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傳統(tǒng)的功能微生物鑒定方法是在含有特定碳源培養(yǎng)基上對(duì)目標(biāo)微生物進(jìn)行富集、分離與純化，由于實(shí)驗(yàn)室可培養(yǎng)的微生物只占微生物總數(shù)的0.1~1%[1]，因此以純培養(yǎng)技術(shù)為代表的鑒定方法存在很大局限性。20世紀(jì)后半葉，以分子生物學(xué)為特色的現(xiàn)代土壤微生物研究方法取得突破性進(jìn)展，包括以磷脂脂肪酸（PLFA）技術(shù)為代表的生物化學(xué)方法，以BIOLOG技術(shù)為代表的生理學(xué)方法和基于DNA多態(tài)性的微生物群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性的分子生態(tài)學(xué)技術(shù)，如變性梯度凝膠電泳（DGGE）、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）、末端限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（T-RFLP）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（RT-PCR）等。上述技術(shù)提高了人們對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成的認(rèn)識(shí)，但仍難提供有關(guān)微生物間相互作用及代謝功能微生物的直接信息[1-2]。例如，DGGE和T-RFLP等分子指紋圖譜方法只能檢測(cè)環(huán)境樣品中的優(yōu)勢(shì)微生物群落，但具有特定生態(tài)和環(huán)境功能的微生物通常在數(shù)量上并不占優(yōu)勢(shì)[3]。因此，功能微生物很難被這些分子指紋圖譜方法所鑒別[2]。據(jù)估算，每克土壤含有約100億個(gè)微生物個(gè)體，包括100萬(wàn)種不同的微生物種群。利用上述技術(shù)，從這些難以計(jì)數(shù)的土壤微生物中原位鑒別特定生態(tài)過(guò)程的微生物驅(qū)動(dòng)者是難以想象的[4]。近年來(lái)得到廣泛關(guān)注的穩(wěn)定性同位素探針技術(shù)與現(xiàn)代分子生物學(xué)相結(jié)合，可以在相對(duì)未受干擾的環(huán)境樣品中培養(yǎng)功能微生物，利用穩(wěn)定性同位素示蹤復(fù)雜環(huán)境中的功能微生物核酸（DNA/RNA）或PLFA[5]，在分子水平鑒定生態(tài)系統(tǒng)重要過(guò)程的微生物驅(qū)動(dòng)者。其基本原理是在土壤中添加含有穩(wěn)定性同位素標(biāo)記的代謝底物，土壤中利用該標(biāo)記底物的微生物細(xì)胞在其生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中同化合成含標(biāo)記元素的生物標(biāo)志物。通過(guò)對(duì)生物標(biāo)志物進(jìn)行提取、分離、鑒定和比對(duì)分析，鑒別土壤中驅(qū)動(dòng)特定生態(tài)過(guò)程的功能微生物。該方法可以準(zhǔn)確獲得功能微生物的目的基因，避免了從浩瀚基因庫(kù)里一個(gè)個(gè)篩選目的基因的煩勞工作，已成為原位鑒定功能微生物的重要手段。   1土壤功能微生物sip鑒定技術(shù)流程   SIP技術(shù)是耦合微生物遺傳多樣性與代謝多樣性最有力的工具之一，該技術(shù)以復(fù)雜的原位或微宇宙土壤樣品為研究對(duì)象，采用穩(wěn)定性同位素原位標(biāo)記土壤樣品中特定微生物的DNA、RNA或PLFA。目前絕大多數(shù)研究采用13C標(biāo)記底物培養(yǎng)土壤，利用13C-底物的微生物細(xì)胞不斷分裂、生長(zhǎng)、繁殖，合成含13C標(biāo)記的DNA或RNA等生物標(biāo)志物。