomonassp．B11－1，Aeromonassp．LPB4的脂肪酶［9－12］．鄭鴻飛等［13］從青島前海和膠州灣海區樣品中分離到1株產酯酶活力和穩定性較高的菌株EB21；邵鐵娟等［14］從2000多份渤海海區海泥樣品中分離出一株新型脂肪酶高產菌株BohaiSea－9145，經鑒定為適冷性海洋酵母（Yarrowialipolytica）；張金偉等［15］從南極普里茲灣深海沉積物中篩選到一株產低溫脂肪酶的菌株7195；林學政等［16］從南大洋普里茲灣的水樣中篩選到一株產低溫脂肪酶的深海嗜冷菌25101；JeonJH等［17］從南韓江華島潮汐平原沉淀物宏基因文庫中分離到一種耐鹽的酯酶基因亞型；一個新的酯酶基因estDL30從沖積土宏基因組文庫中被篩出，它由1524個核苷酸組成，編碼的蛋白質又507個氨基酸組成，這個酯酶蛋白屬于familyVII［18］；一個超表達的阿魏酸酯酶基因estF27從土壤宏基因組文庫中被篩出［19］．   4微生物酯酶的應用   4．1在食品加工方面的應用   酯酶主要通過酯交換［20］、水解［21，22］及合成化合物等方式應用于食品加工方面．固定化脂肪酶現在已用于芳香酯的合成，而低分子量芳香酯多呈天然水果味，它們廣泛應用于食品、飲料等食品工業，Melo等［23］研究用Rhizopussp．脂肪酶合成香茅醇芳香酯優化條件；利用酯酶使乳制品增香［24］，在釀酒和食用醋的生產中，利用酯酶提高乙酸乙酯、乳酸乙酯等酯類的含量，使口感有明顯提高；食用油脂精煉工藝中，借助微生物酯酶在一定條件下能催化脂肪酸與甘油之間的酯化反應，從而把油中的大量游離脂肪酸轉變成中性甘油酯，提高了食用油的價值；脂肪酶在面包專用粉中還有面團調理的功能，使面包質地柔軟，顏色更白；酯酶催化合成單甘脂［25］是使用量最大的食品乳化劑；阿魏酸是天然抗氧化劑，也是近年來國際認知的防癌物質，廣泛應用于食品原料中，目前已使用阿魏酸酯酶與其他酶協同從各種農作物副產品中提取阿魏酸［26］，并且阿魏酸作為合成天然香蘭素的前體，利用微生物方法產生香蘭素，具有毒性低、安全性高的特點，應用于食品中．#p#分頁標題#e#   4．2在精細化工中的應用   表面活性劑在化妝品、洗滌用品中有重要用途，傳統的化學生產具有選擇性差、需要高溫等缺點，酶法克服了這些缺點，酯酶催化糖酯等生物表面活性劑的合成，而糖酯是一種重要的生物表面活性劑；酯酶還有提高表面活性劑的釋放［27］的作用；在洗滌劑中添加堿性脂肪酶，可以提高去污力，降低三聚磷酸鈉等的用量，減少污染；酯酶的底物特異性及高度立體專一性可合成具有應用價值的精細化工產品，如化妝品的長鏈脂肪酸酯等．   4．3在手性化合物中的應用   由于酯酶酯化反應具有高底物專一性、區域選擇性、對映選擇性等優點，因此酯酶是有機合成中重要的生物催化劑，而且催化效率比化學試劑高出很多．手性化合物是指分子量、分子結構相同，但左右排列相反，如實體與鏡中的映體的化合物，而醫藥領域很多藥物都是手性化合物，而近年來酶拆分已經成為手性化合物拆分的研究熱點，酯酶又是酶拆分中研究最為廣泛的一種．WENS等［28］考察了實驗室自制的LipaseCAN、LipaseRH兩種酯酶對α一苯乙胺的拆分效果，并與幾種商品酶做了對照，結果表明Novozyme435這種商品酶的拆分效果最好．GodinhoLF等［29］用酯酶高效的對1，2－O異亞丙基甘油酯進行拆分，其中對映體過量值可達到72％～94％；研究人員改良不同介質中固定化脂肪酶拆分手性化合物，如任夢遠等［30］以自制的平均粒徑為4．5μm磁性高分子微球為載體，采用離子交換法固定化Candidarugosa脂肪酶，催化（±）－薄荷醇的酯化反應，所制備的固定化脂肪酶在離子液體［bmin］PF6中催化拆分（±）－薄荷醇的效果最佳，與游離酶相比固定化脂肪酶的立體選擇性有很大的提高，對映體過量值可達93％，對映體選擇值為35．Zheng等［31，32］利用純化后的重組后酯酶（Escherichiacoli．BL21）對薄荷醇進行轉酯化拆分，結果顯示，底物／酶質量比S／C≥50條件下，相對于丙烯酸、正丁酸酯化劑，乙酸酯化劑的效果最好（酯酶對乙酸薄荷酯的E＞100），且通過回收，固定化酶重復使用次數達4－5次．戴大章等［33］采用改性Ultrastable－Y分子篩固定化P．expansumPED－03脂肪酶（PEL），利用固定化PEL在微水相中對（R，S）－2－辛醇進行拆分，在以正己烷為溶劑，含水量為0．8％的體系中，于50℃反應24h的轉化率（c）可達到理論值的97．68％，對映體過量值（e．e．）可達到98．75％．對于手性藥物，是手性化合物中的研究熱點，研究人員利用酯酶對其進行拆分，如（R）－氟比洛芬［34］、酮基布洛芬［35］等，使對映體過量值得到提高，提高了藥物的有效值．   4．4在環境治理方面的應用   隨著農業生產中農藥的大量使用，農藥污染、殘留等問題也日趨嚴重，而農藥中菊酯類殺蟲劑廣泛應用于果蔬、果樹、花卉、林木等，由于其自然條件下難以快速降解，農藥殘留帶來潛在的食品安全和環境污染問題．研究表明，菊酯類殺蟲劑具有類固醇結合活性，可能影響人體激素正常水平［36］．研究人員對菊酯類殺蟲劑的降解進行了大量研究［37，38］，而利用微生物降解農藥是一條重要途徑，研究表明從環境樣品中篩選出的微生物對擬除蟲菊酯［39］，包括氯氰菊酯［40］、丙烯菊酯［41］等有高效降解作用，隨著分子生物學技術的發展，許多研究人員已經克隆到酯酶基因［42，43］，而利用基因克隆和酯酶的定向化技術，構建產酯酶的高效基因工程菌也已經成為環境保護的一個發展趨勢．   5展望   近年來，隨著宏基因組文庫、基因工程、定向進化技術、固定化技術的發展，以及界面酶促過程等技術的深入開展，微生物酯酶的研究已經進行到分子層面，高效產酯酶菌株的篩選、誘變育種、基因克隆及其定向進化構建高效基因工程菌的研究取得了長足發展，隨著人們生活水平的提高，食品、醫藥、化妝品等中的添加天然成分將受到廣泛關注，特別是天然底物的生物合成和手性化合物的酶拆分，因此，微生物酯酶在食品、醫藥、精細化工等領域具有廣泛的應用前景．由于微生物酯酶廣泛的應用前景，本實驗室最近從紅樹林土壤樣品中通過宏基因組文庫的方法篩選到一新型低溫耐堿酯酶基因，已經提交到Genbank，其登錄號碼為（JQ701700）．實驗室成員正在進行深入研究，酯酶的工業化生產及其在各領域的應用將會逐步實現．

