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微生物研究方法范文1
[中圖分類號] R92 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2012）07（a）-0081-02
Study on the microorganism limited inspecting method of Tianbai Jinhuang Powder
ZENG Haikun1 HONG Meihua2 ZHUO Xiaoping2
1.Foshan Chinese Medicine Hospital in Guangdong Province, Foshan 528000, China; 2.Shanwei Institute for Drug Control in Guangdong Province, Shanwei 516600, China
[Abstract] Objective To establish the microorganism limited inspecting method of Tianbai Jinhuang Powder. Methods The recovery test of inoculating five positive control bacteria was used to determine whether it contained antibacterial component. Results The results of recovery test of two positive test bacteria by Tianbai Jinhuang Powder were both lower than 70%, which indicated that there was a certain antibacterial effect under this experimental condition, but the antibacterial effect could be eliminated through the media dilution method. Conclusion Tianbai Jinhuang Powder can carry on the microorganism limited inspecting method according to the medium dilution method.
[Key words] Tianbai Jinhuang Powder; The microorganism limited inspecting method; Methods study; Bacteriostat
天柏金黃散是一種中藥驗方制劑，由天花粉、紅花、白芷、大黃等十一味藥組成，具有活血化瘀、清熱涼血、消腫止痛等功效，臨床上常用于傷科跌打腫痛或外科瘡瘍紅腫熱痛等癥。微生物限度檢查法是檢查產品及其原料、輔料受微生物污染程度的方法，產品的微生物限度檢查方法的建立，應分析其組成成分，若產品的組分貨源實驗條件發生改變可能影響檢驗結果時，計數方法應重新驗證[1]。為了更好地控制藥品質量，建立天柏金黃散的微生物限度檢查方法，筆者根據藥典要求進行了方法學驗證，結果滿意。報道如下：
1 儀器與材料
1.1 儀器
SW-CJ-IF凈化工作臺，YXQ-LS-50SⅡ全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器，SPX-150B-Z生化培養箱，MJX-160B-Z霉菌培養箱，DT300電子天平。
1.2 檢驗用菌株
實驗中所用到的檢驗菌株由中國藥品生物制品檢定所提供，分別是金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，CMCC（B）26 003，第4代）；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，CMCC（B）63 501，第3代）；大腸埃希菌（Escherichia coli，CMCC（B）44 102，第5代）；白色念珠菌 （Candida albicans，CMCC（F）98 001，第3代）；黑曲霉菌（Aspergillus niger，CMCC（F）98 003，第2代）。
1.3 試劑
檢驗用到的所有培養基均由中國生物制品檢定所提供，其他試劑均為分析純。