提取土壤樣品中13C-核酸和12C-核酸總混合物，用超高速離心技術(shù)將13C-核酸與12C-核酸分離，利用分子生物學(xué)手段對(duì)生物標(biāo)志物進(jìn)行分析，以鑒別土壤功能微生物。近年來(lái)，以15N和18O為基礎(chǔ)的SIP技術(shù)也被成功應(yīng)用于微生物驅(qū)動(dòng)的土壤生態(tài)過(guò)程研究[6]。   1.1土壤SIP技術(shù)前處理方法選擇   SIP技術(shù)前處理包括標(biāo)記底物的培養(yǎng)和特定微生物核酸或磷脂脂肪酸提取兩個(gè)步驟。培養(yǎng)方式主要包括添加營(yíng)養(yǎng)液富集培養(yǎng)和僅添加標(biāo)記底物培養(yǎng)等方式。添加營(yíng)養(yǎng)液富集培養(yǎng)法可以為微生物生長(zhǎng)提供相對(duì)穩(wěn)定的環(huán)境，并促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)，以獲得足夠的核酸或磷脂脂肪酸提取量[7]。土壤DNA/RNA的提取方法主要包括試劑盒提取法和液氮研磨法等。試劑盒法操作簡(jiǎn)單，提取純度高，但提取量較低，費(fèi)用高。液氮研磨法可以較好保證DNA/RNA的完整性，提取量相對(duì)較高，且操作費(fèi)用低，時(shí)間短，但需純化后才能滿足RT-PCR等后續(xù)分子生物學(xué)要求[8]。土壤PLFAs提取方法主要為兩種：一種是PLFAs法，即先通過(guò)氯仿-甲醇單相萃取浸提土壤微生物脂肪酸，再經(jīng)硅膠柱純化以及酯化作用得到活體細(xì)胞膜結(jié)合態(tài)FAME，提取的脂肪酸種類僅有El-脂肪酸，多為細(xì)菌所特有。另一種是TSFAMEs法，即通過(guò)堿甲醇分解法提取總土壤FAMEs。提取的脂肪酸種類包括酯連接和非酯連接PLFAs，多為真菌所特有[9]。   1.2土壤SIP技術(shù)中生物標(biāo)志物的選擇   土壤SIP技術(shù)中特定微生物的生物標(biāo)志物為PLFA、DNA和RNA3種。PLFA-SIP法是將PLFA從重穩(wěn)定性同位素（如13C）標(biāo)記過(guò)的環(huán)境樣品中提取出來(lái)，通過(guò)PLFA圖譜分析微生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性，再通過(guò)氣相色譜-燃燒-同位素比率質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定各種PLFA中13C的豐度[7]。PLFA-SIP的標(biāo)記底物濃度要求較低，靈敏度較高，但存在一些缺點(diǎn)：（1）對(duì)于未知PLFA分子圖式的不可培養(yǎng)微生物，或者土壤中的某種特殊脂肪酸無(wú)法與特定種類的微生物相對(duì)應(yīng)，該方法就無(wú)法鑒定功能微生物。（2）該方法在很大程度上依賴于標(biāo)記脂肪酸來(lái)確定土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，標(biāo)記上的變動(dòng)將導(dǎo)致群落估算上的偏差。（3）細(xì)菌和真菌生長(zhǎng)條件的改變或環(huán)境脅迫都能導(dǎo)致脂肪酸類型的改變[9]。同PLFA-SIP法相比，DNA-或RNA-SIP可獲得更直接的功能微生物遺傳信息。DNA-SIP的優(yōu)點(diǎn)是：標(biāo)記的13C-DNA一定來(lái)自新產(chǎn)生的子代微生物細(xì)胞，是證明微生物原位生長(zhǎng)并驅(qū)動(dòng)生態(tài)過(guò)程的最直接證據(jù)。另外，DNA完美的雙鏈結(jié)構(gòu)保證了遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定[10]。