傳統的功能微生物鑒定方法是在含有特定碳源培養基上對目標微生物進行富集、分離與純化，由于實驗室可培養的微生物只占微生物總數的0.1~1%[1]，因此以純培養技術為代表的鑒定方法存在很大局限性。20世紀后半葉，以分子生物學為特色的現代土壤微生物研究方法取得突破性進展，包括以磷脂脂肪酸（PLFA）技術為代表的生物化學方法，以BIOLOG技術為代表的生理學方法和基于DNA多態性的微生物群落結構和功能多樣性的分子生態學技術，如變性梯度凝膠電泳（DGGE）、限制性片段長度多態性（RFLP）、末端限制性酶切片段長度多態性分析（T-RFLP）和實時熒光定量PCR技術（RT-PCR）等。上述技術提高了人們對土壤微生物群落結構組成的認識，但仍難提供有關微生物間相互作用及代謝功能微生物的直接信息[1-2]。例如，DGGE和T-RFLP等分子指紋圖譜方法只能檢測環境樣品中的優勢微生物群落，但具有特定生態和環境功能的微生物通常在數量上并不占優勢[3]。因此，功能微生物很難被這些分子指紋圖譜方法所鑒別[2]。據估算，每克土壤含有約100億個微生物個體，包括100萬種不同的微生物種群。利用上述技術，從這些難以計數的土壤微生物中原位鑒別特定生態過程的微生物驅動者是難以想象的[4]。近年來得到廣泛關注的穩定性同位素探針技術與現代分子生物學相結合，可以在相對未受干擾的環境樣品中培養功能微生物，利用穩定性同位素示蹤復雜環境中的功能微生物核酸（DNA/RNA）或PLFA[5]，在分子水平鑒定生態系統重要過程的微生物驅動者。其基本原理是在土壤中添加含有穩定性同位素標記的代謝底物，土壤中利用該標記底物的微生物細胞在其生長繁殖過程中同化合成含標記元素的生物標志物。通過對生物標志物進行提取、分離、鑒定和比對分析，鑒別土壤中驅動特定生態過程的功能微生物。該方法可以準確獲得功能微生物的目的基因，避免了從浩瀚基因庫里一個個篩選目的基因的煩勞工作，已成為原位鑒定功能微生物的重要手段。   1土壤功能微生物SIP鑒定技術流程   SIP技術是耦合微生物遺傳多樣性與代謝多樣性最有力的工具之一，該技術以復雜的原位或微宇宙土壤樣品為研究對象，采用穩定性同位素原位標記土壤樣品中特定微生物的DNA、RNA或PLFA。目前絕大多數研究采用13C標記底物培養土壤，利用13C-底物的微生物細胞不斷分裂、生長、繁殖，合成含13C標記的DNA或RNA等生物標志物。提取土壤樣品中13C-核酸和12C-核酸總混合物，用超高速離心技術將13C-核酸與12C-核酸分離，利用分子生物學手段對生物標志物進行分析，以鑒別土壤功能微生物。近年來，以15N和18O為基礎的SIP技術也被成功應用于微生物驅動的土壤生態過程研究[6]。   1.1土壤SIP技術前處理方法選擇   SIP技術前處理包括標記底物的培養和特定微生物核酸或磷脂脂肪酸提取兩個步驟。培養方式主要包括添加營養液富集培養和僅添加標記底物培養等方式。添加營養液富集培養法可以為微生物生長提供相對穩定的環境，并促進微生物的生長，以獲得足夠的核酸或磷脂脂肪酸提取量[7]。土壤DNA/RNA的提取方法主要包括試劑盒提取法和液氮研磨法等。試劑盒法操作簡單，提取純度高，但提取量較低，費用高。液氮研磨法可以較好保證DNA/RNA的完整性，提取量相對較高，且操作費用低，時間短，但需純化后才能滿足RT-PCR等后續分子生物學要求[8]。土壤PLFAs提取方法主要為兩種：一種是PLFAs法，即先通過氯仿-甲醇單相萃取浸提土壤微生物脂肪酸，再經硅膠柱純化以及酯化作用得到活體細胞膜結合態FAME，提取的脂肪酸種類僅有El-脂肪酸，多為細菌所特有。另一種是TSFAMEs法，即通過堿甲醇分解法提取總土壤FAMEs。提取的脂肪酸種類包括酯連接和非酯連接PLFAs，多為真菌所特有[9]。   1.2土壤SIP技術中生物標志物的選擇   土壤SIP技術中特定微生物的生物標志物為PLFA、DNA和RNA3種。PLFA-SIP法是將PLFA從重穩定性同位素（如13C）標記過的環境樣品中提取出來，通過PLFA圖譜分析微生物群落的結構和多樣性，再通過氣相色譜-燃燒-同位素比率質譜聯用法測定各種PLFA中13C的豐度[7]。PLFA-SIP的標記底物濃度要求較低，靈敏度較高，但存在一些缺點：（1）對于未知PLFA分子圖式的不可培養微生物，或者土壤中的某種特殊脂肪酸無法與特定種類的微生物相對應，該方法就無法鑒定功能微生物。（2）該方法在很大程度上依賴于標記脂肪酸來確定土壤微生物群落結構，標記上的變動將導致群落估算上的偏差。（3）細菌和真菌生長條件的改變或環境脅迫都能導致脂肪酸類型的改變[9]。同PLFA-SIP法相比，DNA-或RNA-SIP可獲得更直接的功能微生物遺傳信息。DNA-SIP的優點是：標記的13C-DNA一定來自新產生的子代微生物細胞，是證明微生物原位生長并驅動生態過程的最直接證據。另外，DNA完美的雙鏈結構保證了遺傳物質的穩定[10]。DNA-SIP的缺點是：自然環境中能被微生物利用的底物濃度通常很低，微生物大量分裂繁殖的可能性低，常需使用較高濃度的標記底物來刺激目標微生物的分裂繁殖，可能導致研究結果與原位自然環境的實際情況不相吻合[6,11]。RNA-SIP在一定程度上能克服上述缺點。自然環境中特定功能微生物發揮作用的同時，即使沒有大量增殖生長，但具功能基因得到表達并在核糖體內合成蛋白質，獲得標記的13C-RNA則表明微生物可能具有較強的活性。因此，RNA-SIP能夠采用更低的標記底物濃度培養環境樣品，研究結果更接近原位狀況[12]。但因mRNA半衰期短、降解速度快，mRNA-SIP的實際應用仍存在較大的技術難度[13]。DNA-SIP和RNA-SIP的結合將會大大提升SIP技術的潛力。   1.3土壤SIP分離后的分析方法   13C-核酸與12C-核酸分離后，可以利用分子生物學手段對功能微生物的DNA/RNA進行分析，以鑒別土壤中重要生態過程的微生物驅動者。目前的主要分析方法包括分子指紋圖譜法、實時定量PCR法和454高通量測序法等。（1）分子指紋圖譜法是目前進行功能微生物的DNA/RNA分析的廣泛使用的快捷方法，但分子指紋圖譜分析方法的靈敏度較低。環境樣品中微生物通常數以百萬計，采用古菌或細菌通用引物的DGGE和T-RFLP只能檢測環境樣品中數量上占優勢的微生物[14]。具有較為重要的生態和環境功能目標微生物通常在數量上不占優勢。因此，目標微生物同化利用13C-底物后發生的微小變化很難被分子指紋圖譜法所鑒別。（2）實時定量PCR法直接針對目標微生物的功能基因，采用高度靈敏的實時定量PCR測定不同密度層級中目標微生物的數量，顯著提高了SIP技術的可靠性。然而，采用特異引物定量研究目標微生物存在一定難度。土壤中數量眾多的微生物基因組DNA可能被13C標記，很難采用單一的功能基因或16SrRNA基因特異引物，同時研究眾多目標微生物在不同密度層級中的分布規律。我們無從得知哪一種微生物可能利用穩定性同位素標記底物，無法設計特異的功能引物，只能通過選擇性定量目標微生物，明確目標微生物在不同密度層級中的分布規律，同時判定SIP技術的可靠性[13，15]。（3）454高通量測序法是通過檢測各浮力密度層中微生物16SrRNA基因組成，分析目標標記微生物占該層總微生物的比例，從而鑒別前所未知的重要功能微生物。該技術可規避PCR擴增，直接對標記13C-RNA測序，每次分析可獲得大約100萬16SrRNA基因序列，顯著增強了重浮力密度層中13C-標記微生物DNA序列的檢測靈敏度。高通量測序可全面分析微生物群體的物種、基因功能組成，最大程度地認識未培養微生物的遺傳組成和生命活動，是目前最準確的方法[16]。但該方法目前測試費用較高，后續數據處理復雜，但隨著技術發展必將成為功能基因組學研究的主流技術。#p#分頁標題#e#   1.4構建克隆文庫   超高速密度梯度離心分離并鑒別13C-DNA/RNA后，通常采用建立基因克隆文庫，構建遺傳系統發育樹的方法分析13C-RNA和12C-RNA的微生物群落組成，并比較二者的差別，鑒定被13C底物所標記的微生物群落。   