1.4 樣品
天柏金黃散是廣東省佛山市中醫院制劑中心生產的醫院制劑，批號為123J09。
2 方法與結果
2.1 菌懸液的制備
2.1.1 金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及大腸埃希菌懸液制備 取經35℃培養20 h的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的新鮮營養肉湯培養物l mL，用0.9%無菌NaCl溶液10倍稀釋至10-5～10-7，制成約為50～100 cfu/mL的菌懸液，做活菌計數備用。
微生物研究方法范文2
關鍵詞：功能基因組；高通量數據；生物信息學
中圖分類號：Q933 文獻標識碼：A 文章編號：1671-2064（2017）10-0190-01
功能基因組學（后基因組學），是在結構基因組所提供的豐富的高通量信息資源以及大量各類生成產物的基礎上發展起來的基因組學的子學科。其通過在功能基因組水平或功能系統水平上全面地分析基因的功能，發展和提出了多種實驗手段和分析方法，使得生物學的研究對象由單一基因或蛋白質轉為多個基因或蛋白質組成的系統，進而得到關于基因表達、調控、功能以及生物的生長、發育的相關規律。
1 差異顯示反轉錄PCR技術
差異顯示反轉錄PCR（DDRT―PCR）技術是由Liang和Pardee等提出的，以PCR和聚丙烯酞胺凝z電泳為基礎的功能基因組學的傳統方法。該方法的基本原理是：以1對細胞（或組織） 的總RNA反轉錄而成的cDNA為模板，利用PCR的高效擴增，通過5’端和3’端引物的合理設計和組合，將細胞（或組織） 中表達的基因片段直接顯示在DNA測序膠上，從而找出1對細胞（或組織）中表達有差異的cDN斷。DDRT―PCR具有周期短，功能多，靈敏度高，所需RNA的量較少并且重復性較高等優點。但是，在實際施行過程中， DDRT―PCR技術存在著假陽性率高、凝膠中單條cDNA帶成分不均一、所獲cDNA僅代表mRNA 3’UTR（非翻譯區）、一些低拷貝數mRNA不能有效呈現等問題。[1]
2 基因表達序列分析
基因表達序列分析（SAGE）是Velculescu等人建立的一種快速高效地分析轉錄物的實驗方法。其理論依據是：基因組中95%的基因可以由來自cDNA 3’端特定位置的一段9―11bp長的序列加以區分。這一段特異的基因序列被記作SAGE標簽。基因表達序列分析通過對cDNA制備SAGE標簽，然后將這些標簽串聯起來并對其進行測定，可以顯示出各SAGE標簽所代表的基因在特定的組織中是否有表達，同時還可以將SAGE標簽所出現的頻率作為其所代表的基因表達程度的指標。但是，應用SAGE技術有一個重要前提條件：GenBank中必須有某一物種足夠多的DNA序列的資料（特別是EST序列的資料）。[2]
3 微陣列分析
DNA微陣列（microarray assay）技術包括cDNA微陣列和DNA芯片（DNA chip）兩種方法，這兩種方法的原理相同。首先是在固相表面合成成千上萬個寡核苷酸“探針”（cDNA、EST或基因特異的寡核苷酸），該過程會用到光導化學合成、照相平版印刷和固相表面化學合成等技術。接著將寡核苷酸“探針”與來自不同細胞、組織或整個器官的用放射性同位素或熒光物標記的DNA或mRNA反轉錄生成的第一鏈cDNA進行雜交。最后對每個雜交點進行定量分析。定量分析的結果可以用于DNA測序、DNA突變和多態性分析以及對同一組織細胞在不同狀態下或在同一狀態下多種組織細胞基因表達水平的差異的檢測，還可以發現新的致病基因或疾病相關基因等。微陣列分析的優點是可以同時對大量的基因，甚至是整個基因組的基因表達進行對比分析，并且在核苷酸雜交技術的各個方面應用。其在同時比較同一組織在不同狀態下或各組織之間DNA序列分析以及基因的表達狀況等方面具有極大的優越性。
4 反義RNA分析
反義RNA是能與靶RNA互補配對的，用來定點分析某一段DN段（基因）功能的小分子RNA。反義RNA分析即是利用反義RNA來進行功能基因組分析的方法。該方法首先分離基因片段的mRNA，合成其mRNA的互補RNA（反RNA）。然后給反RNA加上基因表達必需的元件（如啟動子等），接著插入T-DNA。將其轉化到植株中，那么合成的基因就會在植株中表達，并表現出相應性狀。因為反義RNA與靶RNA堿基配對的結合方式，反義RNA可以在DNA復制、轉錄和翻譯水平上對基因表達加以調控。
5 蛋白質組分析