DNA-SIP的缺點(diǎn)是：自然環(huán)境中能被微生物利用的底物濃度通常很低，微生物大量分裂繁殖的可能性低，常需使用較高濃度的標(biāo)記底物來(lái)刺激目標(biāo)微生物的分裂繁殖，可能導(dǎo)致研究結(jié)果與原位自然環(huán)境的實(shí)際情況不相吻合[6,11]。RNA-SIP在一定程度上能克服上述缺點(diǎn)。自然環(huán)境中特定功能微生物發(fā)揮作用的同時(shí)，即使沒(méi)有大量增殖生長(zhǎng)，但具功能基因得到表達(dá)并在核糖體內(nèi)合成蛋白質(zhì)，獲得標(biāo)記的13C-RNA則表明微生物可能具有較強(qiáng)的活性。因此，RNA-SIP能夠采用更低的標(biāo)記底物濃度培養(yǎng)環(huán)境樣品，研究結(jié)果更接近原位狀況[12]。但因mRNA半衰期短、降解速度快，mRNA-SIP的實(shí)際應(yīng)用仍存在較大的技術(shù)難度[13]。DNA-SIP和RNA-SIP的結(jié)合將會(huì)大大提升SIP技術(shù)的潛力。   1.3土壤SIP分離后的分析方法   13C-核酸與12C-核酸分離后，可以利用分子生物學(xué)手段對(duì)功能微生物的DNA/RNA進(jìn)行分析，以鑒別土壤中重要生態(tài)過(guò)程的微生物驅(qū)動(dòng)者。目前的主要分析方法包括分子指紋圖譜法、實(shí)時(shí)定量PCR法和454高通量測(cè)序法等。（1）分子指紋圖譜法是目前進(jìn)行功能微生物的DNA/RNA分析的廣泛使用的快捷方法，但分子指紋圖譜分析方法的靈敏度較低。環(huán)境樣品中微生物通常數(shù)以百萬(wàn)計(jì)，采用古菌或細(xì)菌通用引物的DGGE和T-RFLP只能檢測(cè)環(huán)境樣品中數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)的微生物[14]。具有較為重要的生態(tài)和環(huán)境功能目標(biāo)微生物通常在數(shù)量上不占優(yōu)勢(shì)。因此，目標(biāo)微生物同化利用13C-底物后發(fā)生的微小變化很難被分子指紋圖譜法所鑒別。（2）實(shí)時(shí)定量PCR法直接針對(duì)目標(biāo)微生物的功能基因，采用高度靈敏的實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定不同密度層級(jí)中目標(biāo)微生物的數(shù)量，顯著提高了SIP技術(shù)的可靠性。然而，采用特異引物定量研究目標(biāo)微生物存在一定難度。土壤中數(shù)量眾多的微生物基因組DNA可能被13C標(biāo)記，很難采用單一的功能基因或16SrRNA基因特異引物，同時(shí)研究眾多目標(biāo)微生物在不同密度層級(jí)中的分布規(guī)律。我們無(wú)從得知哪一種微生物可能利用穩(wěn)定性同位素標(biāo)記底物，無(wú)法設(shè)計(jì)特異的功能引物，只能通過(guò)選擇性定量目標(biāo)微生物，明確目標(biāo)微生物在不同密度層級(jí)中的分布規(guī)律，同時(shí)判定SIP技術(shù)的可靠性[13，15]。（3）454高通量測(cè)序法是通過(guò)檢測(cè)各浮力密度層中微生物16SrRNA基因組成，分析目標(biāo)標(biāo)記微生物占該層總微生物的比例，從而鑒別前所未知的重要功能微生物。該技術(shù)可規(guī)避PCR擴(kuò)增，直接對(duì)標(biāo)記13C-RNA測(cè)序，每次分析可獲得大約100萬(wàn)16SrRNA基因序列，顯著增強(qiáng)了重浮力密度層中13C-標(biāo)記微生物DNA序列的檢測(cè)靈敏度。高通量測(cè)序可全面分析微生物群體的物種、基因功能組成，最大程度地認(rèn)識(shí)未培養(yǎng)微生物的遺傳組成和生命活動(dòng)，是目前最準(zhǔn)確的方法[16]。但該方法目前測(cè)試費(fèi)用較高，后續(xù)數(shù)據(jù)處理復(fù)雜，但隨著技術(shù)發(fā)展必將成為功能基因組學(xué)研究的主流技術(shù)。