2SIP技術在土壤功能微生物鑒定中的應用   目前SIP技術在土壤分子生態學研究領域主要應用在原位鑒定介導有機污染物生物降解和碳氮循環過程的功能微生物方面。有機污染物生物降解研究多集中于單環芳烴、PAHs和PCBs的研究，碳氮循環研究多集中于植物-微生物相互作用對陸地生態系統中碳氮轉化、土壤中碳氮周轉速率、稻田產甲烷機理及產甲烷菌的研究。   2.1SIP技術在土壤有機污染物生物降解研究中應用   在有機污染物生物降解的微生物生態學研究中，SIP技術可以幫助了解在復雜原位土壤環境中，參與各個降解過程和途徑中功能微生物種類。Hanson等首次使用PLFA-SIP技術研究甲苯的生物降解，總共提取發現的59種PLFAs中有16種出現13C標記[17]。Christopher等在對農田土壤中苯酚降解菌的研究中，對13C標記苯酚的DNA進行18S-28S內轉錄間隔區的PCR擴增，T-RFLP分析，成功分離出一種白色細狀的真菌，并證實該真菌能加速苯酚的降解[18]。Sueoka等[19]利用RNA-SIP技術對13C標記苯酚的RNA反轉錄PCR和T-RFLP分析，新發現了3種苯酚降解菌。羅春玲、Xie等[20-22]利用DNA-SIP技術研究了甲苯、苯和間二甲苯的降解菌，對分離出的13C-DNA進行T-RFLP分析、克隆文庫的構建，獲得了相應的降解菌，并首次報道了TM7門對甲苯具有降解作用。Woods等使用H218O-DNA-SIP技術鑒定甲苯退化細菌，鑒定出一株已知的甲苯降解菌RHA1[23]。Padmanabhan等在Collamer地區的田間試驗中，向受試的粉砂壤土供應13C標記的葡萄糖、咖啡因、萘和苯酚，通過GC/MS監控土壤中釋放的13CO2濃度，以此估測底物降解速率，并將分離得到13C-DNA用通用引物對16SrRNA基因進行PCR擴增，最終得到29個完整的DNA序列[24]。Maiysha等利用DNA-SIP技術，研究了土壤中具有降解萘、菲和芘等6種多環芳烴功能的微生物群落，將13C作為標記元素，構建13C-DNA的16SrRNA克隆文庫和RT-PCR分析，結果表明不可培養菌PG2不僅可以降解芘，還能降解熒蒽和苯并[A]蒽，從而說明PG2菌對四環PAHs有著良好的降解效果[6]。Tillmann等設計了一個PLFA-SIP微宇宙實驗，將PCBs高度污染土壤暴露于13C-2,-2′-二氯聯苯中，采用GC-C-IRMS測定不同PLFA13C的豐度，結果表明非優勢菌在PCBs好氧降解過程中的主導作用[25]。Shahid等在對五氯酚降解菌的研究中，比較了DNA/RNA-DGGE和DNA/RNA-SIP-DGGE技術的鑒定效果，結果表明RNA-SIP技術可以更好反映功能微生物群落的變化趨勢[11]。Sul等將DNA-SIP和宏基因組技術結合，對13C-聯苯-DNA中芳烴雙加氧酶基因片段PCR擴增，得到兩串與bphA相似的序列組，構建1568粘粒克隆文庫，發現除含bphAE基因外，還含有屬于γ-變形菌綱的未知基因片段，該片段的G+C含量和bphAE相近，可能由于bphAE基因水平轉移而形成的[26]。   2.2SIP技術在土壤C循環中的應用   土壤C轉化是微生物主導的生物地球化學過程，SIP技術能夠很好地將微生物群落與其功能聯系起來，加深人們對陸地生態系統重要C循環過程的認識。Boschker等最先使用PLFA-SIP技術進行甲烷營養菌的研究[7]，隨后，DNA-SIP技術被用于研究土壤中甲烷氧化菌的活性功能種群。Hutchens等在微宇宙中用13CH4對取自羅馬尼亞MovileCave地下水系統的樣品進行短期培養，以DNA-SIP技術為前提確定了3類含有編碼甲烷單氧化酶基因的甲烷營養菌，并通過與非甲烷營養菌比對證明了交叉取食的存在[27]。Cebron等在研究養分添加對甲烷營養菌多樣性的影響時，人工添加養分在一定程度上可避免交叉取食，改進了DNA-SIP方法[28]。Bengtson等研究了松樹林土壤中的甲烷營養菌群落結構組成與CH4氧化率的聯系，并簡短討論了DNA/RNA-SIP的局限性[29]。Borodina等用DNA-SIP法考查了英國不同陸地生態系統土壤中氯化甲烷營養菌的多樣性，通過與培養分離法的結果比較，揭示出土壤中仍存在大量不可培養的鹵化甲烷營養菌，并將鹵化甲烷的全球循環同一組目前已知的鹵化甲烷營養菌特征群聯系了起來[30]。Radajewski等最先使用DNA-SIP技術進行甲醇營養菌的研究，通過13CH3OH培養森林土壤，證明被13C標記的細菌16SrRNA基因序列與已知可培養的甲醇營養菌及嗜酸甲烷氧化菌相似，首次表明此類細菌還存在于森林土壤中[6]。Feng等利用DNA-SIP技術證明了稻田土壤中，甲酸鹽中的C首先被光營養的初級和次級生產者利用，隨后產生的有機物被其他微生物利用[31]。陸雅海等用13CO2對水稻進行脈沖標記培養，利用RNA-SIP技術與T-RFLP分析，獲得水稻根際的產甲烷菌，并通過厭氧和好氧條件的對比，表明根際環境和降解過程的多相性[32，13]。該團隊還利用PLFA-SIP描述了水稻根際微生物活性的空間變化，提出在根際革蘭氏陰性菌和真核微生物在同化根派生碳過程中最活躍，同時描述了圍繞根際的活性群落的空間系統變化[9]。   2.3SIP技術在土壤N循環中的應用   15N作為生物體內大分子合成的組成元素，可結合SIP技術研究土壤中氮循環過程的各類微生物功能群及其相互作用。Georg等利用標記和未標記的N進行純微生物培養，結果顯示15N-DNA-SIP技術是可行的，但存在一定局限性，如可視條帶需要大量的DNA，15N-DNA的理想豐度要求大于50%等[33]。Buckley等通過改變基因G+C含量來增加15N-DNA的浮密度，增加了15N-DNA的分離強度，為原位追蹤利用N的微生物群落提供了新的研究方法，并采用15N2-DNA-SIP原位鑒定了獨立生存的固氮微生物，通過分析15N標記DNA的16SrRNA，發現了3組新固氮微生物[34-35]。賈仲君等采用SIP技術示蹤農田土壤氨氧化微生物DNA，發現相對于古菌，細菌是土壤硝化過程的主要驅動者[36]。賀紀正等對農田土壤生態系統中氨氧化古菌（AOA）和氨氧化細菌（AOB）進行一系列研究，得出二者在根際土壤中的豐度、組成對環境的響應占主導作用[37]，并發現土壤中硝化作用伴隨著古菌amoA的基因豐度和多樣性變化，進一步證明了氨氧化古菌可同化CO2，屬于自養型微生物[38]。Jennifer等結合RNA-SIP和DNA-SIP技術，再次證明AOA可通過兩種途徑固定CO2，并在泉古菌（Crenarchaeota）中得到驗證，進而強調了AOA在硝化和CO2固定過程中的重要性[39]。Karen等以北美黃松林為研究對象，應用H218O-SIP技術調查土壤中氨氧化微生物的生長與死亡情況，發現人工添加氨可刺激AOB的生長，與此同時AOA的死亡數量增加，而AOB則不受影響[40]。Ishii等在研究N2O在水稻土中的消減過程時，用13C標記的琥珀酸鹽作為電子供體，鑒定了同化琥珀酸鹽的微生物，指出大多數N2O消減微生物屬于草螺菌屬和固氮螺菌屬。并證明前者消減速度大于后者，在水稻土N2O的減少過程中發揮重要作用[41]。#p#分頁標題#e#   3研究展望   SIP技術能有效降低環境微生物群落分析的復雜度，獲得功能微生物的目的基因，已成為原位分離功能微生物的重要手段。隨著新一代454高通量測序技術的發展，SIP技術可最大程度地認識不可培養微生物的遺傳組成和生命活動，獲取其功能基因，優化并人工合成在原位環境中具有高效同化或降解作用的新基因。結合土壤化學等方面知識，共同探討土壤環境中功能微生物的代謝途徑和同化過程，挖掘微生物基因資源，鑒別土壤關鍵元素循環的微生物驅動機制等，將是未來研究發展的熱點和重點。