蛋白質組分析方法主要涉及兩個步驟：蛋白質的分離和蛋白質的鑒定。用于蛋白質分離的技術主要是雙向凝膠電泳（2-dimensional gel electrophoresis，2-DE），其原理是細胞抽提物在電泳過程中蛋白質個體首先依據所帶電荷然后依據分子大小被分離。這種方法的最大缺點是重復性差，使得幾乎不能同來自其他實驗室的資料進行比較。
6 生物信息學
生物信息學將DNA和蛋白質作為研究對象，以計算機等計算工具為基礎，發展更新各種軟件，收集、整理和儲存DNA和蛋白質的序列和結構數據，并加以分析進而發現藏在基因序列中的規律。應用生物信息學可以對功能基因組研究過程中產生的高通量，高維度的數據進行處理，應用數理統計的方法，以計算機的快速運算能力，找到功能基因組的相關信息。常應用生物信息學將未知DNA序列與數據庫中收集的DNA序列進行同源性比較，或應用相關軟件進行核苷酸及氨基酸序列的同源性比較，以此來獲得未知DNA序列的功能信息。[3]
7 小結與展望
隨著發展，基因組學由結構基因組學向功能基因組學發展，由此也產生了大量應用于功能基因組研究的工具和方法。這些方法從不同的角度和方向挖掘基因本身蘊含的豐富信息資源。功能基因組學無論是應用于獲取大量基因功能信息，亦或是針對特定基因的研究都取得了突破性的進展，發展速度迅速。但隨著各類研究的不斷深入進行，這些方法的精確性和準確性會漸漸不再滿足條件，同時各項技術尚未解決的一些問題也會被放大，單個方法或技術可能難以對新的問題有較好的應用。結合各種方法，揚長避短，綜合應用各種技術可以對功能基因組有更全面、深入的研究。[4]
功能基因組學的應用十分廣泛，從動物、植物到微生物群落分析都可以取得較好的研究成果，也可以應用于醫藥、毒理等領域。隨著計算機技術的發展，將生物信息學應用于功能基因組學，借助計算機強大的計算能力，功能基因組學將能取得更大的突破。
參考文獻
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微生物研究方法范文3
[關鍵詞]烏芪舒筋通絡片；微生物限度；方法學研究；《中國藥典》2015年版
[中圖分類號] R286 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）06（c）-0093-04
[Abstract]Objective To establish a microbial limit test method of Wuqi Shujin Tongluo tablets.Methods Methodology research on microbial limit test of Wuqi Shujin Tongluo tablets was conducted according to the "1105，1106，1107" of Chinese Pharmacopoeia 2015 edition with the fourth part.Results The total number of aerobic bacteria could be tested by plate dilution method and membrane filtration method，the total number of fungus and yeasts could be tested by the plate routine method，and the recovery was between 0.5 and 2，Escherichia coli，Salmonella，Bile salt resistant Gram-negative bacteria could be detected through control bacteria by direct inoculation method.Conclusion The total number of aerobic bacteria can be tested by plate dilution method，the total number of fungus and yeasts can be tested by plate routine method，and the control bacteria can be tested by direct inoculation method，the methods used are feasible，and easier to operate，which are suitable for the microbial limit test of Wuqi Shujin Tongluo tablets.