#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#   1.4構(gòu)建克隆文庫(kù)   超高速密度梯度離心分離并鑒別13C-DNA/RNA后，通常采用建立基因克隆文庫(kù)，構(gòu)建遺傳系統(tǒng)發(fā)育樹的方法分析13C-RNA和12C-RNA的微生物群落組成，并比較二者的差別，鑒定被13C底物所標(biāo)記的微生物群落。   2SIP技術(shù)在土壤功能微生物鑒定中的應(yīng)用   目前SIP技術(shù)在土壤分子生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域主要應(yīng)用在原位鑒定介導(dǎo)有機(jī)污染物生物降解和碳氮循環(huán)過(guò)程的功能微生物方面。有機(jī)污染物生物降解研究多集中于單環(huán)芳烴、PAHs和PCBs的研究，碳氮循環(huán)研究多集中于植物-微生物相互作用對(duì)陸地生態(tài)系統(tǒng)中碳氮轉(zhuǎn)化、土壤中碳氮周轉(zhuǎn)速率、稻田產(chǎn)甲烷機(jī)理及產(chǎn)甲烷菌的研究。   2.1SIP技術(shù)在土壤有機(jī)污染物生物降解研究中應(yīng)用   在有機(jī)污染物生物降解的微生物生態(tài)學(xué)研究中，SIP技術(shù)可以幫助了解在復(fù)雜原位土壤環(huán)境中，參與各個(gè)降解過(guò)程和途徑中功能微生物種類。Hanson等首次使用PLFA-SIP技術(shù)研究甲苯的生物降解，總共提取發(fā)現(xiàn)的59種PLFAs中有16種出現(xiàn)13C標(biāo)記[17]。Christopher等在對(duì)農(nóng)田土壤中苯酚降解菌的研究中，對(duì)13C標(biāo)記苯酚的DNA進(jìn)行18S-28S內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的PCR擴(kuò)增，T-RFLP分析，成功分離出一種白色細(xì)狀的真菌，并證實(shí)該真菌能加速苯酚的降解[18]。Sueoka等[19]利用RNA-SIP技術(shù)對(duì)13C標(biāo)記苯酚的RNA反轉(zhuǎn)錄PCR和T-RFLP分析，新發(fā)現(xiàn)了3種苯酚降解菌。羅春玲、Xie等[20-22]利用DNA-SIP技術(shù)研究了甲苯、苯和間二甲苯的降解菌，對(duì)分離出的13C-DNA進(jìn)行T-RFLP分析、克隆文庫(kù)的構(gòu)建，獲得了相應(yīng)的降解菌，并首次報(bào)道了TM7門對(duì)甲苯具有降解作用。Woods等使用H218O-DNA-SIP技術(shù)鑒定甲苯退化細(xì)菌，鑒定出一株已知的甲苯降解菌RHA1[23]。Padmanabhan等在Collamer地區(qū)的田間試驗(yàn)中，向受試的粉砂壤土供應(yīng)13C標(biāo)記的葡萄糖、咖啡因、萘和苯酚，通過(guò)GC/MS監(jiān)控土壤中釋放的13CO2濃度，以此估測(cè)底物降解速率，并將分離得到13C-DNA用通用引物對(duì)16SrRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終得到29個(gè)完整的DNA序列[24]。Maiysha等利用DNA-SIP技術(shù)，研究了土壤中具有降解萘、菲和芘等6種多環(huán)芳烴功能的微生物群落，將13C作為標(biāo)記元素，構(gòu)建13C-DNA的16SrRNA克隆文庫(kù)和RT-PCR分析，結(jié)果表明不可培養(yǎng)菌PG2不僅可以降解芘，還能降解熒蒽和苯并[A]蒽，從而說(shuō)明PG2菌對(duì)四環(huán)PAHs有著良好的降解效果[6]。