20世紀70年代后期，科學家在東太平洋洋隆（EPR）和加拉帕戈斯擴張中心發現了一種低溫熱液從玄武質基巖的裂隙中彌散溢出，在這些彌散流的溢出點周圍發育著大量的與硫氧化菌共生的管狀蠕蟲和雙殼貝類熱液生物群落［1］。此后的幾十年來，大量的現代海底熱液活動相繼被報道，而在這些海底熱液場中，大范圍的低溫彌散流區域總是同時伴隨著高溫集中流出現［2－4］。這些熱液環境中發育的生態群落與地球上其它以光合作用為基礎的生態群落有所不同，它們是以化能合成的自養微生物為基礎。這些微生物通過氧化熱液流體中的還原性物質（CH4，H2，H2S，Fe2＋和Mn2＋等），從而獲取新陳代謝的能量［5－7］。研究者采用比較測量等手段對熱液場進行詳盡地分析后發現，低溫彌散流的化學通量比高溫集中流大［8］，熱通量也是高溫集中流的幾倍以上［9－10］。因此，低溫熱液對于依靠流體中的化學物質生長與繁衍的熱液生態群落具有更重要的意義。然而相對高溫熱液噴口大量的微生物學研究，人們對低溫熱液彌散流的關注程度仍非常低［11－12］。近年來，隨著對熱液系統的研究深入，人們逐漸認識到低溫熱液對海洋熱通量和化學通量的貢獻，以及對生命起源和深部生物圈探索的意義，對低溫熱液彌散流的微生物研究也重視起來［13－17］。本研究綜述了近年來低溫熱液彌散流區域微生物生態的研究進展，以及這些研究對深部生物圈探索的啟示。   1　海底低溫熱液彌散流的形成機制與化學組成   研究低溫彌散流的形成機制與熱液地球化學環境參數的變化，對于理解低溫彌散流區域微生物多樣性與變化具有重要意義。研究者結合目前已經發現的低溫熱液彌散流熱液場的數據，提出了低溫熱液流體的3種形成機制：1）高溫熱液相分離的流體與洋殼中海水相互混合而被稀釋［11－12］；2）高溫熱液流體在淺層地殼中的傳導性冷卻；3）高溫流體、海水和被改造的海水的3組分相混合［18］。這3種機制中由第一種占據主導地位，共同控制現代海底熱液彌散流的形成［19］。海底低溫熱液彌散流體的化學組成復雜，通常富含CO2，CH4，H2，H2S和Si在一些樣品中也富含Fe2＋，Mn2＋［4，20－24］（表1）。它們的組成在時間和空間上是高度變化的［5，17，25－27］，即使在同一個熱液區域，如東北太平洋形成的低溫熱液流體，其熱液化學成分的變化也很大（表1）。這種多變性是由熱液終端端元流體的時空變化所控制，并受到深海底部的熱液流體稀釋強度的影響［2，5，25，28］；另外，海底深部傳導性熱交換、沉淀過程、火山活動、潮汐作用以及微生物改造等也是影響化學成分多變性的重要因素［17］。總之，低溫熱液流體中化學組分多變，富含豐富的還原性物質，正是這些還原性物質所引起的氧化還原放能反應為海底熱液生態系統的繁衍提供了充足的物質基礎。   2　海底低溫熱液彌散流區微生物生態的研究進展   目前，對現代海底低溫熱液彌散流區微生物學的研究手段主要為傳統的富集分離培養和非培養技術［30］；特別是基于16SrRNA基因和特征性功能基因的系統發育分析等現代分子生物學技術的發展，加快了對現代熱液系統微生物研究的步伐。目前在大多數已發現的低溫熱液區域都有關于熱液微生物的研究報道，包括胡安•德福卡洋脊［13，15，31］，大西洋中脊［24］，有機質豐富的Guaymas盆地［32］，沖繩海槽［33］，馬里亞納擴展盆地［34］和深海海山［22，35］等。研究結果表明，在這些低溫彌散流熱液場內的微生物具有一些共同的生態學特征：微生物生物量大、種類豐富、覆蓋廣。其中已發現的微生物種類包括α，β，γ，ε，ζ和δ變形桿菌，酸桿菌門（Acidobacteria）、產水菌目（Aquificales）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、壁厚菌門（Firmicutes）、浮霉狀菌（Planctomycetes）、各種Candidate　Divisions細菌、嗜熱球菌（Thermococcus）、甲烷球菌（Methanococcus）和其他一些嗜熱和超嗜熱古菌等［15，31－32，34，36－39］。在這些豐富的微生物類型中，化能合成自養微生物是海底熱液系統中生命新陳代謝的初級能量制造者，它們的存在是熱液生物群落繁衍的基礎。這些化能合成反應包括了硫氧化、鐵氧化、氫氧化、甲烷氧化和硫酸鹽還原等，其中硫氧化與鐵氧化反應最為重要，與之相關的微生物在低溫熱液場中的發現也最為頻繁（表2）。   2．1　硫氧化微生物   與硫氧化相關的新陳代謝反應是低溫熱液環境中微生物獲取能量的重要途徑。與周圍背景環境相比，低溫熱液彌散流中H2S的濃度相對周圍海水呈數量級倍數增加［22］，這些含硫化合物的存在為化能合成自養微生物提供了新陳代謝反應所需的電子供體［42］。目前在低溫熱液系統中發現的硫氧化微生物主要屬于ε、γ和α變形桿菌。ε變形桿菌的生理機能多樣，能在高溫條件下以硫元素的化學反應進行自養或異養活動［43］，其中的一些類群是典型的從硫或硫代硫酸鹽氧化反應過程中獲取能量的微生物，如Sulfurovum　lithotrophica，Sulfu－rimonas，Thiovulumspp．和弓形桿菌Arcobacter　spp．等。ε變形桿菌在熱液環境中廣泛存在，包括流體、微生物菌席或與熱液大型生物共生［36，44－47］。Opatkiewicz等［43］在胡安•德福卡洋脊Axial海山上的低溫熱液場中就發現了豐富的ε變形桿菌，并指出它們的分布與流體中氫、硫和鐵等元素的濃度有關。Rassa等［35］在夏威夷Loihi海山上的低溫熱液場中不同溫度梯度的彌散流處放置了41個原位生長微腔體（microbialgrowth　chambers）。經過短期（4～10d）和長期（1～6a）的觀測，發現在中間溫度（51℃）的彌散流處ε變形桿菌是微生物群落的主要組成之一，而在溫度較高處（71℃）其占據更主導的地位。此外，Perner等［24］在大西洋中脊最南部（9°S）的Lilliput低溫熱液場中也發現了大量的ε變形桿菌，有長桿、絲縷、短桿和球狀等多樣形態結構。除了ε變形桿菌外，γ變形桿菌中的Thiomicrospira　spp．也是熱液環境中常見的硫氧化菌。如在Lilli－put低溫熱液場，γ變形桿菌中的Thiomicrospira　spp．與ε變形桿菌一樣占據優勢地位［24］。Podgorsek等［40］在斐濟盆地北部的富H2S的低溫彌散流熱液場中也分離獲得大量α和γ變形桿菌中的自養或兼養硫氧化細菌。#p#分頁標題#e#   2．2　鐵氧化微生物   鐵既可以作為化能自養的電子供體也可以作為厭氧呼吸的電子受體［48］。低溫熱液彌散流體中富含的還原性鐵為鐵氧化的自養微生物提供了豐富的能量，因此在富鐵的海底熱液低溫彌散流區域內發現了鐵氧化菌的廣泛分布。目前在熱液場中已經發現的鐵氧化微生物包括α、β和γ變形桿菌，如赭色纖毛菌Lepto－thrix　ochracea，含鐵嘉氏鐵柄桿菌Galliionella　ferruginea，Gallionella　capsiferriformans，Sideroxydanslithotrophicus等［49－51］，以及最近發現的ζ變形桿菌［52］。Mariprofundus　ferrooxydans是從Loihi海山上富鐵菌席中分離獲得（圖1a），它是1種嗜中性的化能自養鐵氧化菌，以二氧化碳為碳源，能從二價鐵轉變成三價鐵的氧化反應中獲取新陳代謝的能量［52－53］。通過對純培養微生物M．ferrooxydans的分類鑒定結果進行評估，人們將其劃歸為變形桿菌門下一個新的亞類－ζ變形桿菌。ζ變形桿菌在低溫熱液流體及其沉積物中的發現具有重要意義。因為從20世紀80年代開始，在現代和古代的熱液礦物中發現了大量的莖狀鐵氧化物［54］，當時科學家從形態學上推測這是1種生物成因的鐵氧化物，但卻缺乏有力的生物學證據。而最近的研究發現，M．ferrooxydans在生長過程中能夠產生結構相似的鐵氧化物（圖1b）［53］，當其死亡后鐵氧化物并能在其表面保存下來（圖1c）［53，55］。因而，ζ變形桿菌的發現為莖狀鐵氧化物的生物成因推論提供了有力的支持。人們最初認為ζ變形桿菌在自然界中的分布比較少，而隨著進一步調查后發現它們其實廣泛分布于一些富鐵的低溫熱液場中。例如，在Tonga　Arc海山上發現了一些富鐵低溫彌散流（30～70℃，Volcano　1），其流體形成的主要礦物是二峰水鐵礦（two－line　ferrihydrite）。透射電鏡顯示，這些鐵氧化物的形態與M．ferrooxydans形成的構型非常一致［56］，隨后的分子生物學的研究結果也證實了在Volcano　1處分布了大量的ζ變形桿菌［41］。