[Key words]Wuqi Shujin Tongluo Tablets；Microbial limit；Methodology research；Chinese Pharmacopoeia 2015 edition
躑問鍆絡片是根據我院省名中醫驗方制成的純中藥制劑，具有補肝腎，通絡止痛的作用，由細辛、制川烏、制草烏、桂枝、牛大力、防己、黑老虎、蜈蚣、走馬胎、羚羊角骨、牛膝、黃芪、杜仲、續斷、甘草等藥味組成[1]。該制劑微生物限度檢查法原按《中國藥典》2010年版進行方法學驗證[2]，隨著《中國藥典》2015年版的實施，新版微生物限度檢查方法變化很大，必須重新進行驗證。為此，本研究按《中國藥典》2015 年版四部“1105、1106、1107”項下方法[3]，對該制劑的微生物限度檢查方法進行了再次驗證研究，制訂了新的切實可行的微生物限度檢查法，替代了舊標準，并應用于該制劑的日常檢驗，使該制劑的微生物限度檢查法提升到新版《中國藥典》的水平。
1 儀器與試藥
1.1 儀器
SZX型超凈工作臺（上海滬南科學儀器聯營廠）；BHC-1300ⅡA/B3型生物潔凈安全柜（蘇州凈化設備有限公司）；YXQWF32-500臥式榘形壓力蒸氣消毒器（湖南衡陽醫療器械廠）；LRH-250A生化培養箱（韶關市泰宏醫療器械有限公司）；MJ-160B-Ⅱ霉菌培養箱（上海躍進醫療器械廠）；CX31生物顯微鏡（奧林巴斯）；HTY HOMO761勻漿儀（浙江泰林生物技術股份有限公司）；JA2003N電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；JC101型電熱鼓風干燥箱（上海成順儀器儀表有限公司、南通嘉程儀器有限公司合作出品）。
1.2 樣品
烏芪舒筋通絡片（肇慶市中醫院，批號：15050401；15051102；15052401）。
1.3 菌種
實驗所用的菌株傳代次數不得超過5代[4]，并采用適宜的保藏方法保存，確保試驗菌株的生物學特性。
金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis） [CMCC（B）63501]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（Aspergillus niger） [CMCC（F）98003]、大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]、乙型副傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B）[CMCC（B）50094]。以上菌種均來自于中國食品藥品檢定研究院。
1.4 培養基
胰酪大豆胨瓊脂培養基（批號：3105210）、沙氏葡萄糖瓊脂培養基（批號：3105120）、胰酪大豆胨液體培養基（批號：3105305）、沙氏葡萄糖液體培養基（批號：3105054）、麥康凱液體培養基（批號：3105291）、麥康凱瓊脂培養基（批號：3105138）、RV沙門增菌液體培養基（批號：3104847）、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基（批號：3104852）、三鐵塘瓊脂培養基（批號：3105052）、腸道菌增菌液體培養基（批號：3105093）、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基（批號：3104750），均由廣東環凱微生物科技有限公司生產，使用前先進行培養基的適用性檢查，并且在有效期內使用，培養基的制備按照標示方法進行。
1.5稀釋液、沖洗液
pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（廣東環凱微生物科技有限公司，批號：3105256）、胰酪大豆胨液體培養基（批號：3105305）、0.9%無菌氯化鈉溶液（自制）。
2 方法與結果
參照《中國藥典》2015年版四部“1105、1106、1107”微生物限度檢查法[3]進行驗證。
2.1 菌液制備
2.1.1 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌
取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物分別接種至100 ml胰酪大豆胨液體培養基中，30～35℃培養18～24 h；分別取各培養物 1 ml，加 0.9%無菌氯化鈉溶液9 ml，按10 倍遞增稀釋級數制成每毫升含菌數為