Tillmann等設(shè)計(jì)了一個(gè)PLFA-SIP微宇宙實(shí)驗(yàn)，將PCBs高度污染土壤暴露于13C-2,-2′-二氯聯(lián)苯中，采用GC-C-IRMS測(cè)定不同PLFA13C的豐度，結(jié)果表明非優(yōu)勢(shì)菌在PCBs好氧降解過(guò)程中的主導(dǎo)作用[25]。Shahid等在對(duì)五氯酚降解菌的研究中，比較了DNA/RNA-DGGE和DNA/RNA-SIP-DGGE技術(shù)的鑒定效果，結(jié)果表明RNA-SIP技術(shù)可以更好反映功能微生物群落的變化趨勢(shì)[11]。Sul等將DNA-SIP和宏基因組技術(shù)結(jié)合，對(duì)13C-聯(lián)苯-DNA中芳烴雙加氧酶基因片段PCR擴(kuò)增，得到兩串與bphA相似的序列組，構(gòu)建1568粘粒克隆文庫(kù)，發(fā)現(xiàn)除含bphAE基因外，還含有屬于γ-變形菌綱的未知基因片段，該片段的G+C含量和bphAE相近，可能由于bphAE基因水平轉(zhuǎn)移而形成的[26]。   2.2SIP技術(shù)在土壤C循環(huán)中的應(yīng)用   土壤C轉(zhuǎn)化是微生物主導(dǎo)的生物地球化學(xué)過(guò)程，SIP技術(shù)能夠很好地將微生物群落與其功能聯(lián)系起來(lái)，加深人們對(duì)陸地生態(tài)系統(tǒng)重要C循環(huán)過(guò)程的認(rèn)識(shí)。Boschker等最先使用PLFA-SIP技術(shù)進(jìn)行甲烷營(yíng)養(yǎng)菌的研究[7]，隨后，DNA-SIP技術(shù)被用于研究土壤中甲烷氧化菌的活性功能種群。Hutchens等在微宇宙中用13CH4對(duì)取自羅馬尼亞MovileCave地下水系統(tǒng)的樣品進(jìn)行短期培養(yǎng)，以DNA-SIP技術(shù)為前提確定了3類含有編碼甲烷單氧化酶基因的甲烷營(yíng)養(yǎng)菌，并通過(guò)與非甲烷營(yíng)養(yǎng)菌比對(duì)證明了交叉取食的存在[27]。Cebron等在研究養(yǎng)分添加對(duì)甲烷營(yíng)養(yǎng)菌多樣性的影響時(shí)，人工添加養(yǎng)分在一定程度上可避免交叉取食，改進(jìn)了DNA-SIP方法[28]。Bengtson等研究了松樹林土壤中的甲烷營(yíng)養(yǎng)菌群落結(jié)構(gòu)組成與CH4氧化率的聯(lián)系，并簡(jiǎn)短討論了DNA/RNA-SIP的局限性[29]。Borodina等用DNA-SIP法考查了英國(guó)不同陸地生態(tài)系統(tǒng)土壤中氯化甲烷營(yíng)養(yǎng)菌的多樣性，通過(guò)與培養(yǎng)分離法的結(jié)果比較，揭示出土壤中仍存在大量不可培養(yǎng)的鹵化甲烷營(yíng)養(yǎng)菌，并將鹵化甲烷的全球循環(huán)同一組目前已知的鹵化甲烷營(yíng)養(yǎng)菌特征群聯(lián)系了起來(lái)[30]。Radajewski等最先使用DNA-SIP技術(shù)進(jìn)行甲醇營(yíng)養(yǎng)菌的研究，通過(guò)13CH3OH培養(yǎng)森林土壤，證明被13C標(biāo)記的細(xì)菌16SrRNA基因序列與已知可培養(yǎng)的甲醇營(yíng)養(yǎng)菌及嗜酸甲烷氧化菌相似，首次表明此類細(xì)菌還存在于森林土壤中[6]。Feng等利用DNA-SIP技術(shù)證明了稻田土壤中，甲酸鹽中的C首先被光營(yíng)養(yǎng)的初級(jí)和次級(jí)生產(chǎn)者利用，隨后產(chǎn)生的有機(jī)物被其他微生物利用[31]。陸雅海等用13CO2對(duì)水稻進(jìn)行脈沖標(biāo)記培養(yǎng)，利用RNA-SIP技術(shù)與T-RFLP分析，獲得水稻根際的產(chǎn)甲烷菌，并通過(guò)厭氧和好氧條件的對(duì)比，表明根際環(huán)境和降解過(guò)程的多相性[32，13]。該團(tuán)隊(duì)還利用PLFA-SIP描述了水稻根際微生物活性的空間變化，提出在根際革蘭氏陰性菌和真核微生物在同化根派生碳過(guò)程中最活躍，同時(shí)描述了圍繞根際的活性群落的空間系統(tǒng)變化[9]。   