此外，Davis等［23］在胡安•德福卡洋脊Cleft段低溫彌散流場中所采集的沉積物柱也發現大量的ζ變形桿菌。而在馬里亞納盆地的低溫熱液彌散流區的微生物菌席中，熒光定量PCR的結果表明，它們更是占到了原核細胞總數的22％［34］。關于低溫彌散流中發現ζ變形桿菌的報道還有很多，如馬尼亞納島弧中的Eifuku海山和夏威夷Loihi海山［35］等。雖然對ζ變形桿菌發現的報道越來越多，然而目前對它們的研究尚屬起步階段，上述研究也表明，M．ferrooxydans只是ζ變形桿菌中一個較小的分支，僅憑一株可培養的M．ferrooxydans還不能將ζ變形桿菌的所有功能研究清楚。因此，還需要開展大量的ζ變形桿菌的適應性培養工作，深入探索它們的生理化學特征。   2．3　氫氧化微生物   在超基性基巖上發育的海底低溫熱液彌散流體中通常富含H2，H2在氧化過程中能釋放大量的能量，這就為以H2的氧化反應獲取能量的微生物提供了存在的基礎。微生物消耗或產生氫氣是由氫化酶所催化，氫化酶包括3種，分別為［NiFe］－氫化酶、［FeFe］－氫化酶和［Fe］－氫化酶，它們之間并沒有分子進化上的聯系［29，57］。Perner等［29］對大西洋中脊不同基底上發育的低溫熱液場進行了對比，研究對象包括ComfortlessCove熱液場中的Clueless低溫彌散流噴口（玄武質基底）和Logatchev熱液場中的Quest彌散流噴口（超基性巖基底）。結果表明，以玄武質為基底的Clueless低溫熱液流體中H2濃度很低，且氫化酶基因僅有2種；而以超基性巖為基底的Quest低溫熱液流體中H2濃度非常高，相應的氫化酶基因也非常豐富。這一研究結果同時表明在海底低溫熱液場中影響氫氧化微生物分布的重要因素是水體中H2和O2的濃度的大小［29］。目前在低溫熱液區域發現的氫氧化微生物有產水菌目（Aquificales），Dehalococcoidales，Desulfurococcale和ε變形桿菌中的一些下屬菌種微生物，以及利用H2和CO2產甲烷的甲烷球菌目Methanococcales等［29，58－60］。   2．4　其他新陳代謝途徑的微生物   除硫氧化、鐵氧化和氫氧化等化能自養微生物的頻繁出現外，在低溫熱液噴口微生物系統中，甲烷氧化菌、產甲烷古菌、氨氧化古菌和硫酸鹽還原菌也是不可忽略的組成部分，它們通過自養或異氧方式進行生命活動。前人利用甲烷氧化（pmoA）、氨氧化（amoA）和硫酸鹽還原（dsrAB）等功能基因已經對這些微生物在熱液環境中的分布進行了研究。Nercessian等［61］對東太平洋洋隆13°N和大西洋中脊Rainbow熱液場的低溫流體、沉積物進行了分析，通過功能基因發現了大量的甲烷氧化、產甲烷與硫酸鹽還原微生物的存在，包括超嗜熱的Methanopyrales和甲烷暖球菌科（Methanocaldococcaceae）、嗜熱和喜溫的甲烷球菌科（Methano－coccaceae），嗜熱的甲基熱菌屬（Methylothermus）和喜溫的I型甲烷氧化菌，和超嗜熱的古烷菌目（Archaeo－globales）、嗜熱的熱脫硫桿菌目（Thermodesulfobacteriales）和喜溫的脫硫葉菌科（Desulfobulbaceae）。   3　海底低溫熱液彌散流體所揭示的深部生物圈   低溫熱液流體研究的一個重要意義在于其環境是研究地球深部生物圈的窗口［62］。Gold［63］認為嗜熱與超嗜熱微生物占據了地殼的部分區域，其生物量很可能超過地表生物的總和。因為海底上部500m以內的洋殼中孔隙度較高，熱液流體與海水在其中能夠輕易運移而循環，這種循環能引起化學梯度的變化，其為一些極端微生物在洋殼深部中的生存提供了良好的物質基礎和環境。在紐芬蘭島邊緣的ODP210鉆探結果顯示微生物存在的深度甚至可以延伸至1　600多m［64］。由于樣品采集的限制，直接導致對洋殼內部的研究非常困難，所以，通過低溫熱液流體的研究來探測洋殼深部生物圈就顯得彌足珍貴［13，15，31］。通過對流體中地球化學參數的分析，可以有效地了解微生物在深部生物圈中的生物地球化學作用，如O2，S2－，NO－3，SO2－4和H2的消耗，NH＋4和CH4的產生都是微生物在熱液流體中作用的標志［16－17，25，65－66］。例如，在東太平洋9°50′N和Suiyo海山的熱液場中，通過對低溫熱液流體與高溫熱液流體中的甲烷與二氧化碳同位素的分餾證明了深海底部存在著產甲烷與甲烷消耗的微生物活動的存在［19，27］。通過培養和非培養手段對低溫熱液流體中微生物進行研究，能更直接反映深部微生物的分布狀態和新陳代謝方式。例如，Holden等［13］在胡安•德福卡洋脊CoAxial低溫熱彌散流體（15～30℃）中分離出了一些最佳生長溫度為55～60℃的嗜熱和超嗜熱微生物；在排除了這些微生物來自周圍高溫流體的微生物污染這個可能后，研究人員指出它們應當來源于環境溫度更適合其生存的洋殼深部。另外，Kato等［67］研究了馬里亞納南部熱液場中采用鉆孔所取得的低溫洋殼流體（2～69℃），表明在這些流體中存在大量的細菌和古菌，其中Thiomicrospira和ζ變形桿菌占優勢地位，ζ變形桿菌的細胞數量占原核細胞總數的32％。這些對低溫熱液流體的研究結果證明了洋殼深部生物圈的存在，其新陳代謝的能量主要來源于甲烷、鐵的氧化和硫的氧化與還原。#p#分頁標題#e#   Huber等［15］通過對東北太平洋Axial海山的低溫熱液場（Marker33）中流體微生物多樣性的長期跟蹤，基于前人對該區域地質和化學的報道，提出了洋殼深部生物圈的微生物種群與熱液化學過程的理想模式（圖2）［15］。根據熱液與海水兩端元的混合模式，將洋殼上部深部生物圈內劃分成3個層位：1）上層，以海水為主，混入了少量的熱液。海水為這一層中的微生物提供了足夠的碳源、能量和電子受體，其優勢群體為喜溫的硫、鐵或甲烷的氧化者，如ε，ζ，β和γ變形桿菌等；2）最下面的深部層為厭氧、溫度高于50℃的環境，以熱液流體為主，并混入少量的海水。這個區域為一些喜溫嗜熱的硫還原菌和利用熱成因有機質的嗜熱古菌提供了適合的生存環境，如脫硫桿菌屬（Desulfurobacterium）和熱球菌目（Thermococcales）［13，22，64］；3）中間層是化學梯度變化最大的氧化還原層，熱液流體和海水在此能夠充分混合，提供了從無氧到有氧，中溫到高溫的各種微環境。該層中主要發育一些厭氧嗜溫的產甲烷生物，如甲烷球菌目（Methanococcales）或一些新發現的細菌，如Candidate　Division　ABY1和WS6以及一些需氧或微需氧的硫、鐵與甲烷氧化細菌，如ε和γ變形桿菌［15］。   4　結　語   海底熱液系統是現代海洋科學研究的熱點，近年來，該系統中的低溫熱液彌散流受到越來越多的關注。通過對低溫彌散流區域微生物學的研究，我們逐步了解低溫彌散流區域的微生物生態學特征及化能合成自養微生物，尤其是鐵氧化和硫氧化相關的化能自養微生物在低溫熱液區域的分布規律，充分認識到這些自養微生物在熱液生態系統中的支柱作用，并肯定了地球化學因素對微生物生態分布的制約。對低溫熱液流體中的微生物研究，也為我們得以窺探深部生物圈，進一步揭示地殼深部微生物的新陳代謝機理，從而了解其生命演化與發展奠定了基礎。   然而，目前國內外在這方面所開展的研究工作還有一定的局限性，包括樣品的采集、原位地球化學參數的分析以及生物學手段自身的缺陷，都會對當前的研究結果造成影響。其局限性主要表現為：首先，由于DNA在常溫條件下容易降解，這就為樣品的保存和及時分析提出了嚴格的要求。但受到船載實驗設備的限制，樣品在船上不能立即展開分析，只能采取室內分析，而且從采集、存儲、運輸和室內分析這一過程往往需要花費較長的時間，這就在一定程度上導致了樣品中微生物量的失真和群落結構的細微變化。其次，原位流體化學數據缺失嚴重。原位流體化學數據能夠有效反映原位沉積環境的信息，但是目前的采樣手段主要是電視抓斗和海底拖網，這些采樣設備在起樣的過程中會導致背景海水與原位流體大量的混合，從而造成原位流體數據失真。因此，這就需要科學與技術的完美結合，進一步完善海底熱液研究的技術手段，如我國正大力發展的載人深潛器和海底觀測網的建設。這些技術手段的實現將對海底低溫熱液場原位數據的準確測量和連續觀測提供有力的保障。另外，基因芯片的應用可以全面而翔實地獲取原位環境中微生物新陳代謝途徑的信息，而針對低溫熱液，目前世界上還未展開類似的工作。這些新的采樣、測量和分析技術的運用，將進一步揭示低溫熱液區微生物與地球化學的相互耦合、生物礦化機制、微生物對洋殼的改造、深部生物圈的演化以及生命起源等重大科學問題的答案。