2.1.2 白色念珠菌
取白色念珠菌的新鮮培養物接種至100 ml沙氏葡萄糖液體培養基中，20～25℃培養2～3 d，取培養物 1 ml，加 0.9%無菌氯化鈉溶液9 ml，按10 倍遞增稀釋級數制備成每毫升含菌數
2.1.3黑曲霉
取黑曲霉新鮮培養物接種至沙氏葡萄糖瓊脂培養基中，20～25℃培養5～7 d，加入3～5 ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，洗脫孢子。再選用適宜的方法將孢子懸液吸至無菌試管內，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制備成每毫升含菌數
2.2 供試液的制備
取供試品10 g，加胰酪大豆胨液體培養基至100 ml，用勻漿儀打碎，混勻，作為1∶10的供試液。量取1∶10的供試液10 ml，加胰酪大豆胨液體培養基稀釋至100 ml，混勻，作1∶100的供試液。
2.3 微生物計數方法適用性試驗
2.3.1 平皿常規法
2.3.1.1 試驗組 需氧菌總數計數：取1∶10的供試液5份，每份100 ml，分e加入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉試驗菌液適量，振搖均勻，使每毫升供試液含菌量≤100 cfu。取1 ml注入平皿中，平行制備2份，立刻傾注胰酪大豆胨瓊脂培養基，凝固，30～35℃中培養≤3 d，計數。
霉菌和酵母菌總數計數：取1∶10的供試液2份，每份100 ml，分別加入白色念珠菌、黑曲霉試驗菌液適量，振搖均勻，使每毫升供試液含菌量≤100 cfu。取1 ml注入平皿中，平行制備2份，立刻傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養基，凝固，20～25℃中培養≤5 d，計數。
2.3.1.2 供試品對照組 取1∶10的供試液，以pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液，同試驗組操作。
2.3.1.3 菌液對照組 取胰酪大豆胨液體培養基代替1∶10的供試液，按試驗組項下方法操作，加入試驗菌液并進行微生物回收試驗。
2.3.1.4 計算 各菌株的回收率（R）=（試驗組的平均菌落數-供試品對照組的平均菌落數）/菌液組的平均菌落數×100%[5-6]，依據《中國藥典》2015年版四部規定，比值R應為0.5≤R≤2[7-9]（表1）。
2.3.2 平皿稀釋法
2.3.2.1 試驗組 需氧菌總數計數：取1∶100的供試液5份，每份100 ml，按“2.3.1.1”項下方法操作。
霉菌和酵母菌總數計數：采用平皿常規法R為0.5～2，所以不再進行稀釋法研究。
2.3.2.2 供試品對照組 取1∶100的供試液，以pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液同試驗組操作。
2.3.2.3 菌液對照組 取胰酪大豆胨液體培養基代替1∶100的供試液，按試驗組項下操作方法加入試驗菌液并進行微生物回收試驗。
2.3.2.4 計算 按“2.3.1.4”項下公式計算，結果見表2。
2.3.3 薄膜過濾法
2.3.3.1試驗組 取1∶10供試液10 ml，濾過，取pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液200 ml，分2次沖洗濾膜，在第2次沖洗中加入相應的菌液適量（含菌量≤100 cfu），濾過，取出濾膜，需氧菌檢查將膜貼于胰酪大豆胨瓊脂培養基中，在30～35℃下培養，≤3 d，霉菌和酵母菌檢查將膜貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養基中，在20～25℃下培養≤3 d。
2.3.3.2 供試品對照組 取1∶10供試液10 ml，以pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液同試驗組操作。
2.3.3.3 菌液對照組 取胰酪大豆胨液體培養基代替1∶10的供試液，按試驗組項下操作方法加入試驗菌液，同時進行微生物回收試驗。
2.3.3.4 計算 按“2.3.1.4”項下公式計算，結果見表3。