2.3SIP技術(shù)在土壤N循環(huán)中的應(yīng)用   15N作為生物體內(nèi)大分子合成的組成元素，可結(jié)合SIP技術(shù)研究土壤中氮循環(huán)過(guò)程的各類微生物功能群及其相互作用。Georg等利用標(biāo)記和未標(biāo)記的N進(jìn)行純微生物培養(yǎng)，結(jié)果顯示15N-DNA-SIP技術(shù)是可行的，但存在一定局限性，如可視條帶需要大量的DNA，15N-DNA的理想豐度要求大于50%等[33]。Buckley等通過(guò)改變基因G+C含量來(lái)增加15N-DNA的浮密度，增加了15N-DNA的分離強(qiáng)度，為原位追蹤利用N的微生物群落提供了新的研究方法，并采用15N2-DNA-SIP原位鑒定了獨(dú)立生存的固氮微生物，通過(guò)分析15N標(biāo)記DNA的16SrRNA，發(fā)現(xiàn)了3組新固氮微生物[34-35]。賈仲君等采用SIP技術(shù)示蹤農(nóng)田土壤氨氧化微生物DNA，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于古菌，細(xì)菌是土壤硝化過(guò)程的主要驅(qū)動(dòng)者[36]。賀紀(jì)正等對(duì)農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)中氨氧化古菌（AOA）和氨氧化細(xì)菌（AOB）進(jìn)行一系列研究，得出二者在根際土壤中的豐度、組成對(duì)環(huán)境的響應(yīng)占主導(dǎo)作用[37]，并發(fā)現(xiàn)土壤中硝化作用伴隨著古菌amoA的基因豐度和多樣性變化，進(jìn)一步證明了氨氧化古菌可同化CO2，屬于自養(yǎng)型微生物[38]。Jennifer等結(jié)合RNA-SIP和DNA-SIP技術(shù)，再次證明AOA可通過(guò)兩種途徑固定CO2，并在泉古菌（Crenarchaeota）中得到驗(yàn)證，進(jìn)而強(qiáng)調(diào)了AOA在硝化和CO2固定過(guò)程中的重要性[39]。Karen等以北美黃松林為研究對(duì)象，應(yīng)用H218O-SIP技術(shù)調(diào)查土壤中氨氧化微生物的生長(zhǎng)與死亡情況，發(fā)現(xiàn)人工添加氨可刺激AOB的生長(zhǎng)，與此同時(shí)AOA的死亡數(shù)量增加，而AOB則不受影響[40]。Ishii等在研究N2O在水稻土中的消減過(guò)程時(shí)，用13C標(biāo)記的琥珀酸鹽作為電子供體，鑒定了同化琥珀酸鹽的微生物，指出大多數(shù)N2O消減微生物屬于草螺菌屬和固氮螺菌屬。并證明前者消減速度大于后者，在水稻土N2O的減少過(guò)程中發(fā)揮重要作用[41]。#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#   3研究展望   SIP技術(shù)能有效降低環(huán)境微生物群落分析的復(fù)雜度，獲得功能微生物的目的基因，已成為原位分離功能微生物的重要手段。隨著新一代454高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，SIP技術(shù)可最大程度地認(rèn)識(shí)不可培養(yǎng)微生物的遺傳組成和生命活動(dòng)，獲取其功能基因，優(yōu)化并人工合成在原位環(huán)境中具有高效同化或降解作用的新基因。結(jié)合土壤化學(xué)等方面知識(shí)，共同探討土壤環(huán)境中功能微生物的代謝途徑和同化過(guò)程，挖掘微生物基因資源，鑒別土壤關(guān)鍵元素循環(huán)的微生物驅(qū)動(dòng)機(jī)制等，將是未來(lái)研究發(fā)展的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。