【摘要】為了確保我國國民的身體健康，必須要對所有市場上的食品進行微生物檢測。現階段我國常用的針對食品進行微生物檢測的技術種類相對較多，而在針對不同食品進行檢測的過程中必須要合理地選擇檢測技術，這樣才能夠提高檢測的效率和檢測的準確性。基于此，本文通過分析現階段食品微生物檢測技術的具體分類，以及在應用過程中的現狀，探究食品微生物檢測技術的發展前景和發展方向。

【關鍵詞】食品；微生物檢測技術；應用現狀；展望

食品微生物檢測技術是當前保證我國國民食品安全的重要基礎技術，隨著國民生活水平的不斷提高，國民對食物的種類和數量也有了更高的追求。但是現階段由于國民在食用食品的過程中，出現了很多食品安全事故，所以導致國民的生命健康受到了一定威脅，因此，食品管理人員必須要通過食品微生物檢測技術，提高食品的微生物檢測準確度，確保在市場上進行流通的食品能夠具備相應的安全性，在食品的生產、加工及包裝、運輸等過程中，要針對不同的環節，采取合理的微生物檢測技術，確保我國國民不會因為食品的微生物污染而出現一系列的病癥。

1傳統食品檢測技術

當前，一些傳統的食品檢測技術還在我國食品微生物檢測過程中具有廣泛的應用，由于傳統的食品檢測技術具有豐富的實踐，所以在實際檢測過程中，雖然效率性得不到保障，但是仍然具備一定的準確性，目前我國常用的傳統食品檢測技術主要分為顯微鏡檢測法和平板培養法，尤其是在平板培養法的應用過程中，由于需要對食品進行抽樣檢測，并且提取相應的微生物組織，所需要的時間相對較長。因此，傳統食品檢測技術可能不符合現階段我國逐漸發展的食品檢測流程。不過仍然要對傳統的食品檢測技術進行相應的分析，確保一些科技相對最為落后的地區，能夠通過傳統的顯微鏡檢測法和平板培養法，對食品中的微生物進行合理的檢測，保證我國國民的生命健康和食品安全。

1.1顯微鏡檢測法。顯微鏡檢測法是現階段在微生物檢測過程中較為常用的方法，通過顯微鏡檢測法不僅可以更加直觀的檢測出微生物的數量和形態，還可以提高檢測的效率，通過顯微鏡對食品進行檢測，存在的優缺點主要體現在以下兩個方面：首先，由于在使用顯微鏡檢測的過程中，只需要通過染色油鏡進行鏡檢即可，因此，其在檢測時更加具備快捷性和簡便性。即使一些對于微生物檢測方法不太了解的工作人員，在食品進行微生物檢測的過程中，只要掌握了顯微鏡的使用方法，也可以明確食品中的微生物形態及數量，同時顯微鏡檢測方法由于在我國食品安全的應用過程中時間相對較長，所以具備豐富的實踐經驗和理論基礎，所以為食品安全檢測工作人員提供了很多的方便。但是顯微鏡檢測方法也具有一定的缺點，例如在針對微生物進行檢測的過程中，由于只可以看到微生物的具體位置和數量，但是不能夠明確微生物的生存狀態，一旦過多的活性微生物在食品中，仍然會導致食品具有較大的毒性。所以顯微鏡檢測法作為傳統檢測技術中的重要組成部分，在后期的使用過程中，可能會具備一定的局限性。同時負責顯微鏡檢測法使用的工作人員也應該明確現階段產生的新型檢測技術，并且盡量結合新型的檢測技術與顯微鏡檢測法相結合，確保能夠提高檢測的準確性和檢測效率，使我國傳統檢測技術既不會喪失應有的價值，又可以更加廣泛的應用在現階段的食品微生物檢測中。

1.2平板培養法。在傳統檢測技術中的第二種經典方法為平板培養法，這是在現階段我國食品微生物檢測中最為經典的方法，通過這種方法可以對微生物的具體生存狀態，數量以及種類等進行明確的判斷。平板培養法的優點主要體現在實際的培養過程中，由于可以真正的將食品中的微生物進行相應的培養，并且明確微生物的具體種類，所以在實際檢測的過程中，可以為食品安全檢測提供一定的理論基礎，但是這種方法也存在很多的缺點，例如使用平板培養法時間相對較長，并且操作也相對較為復雜，而且針對培養的環境要求更為苛刻，既需要保證無菌培養又需要在適當的溫度和濕度環境下進行培養，所以在進行檢測的過程中降低了檢測的效率，因此，這種傳統的檢測技術，已經不再適用于現階段對所有種類食品進行檢測的過程中。由于檢測效率相對較低，現階段這種檢測方法已經不再被我國食品安全監管部門廣泛使用。

摘要：為研究我國內蒙古特色干制發酵乳制品中微生物物種多樣性、游離氨基酸和短鏈脂肪酸組成的其相關性。該研究通過高通量測序技術對內蒙古地區5種特色干制發酵乳制品中的微生物16SrDNAV4~V5區測序分析其細菌多樣性，利用GC-MS和HPLC分別測定短鏈脂肪酸和游離氨基酸含量。結果表明奶渣子的微生物，群落多樣性和總體豐度最高。5種樣品之間的微生物群落物種組成差異較大，在屬水平上阿如勒、奶豆腐和酸奶豆腐的優勢細菌為乳球菌屬（Lactococcus）和乳桿菌屬（Lactobacillus），奶皮子的優勢細菌為假單胞菌屬（Pseudomonas）和不動桿菌屬（Acinetobacter），奶渣子的優勢細菌為乳球菌屬（Lactococcus）和沙雷氏菌屬（Serratia）。在主成分分析（principalcomponentanalysis，PCA）中，酸奶豆腐和奶豆腐的樣兩者之間的物種組成度相似度最高。短鏈脂肪酸分析中，共檢測出23種短鏈脂肪酸，奶皮子含有短鏈脂肪酸的種類最多，游離氨基酸分析中，共檢測出24種游離氨基酸，奶豆腐包含24種游離氨基酸，且含量也明顯高于其他4個樣品，5種樣品中所包含同種的短鏈脂肪酸和游離氨基酸含量均存在顯著差異（P＜0.05）。在冗余分析（redundancyanalysis，RDA）中，羥脯氨酸和谷氨酸與乳球菌（Lactococcus）和乳桿菌（Lactobacillus）呈現正相關，綠膿桿菌（Pseudomonas）與丁酸、己酸、辛酸和癸酸呈現正相關。研究揭示了內蒙古特色干制發酵乳制品中微生物組成、短鏈脂肪酸和游離氨基酸之間的關系，為傳統發酵干制乳制品產業發展優化提供一定的理論依據。

關鍵詞：短鏈脂肪酸；游離氨基酸；微生物多樣性；高通量測序；干制乳制品

發酵是一種有著數千年歷史的食品保存和加工的方法[1]，發酵賦予食品豐富的微生物組成使其具有獨特的風味和營養組分[2]。傳統發酵制品多采用自然發酵的方式，而自然發酵過程中的微生物多來自于外部環境[3-4]，因此不同的地理環境和氣候條件造就了各具特色的發酵制品。內蒙古地區位于我國北部地區，獨特的氣候條件和自然資源成功造就了內蒙古地區“世界黃金奶源帶”的地位，豐富和優質的奶資源為各類乳制品的產業化發展提供了堅實的基礎。發酵乳制品作為乳制品中的典型代表，已成為不同牧區主要的創收乳制品。阿如勒、奶豆腐、奶皮子、奶渣子和酸奶豆腐作為內蒙古地區最具代表的干制發酵乳制品，因其營養豐富且風味獨特而一直受到消費者的青睞。食品發酵中微生物的代謝決定食品的風味和營養[5]，發酵食品的風味主要來源于食品中的呈味物質如游離氨基酸[6]。短鏈脂肪酸的產生受到微生物群的數量和類型的影響[7]，與發酵食品的營養品質和理化性質密切相關[8]。產生短鏈脂肪酸的益生菌主要有乳球菌、乳桿菌、雙歧桿菌等，有助于促進干制發酵乳制品中蛋白和脂肪的酶解，產生游離氨基酸和短鏈脂肪酸，可以改善干制發酵乳制品的風味和營養特性[9-10]。傳統的發酵技術極好的保存了自然條件下的微生物組成，微生物在發酵過程中占據主要作用[11]。傳統培養方法對于微生物群落的組成研究方法具有一定的局限性，高通測序技術屬于非培養方法，具有通量高，不偏向優勢菌群的條件下測序真實、客觀、準確等特點，能夠全面解析食品中微生物群落結構，逐漸成為微生物群落多樣性解析的主要工具[12]。麻和平等[13]基于高通量測序分析比較不同保存溫度下牦牛酸奶細菌多樣性，周繼福等[14]基于高通量測序技術比較不同來源原料乳中的細菌特征，馬靜等[15]基于高通量測序技術分析青藏高原牦牛和犏牛乳中微生物多樣性的研究。本研究通過采集內蒙古地區五種最具特色的干制發酵乳制品，通過分析微生物物種多樣性組成，測定游離氨基酸和短鏈脂肪酸含量，探討微生物、游離氨基酸和短鏈脂肪酸對干制發酵乳制品品質風味和營養物質之間的關系。

1材料與方法

1.1材料與試劑

干制乳制品阿如勒（ARL）、奶豆腐（NDF）、奶皮子（NPZ）、奶渣子（NZZ）和酸奶豆腐（SNDF）采自內蒙古自治區錫林郭勒盟西烏珠穆沁旗地區；E.Z.N.A.®soil試劑盒，美國OmegaBio-tek公司；瓊脂糖，西班牙biowest公司；FastPfu聚合酶，北京全式金生物技術有限公司；AxyPrepDNA凝膠提取試劑盒，美國Axygen公司；測序試劑盒，美國Illumina公司；鄰苯二甲醛（o-Phthalaldehyde，OPA）（分析純）、氯甲酸-9-芴基甲酯（9-fluorenylmethyloxycarbonylchloride，FMOC）（分析純）、3-巰基丙酸（分析純）、17種氨基酸混合標準品（2.5μmol/mL）（天冬酰胺、谷氨酰胺、瓜氨酸等），sigma；硼酸（分析純）、二水合磷酸二氫鈉（分析純）、十二水合磷酸氫二鈉（分析純）等，廣州化學試劑廠；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）等，上海安譜實驗科技股份有限公司CNW。

1.2儀器與設備

0引言   土壤微生物是森林生態系統中的重要分解者，它分解動植物殘體，促進土壤腐殖質的形成以及有機質的分解和轉化，加快土壤團粒結構的形成，改善土壤健康狀況，利于植物生長和發育[1-3]。土壤微生物數量和生物量是研究和評價土壤微生物調控功能的重要參數[4-6]。土壤微生物數量直接影響土壤的生物化學過程及土壤養分的組成與轉化，同時體現土壤中的生物活性，也是恢復和維持林地生產力的主要因素之一[2,7-8]。土壤微生物量可反映土壤同化和礦化能力的大小，是土壤活性大小的標志[5]，其參與生態系統養分循環、有機質分解等生態過程，影響土壤有機質的轉化，因而在陸地生態系統碳氮循環中發揮著重要作用[9-10]。土壤微生物數量和生物量受氣候、土壤和植被因子的顯著影響，即使在相同的氣候條件和土壤類型下，不同植被下的土壤微生物仍然存在較大差異[11]。在森林生態系統中，土壤的理化性質受凋落物、根活性和相關微氣象因子的影響，其中樹種組成起著決定性作用[12]。   以往有關植被對于土壤微生物影響的研究主要針對生態系統不同演替階段[13]、生態恢復和退化過程[14-15]，但對同一條件下不同植被類型，尤其是混交林的土壤微生物生物量的研究還比較少。馬尾松(Pinusmassoniana)和樟樹(Cinnamomumcamphora)是亞熱帶最常見的針葉林和闊葉林，在森林資源上占有重要地位。本試驗在湖南省長沙市天際嶺國家森林植物園分別對樟樹林、馬尾松林、樟樹-馬尾松混交林土壤微生物數量和微生物碳氮生物量進行研究，比較同一氣候條件下不同林型土壤微生物數量和生物量的差異，旨在揭示3種森林類型微生物數量和碳、氮生物量特征，以期為森林生態系統的碳氮循環機理、有機質分解等提供基礎數據。   1試驗地概況   研究樣地位于湖南省長沙市天際嶺國家森林植物園(113°03'—113°04'E，28°06'—28°08'N)。屬典型的亞熱帶濕潤季風氣候，年均氣溫17.1℃，1月最冷，平均為5.0℃，極端最低溫度為-11.3℃；7月最熱，平均氣溫為29.0℃，極端最高氣溫41.0℃；全年無霜期270~300天，年均日照時數1677.2h；雨量充沛，年均降水量1425mm。地層主要是第4紀更新世的沖積性網紋紅土和砂礫，屬于典型紅壤丘陵區。   研究樣地坡度為13°~20°，海拔55~100m；樟樹、馬尾松和混交林均為24年生的人工林，混交林為樟樹和馬尾松混交，其混交比例為4:6，3種群落基本情況見表1。林下植被有毛葉木姜子Litseamollis、油茶Camelliaoleifera、枸骨Ilexcornuta、山蒼子Litseacubeba、梔子Gardeniajasminoides、滿樹星Ilexaculcolata、狗脊蕨Woodwardiaprolifera、杜荊Vitexagnuscastus、大青Clerodendroncyrtophyllum、紫金牛Ardisiajaponica、黃檀Dalbergiabalansae、苔草Carextristachya、山麥冬RadixLiriopes、烏桕Sapiumsebiferum、喜樹Camptothecaacuminate、鱗毛蕨Dryopterischinensis、野柿Diospyroslotus、一枝黃花Solidagocanadensis、華山礬Symplocoschinensis、鹽膚木Rhuschinensis、白櫟Quercusfabri、小葉女貞Ligustrumquihoui、淡竹葉Lophatherumgracile、雞矢藤Paederiascandens、青桐Firmianasimplex、芒萁Dicranopterisampla、鐵線蕨Adiantumcapillusveneris、井欄邊草Pterismultifida、蛇葡萄Ampelopsissinica等。   2研究方法   2.1樣品采集   2009年7月初，在湖南省長沙市天際嶺國家森林植物園的馬尾松、樟樹、樟樹馬尾松混交林3種群落中，每種森林類型設置6塊3m×4m的固定樣地，每塊樣地間相隔10m以上。本次試驗采樣時間是2011年7月初，采樣時，先去除地表面凋落物，用自制直徑5cm、長10cm的鋼管打入到地下0~10cm土層，取500g左右的土樣，3種林型共采集24個樣，然后將每種林型采集的6個樣進行兩兩混和后，及時裝入自封袋帶回實驗室放入冰箱4℃下保存，供土壤微生物數量和微生物生物量的測定。   2.2土壤微生物的分離與鑒定   土壤微生物數量的測定采用稀釋平板培養計數法，稀釋倍數為細菌10-4~10-6、真菌10-2~10-4、放線菌10-3~10-5，每個稀釋濃度做3個重復，選擇長出菌落數10~200的培養皿計數[16]。細菌分離采用牛肉膏蛋白胨培養基，鑒定通過菌體形態結構觀察和生理生化指標測定，具體參照文獻[17]。真菌分離采用孟加拉紅培養基，鑒定參照文獻[18-19]。放線菌分離采用高氏一號培養基，鑒定參照文獻[20]。   2.3土壤微生物生物量碳和氮的測定   土壤微生物量C、N采用氯仿熏蒸浸提方法測定[21]。提取液中C的測定用重鉻酸鉀-硫酸消煮，硫酸亞鐵滴定法，N的測定采用凱氏消煮法。微生物量C、N的計算，見公式(1)、(2)。Cmic=EC/KEC(1)Nmic=EN/KEN(2)式中：EC、EN分別表示熏蒸與未熏蒸土壤提取液中所測C、N含量之差，KEC、KEN分別表示微生物量C、N浸提測定的比例，數值分別為0.38、0.54。   2.4試驗儀器   全自動凱氏定氮儀（產地：山東；滴定精度：1μL/步）；石墨消解儀（產地：山東；精度：±1.0℃）；真空干燥器（產地：鞏義）；微生物培養箱（產地：寧波；精度：±1）；無菌操作臺（產地：天津；潔凈等級：100級）；高溫滅菌鍋（產地：山東）。   2.5統計分析   試驗數據的處理和運算采用Excel2003軟件，用統計軟件SPSS18.0進行單因素方差分析和相關性分析，檢驗相同條件下土壤微生物數量、碳氮生物量的顯著差異性和相關性。   3結果與分析   3.13種林型土壤理化性質及養分比較   由表2可知，3種林型土壤養分中含水量和土壤平均溫度差異都達到顯著水平(P<0.05)，其特征均為：樟樹>馬尾松>混交林。土壤中有機碳為：樟樹林>混交林>馬尾松林，其中樟樹林和馬尾松林之間差異性達到顯著水平(P<0.05)；土壤全氮為：樟樹林>混交林>馬尾松，其中樟樹林與馬尾松林、馬尾松林與混交林的差異性達到顯著水平(P<0.05)；pH值為：樟樹林>馬尾松林>混交林；凋落物量為：樟樹林>混交林>馬尾松林，3種林型之間差異性均達到顯著水平(P<0.05)。#p#分頁標題#e#   3.2土壤微生物總數特征比較   對3種不同林型土壤微生物的總數量進行統計，其微生物總數量分別為：樟樹林751.6×103個/g干土、混交林298.2×103個/g干土、馬尾松林174.3×103個/g干土，特征為樟樹林>混交林>馬尾松林（見圖1）。進行單因素方差分析，結果表明3種森林類型的土壤微生物總數量存在顯著差異(P<0.05)，進行組間兩兩比較，發現3種林型兩兩之間的微生物總數的差異性均顯著(P<0.05)；其差異特征說明3種不同森林類型的土壤微生物在其分布上存在明顯的非均勻性。   3.3森林類型與土壤中微生物的關系   由表3可知，3種林型微生物中細菌比例特征為樟樹林>馬尾松林>混交林，其比例分別為：樟樹林82.63%，馬尾松林78.39%，混交林64.46%；真菌比例特征為混交林>馬尾松>樟樹林，比例分別為：混交林18.55%，馬尾松林12.62%，樟樹林10.44%；放線菌比例特征為混交林>馬尾松>樟樹林，比例分別為：混交林18.55%，馬尾松林8.99%，樟樹林6.93%。可見，3種林型對土壤微生物數量的影響有差異，這與不同的林型的凋落物量有一定關系[22]，從而影響其分解速率[23]。有研究[24]發現，不同林型混交林的土壤微生物數量組成比例也因林地不同而發生變化，不同林型的根際環境對細菌、真菌和放線菌也有不同影響[25]。   3.4土壤微生物生物量碳氮特征   由圖2可知，3種林型土壤微生物生物量碳的平均含量分別為543.01、421.48、370.95mg/kg，其特征為馬尾松林>混交林>樟樹林；微生物生物量氮平均含量為37.28、23.20、15.12mg/kg，特征則為：樟樹林>馬尾松林>混交林。進行單因素方差分析，其結果表明3種森林類型的土壤微生物生物量碳、氮均不存在顯著差異(P>0.05)。進行相關關系分析表明（見表4）：土壤微生物生物量碳和氮與土壤有機碳、全氮、碳氮比呈顯著線性相關，微生物生物量碳、氮均與土壤中水分相關性不顯著，微生物生物量碳氮之間也存在顯著線性相關。因此說明水分不是影響土壤中微生物生物量碳、氮的主要因素，土壤中的有機碳和全氮才是影響微生物生物量碳、氮的主要因素，而且微生物生物量碳與氮之間還會相互影響。   4結論   （1）3種林型下的土壤微生物總數量有顯著差異性(P<0.05)，總的特征是：微生物總數最大的是樟樹林，混交林次之，馬尾松林的數量最小。這種微生物數量的差異與林型存在密切關系，這在一定程度上反映了不同林型土壤有機質轉化程度和肥力水平。   （2）林型對土壤微生物數量和比例有顯著的影響。不同林型生境為微生物提供了異質性的生境條件，小生境理化因素的差異對3大類異養微生物的組成和比例有顯著的影響。研究結果表明，不同林型土壤微生物中細菌、放線菌、真菌的數量和比例都不盡相同。   （3）3種林型的土壤微生物生物量碳、氮無顯著差異性(P>0.05)。與土壤有機碳、全氮、碳氮比呈顯著線性相關，與土壤水分無明顯著的相關關系，表明土壤有機質是影響土壤微生物生物量的重要因素。   5討論   不同凋落葉分解的土壤微生物效應[26]研究結果表明，闊葉林凋落物分解速度影響土壤微生物的數量，其凋落物分解速度越快，其土壤微生物數量越多，而針葉林凋落物的土壤微生物效應就較差。5種不同人工林型下土壤微生物類群數量特性[27]的研究結果表明，混交林群落中的土壤微生物總數比單一林型中的數量多，其原因可能是在混交條件下，合理布局空間，根系發達，加速有機物分解和養分的積累，加速土壤微生物的活動，從而改善土壤的理化性狀，因此比單一林型更有利于微生物的生長。但是，本研究結果與眾多結論不同，經過對比分析3種林型的基本條件發現，混交林林地密度大，郁閉度大，所以在相同關照條件下，地面溫度相對較低，光照條件比較差，地被植物少，凋落物多，導致土壤微生物數量減少[28]。   有研究[29-30]發現，土壤微生物中以細菌所占的比例最多，真菌次之，放線菌最少，土壤微生物的組成以細菌為主，占微生物總數的71.4%~87.7%，放線菌次之，占總數的9.2%~22.7%，真菌最少，占1.1%~9.6%。可見，不同林型對土壤微生物數量的影響效果有差異。其原因可能與不同的林型的凋落物量有一定關系[31]，從而影響其分解速率[32]。在不同混交林地土壤養分、微生物和酶活性的研究[33]中發現，不同林型的混交林的土壤微生物數量組成比例也因林地不同而發生變化，不同林型的根際環境對細菌、真菌和放線菌也有不同的影響[34]。   細菌的數量很大程度上與土壤有機質含量呈正相關[35]。土壤細菌主要營養來源是植物殘體，在肥沃土壤和有機質豐富的土壤中，細菌數量相應偏多，而在缺乏有機質的土壤中其數量較少[30]，本試驗3種林型中以樟樹林的有機質含量最高，因此樟樹林更有利于細菌的生長。而真菌則是以混交林最多，馬尾松林次之，樟樹林最少，這是因為真菌相比放線菌和細菌更適合于pH較低的土壤條件下發育[36]，3種林型中混交林的pH相對較低，而真菌數量最多，這也與表2中的數據相印證。放線菌比例則是混交林所占比例最大，馬尾松次之，樟樹林最少。眾多研究[35,37]結論得出，放線菌具有喜熱耐旱以及適合在堿性的土壤環境中生存，本試驗3種林型中雖然混交林放線菌所占比例最大，但放線菌總數以闊葉林最高，放線菌特征也與眾研究結論相符。   土壤微生物生物量與溫度、濕度、土壤理化性質等環境因素有關[38-39]。本研究結果表明，土壤微生物生物量碳、微生物生物量氮與土壤水分無顯著相關關系，說明在本研究的3種林型中土壤濕度不是影響土壤微生物生物量的限制性因子。關于微生物生物量碳氮與土壤水分關系的研究報道較多[40-42]，但至今都對其相關性沒有定論。另外，相關分析表明，土壤微生物生物量碳和氮與土壤有機碳、全氮呈顯著正相關，這表明土壤有機質是影響土壤微生物量的重要因素[43]，有機質含量高，就能夠為微生物在進行自身合成與代謝過程中提供足夠的碳、氮物質來源以及能量來源[44]。此結果與以往研究結論相符，如金發會等石灰性土壤微生物量碳、氮與土壤顆粒組成和氮礦化勢的關系[45]研究結果表明，土壤微生物量碳和微生物量氮與土壤養分高度正相關。除有機碳、全氮與微生物生物量碳氮相關之外，杉木人工林土壤微生物生物量碳氮特征及其與土壤養分的關系[46]的研究結果揭示，土壤微生物量碳氮含量與銨態氮、全鉀和速效鉀含量之間存在顯著正相關；劉占鋒等[47]研究揭示，土壤微生物量碳與土壤全磷呈顯著正相關。#p#分頁標題#e#

摘要：微生物與免疫學是高職高專藥學專業的一門必修課程，旨在使學生掌握微生物基礎知識、免疫學基礎等基本知識和技能。分析選擇藥學專業微生物與免疫學課程思政建設內容的方法，并提供大量的案例素材。同時，結合授課經驗，分享如何將思政案例與專業理論內容相結合。

關鍵詞：微生物與免疫學；課程思政；教學改革

微生物與免疫學課程覆蓋學生面廣，在科學研究、社會服務、實際工作及日常生活中均具有重要的應用價值。在微生物與免疫學的發展、實踐過程中，我國科學家和世界各國研究人員都做出了卓越的貢獻，將他們的案例與課程知識點相結合，不但能使學生對理論知識點產生濃厚的興趣，也能“潤物無聲”地提高學生的思想政治修養，發揮“立德樹人”的作用[1]。

1思政視域下藥學專業微生物與免疫學課程思政建設內容選擇

在實際授課中，一線教師就特別重視課堂理論知識與相應思政點相融合的新型教學模式探究[2]。基于此，整理歸納思政素材對于新型教學模式的應用就顯得尤為重要，本課程團隊經過不斷的探索、研究、實踐后，總結歸納出微生物與免疫學課程的思政素材庫，現進行簡單介紹，以期為其他教師提供思路與借鑒（見表1）。

1.1挖掘具有文化自信、人文素養的思政案例

現代免疫學發展了120多年，中國的傳統醫學在人類與傳染病的“斗爭”中發揮著重要作用[3]。2020年初發生的新冠肺炎疫情是百年來全球發生的最嚴重的傳染病大流行，在抗疫過程中，中國政府反應迅速，應對及時，保證了疫情沒有大規模擴散。這里面有中國的制度優勢，其實還有一個獨特優勢，那就是傳統中醫藥的作用。這其中，“三藥三方”就發揮了重要的作用，“三藥”指的是血必凈注射液、金花清感顆粒、連花清瘟顆粒和膠囊3種中成藥；“三方”代表了宣肺敗毒方、清肺排毒湯、化濕敗毒方3個方劑。清肺排毒湯由東漢時期的張仲景所著的《傷寒雜病論》中的四首經典方劑加減配伍而成[4]。連花清瘟顆粒和膠囊、金花清感顆粒、血必凈注射液、宣肺敗毒方和化濕敗毒方也是傳統中醫藥在防治傳染病方面發揮重要作用的代表。