由表1～3可知，烏芪舒筋通絡片需氧菌總數計數檢查采用平皿稀釋法、薄膜過濾法，霉菌和酵母菌計數檢查采用平皿常規法、薄膜過濾法，R均在0.5～2內，符合《中國藥典》2015年版四部微生物學限度檢查驗證的要求。考慮到實際操作中，平皿常規法、平皿稀釋法操作簡便，優于操作繁瑣的薄膜過濾法，故需氧菌總數計數法可選用培養基稀釋法，霉菌和酵母菌總數計數檢查選用平皿常規法為最佳方法。
2.4 控制菌適用性試驗
2.4.1耐膽鹽革蘭陰性菌檢查驗證試驗
取1∶10供試液適量，混勻，20～25℃培養2 h，作為預培養供試品。取預培養供試品3份，每份10 ml，分別加入10 ml腸道菌增菌液體培養基，第1份加入1 ml緩沖液作為供試品組，第2份加入1 ml大腸埃希菌（含菌量≤100 cfu/ml）作大腸埃希菌陽性對照組，第3份加入1 ml銅綠假單胞菌（含菌量≤100 cfu/ml）作為銅綠假單胞菌陽性對照組。另取胰酪大豆胨液體培養基10 ml，加入10 ml腸道菌增菌液體培養基及1 ml緩沖液，作為陰性對照組。于30～35℃培養24～48 h，劃線接種到紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基的平板上，30～35℃下培養18～24 h，觀察菌落形態，結果見表4。
2.4.2大腸埃希菌檢查驗證試驗
取1∶10供試液2份，每份10 ml，分別加入到100 ml胰酪大豆胨液體培養基中，第1份加入1 ml緩沖液，混勻，作為供試品組，第2份加入1 ml大腸埃希菌（含菌量≤100 cfu/ml），混勻，作陽性對照組；另取胰酪大豆胨液體培養基110 ml，加入1 ml緩沖液，作為陰性對照組，均于30～35℃中培養18～24 h。
取以上培養物1 ml加入到100 ml麥康凱液體培養基中，在42～44℃下培養24～48 h。然后劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，在30～35℃下培養18～72 h，觀察菌落形態，結果見表5。
2.4.3沙門菌檢查驗證試驗
取1∶10供試液2份，每份100 ml，第1份加入1 ml緩沖液，混勻，作為供試品組，第2份加入1 ml沙門菌（含菌量≤100 cfu/ml），混勻，作陽性對照組。另取胰酪大豆胨液體培養基100 ml，加入1 ml緩沖液，作為陰性對照組，在30～35℃下培B18～24 h。然后分別取培養物0.1 ml，接種至10 ml RV沙門增菌液體培養基中，在30～35℃下培養18～24 h，取少量RV沙門增菌液體培養物，劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂的培養基上，在30～35℃下培養18～48 h，用接種針挑選疑似菌落，進行斜面和高層穿刺接種于三糖鐵瓊脂培養基上，于30～35℃中培養18～24 h，觀察菌落形態，結果見表6。
由表4～6可知，控制菌檢查采用直接接種法，即可達到要求。
3討論
2015年版與2010年版《中國藥典》相比[10-11]，微生物計數法適用性試驗，從對細菌總數作方法適用性檢查，變成對需氧菌總數作方法適用性試驗，試驗菌株3種變為5種；培養基由胰酪大豆胨瓊脂替代營養瓊脂，用于檢查需氧菌，沙氏葡萄糖瓊脂培養基代替玫瑰紅鈉培養基，用于檢查霉菌與酵母菌，雖然增加了試驗的工作量，但卻具有良好的廣譜性，提高檢出率，方法更靈敏[12]。對控制菌的檢查，新版刪除了大腸菌群的檢查，新增了耐膽鹽革蘭陰性菌的檢查[13]，對含有藥材粉末的固體口服給藥制劑都必須檢查沙門菌，提高了對致病菌控制的要求。
烏芪舒筋通絡片處方藥味中多種成分含有抗菌活性[14-15]，由實驗可知，對需氧菌具有抑制作用，故需氧菌總數計數檢查時采用常規平皿法回收率較低，需選用平皿稀釋法或薄膜過濾法。
在實際工作中，勻漿儀打碎樣品時，經常出現泡沫，往往對驗證結果造成影響，待泡沫消除后再加入菌種，基本能消除由操作引起的影響。
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微生物研究方法范文4
【關鍵詞】:維C銀翹片 微生物限度檢查 回收率 沖洗量 方法學驗證
【中圖分類號】R286.0 【文獻標識碼】A 【文章編號】1007-8517(2008)07-0044-02
維C銀翹片具有辛涼解表,清熱解毒的功能[2]｡臨床用于流行性感冒引起的發熱頭痛､咳嗽､口干､咽喉疼痛｡當建立藥品的微生物限度檢查法時,應進行方法的驗證,以確認所采用的方法適合于該藥品的細菌､霉菌及酵母菌數的測定及控制菌檢查[3]｡本文通過接種代表性的五株陽性菌株,采用常規法､稀釋法､薄膜過濾法進行微生物限度檢查方法學驗證實驗,為該樣品建立了微生物限度檢查方法｡
1儀器與材料
1.1儀器HTY-2000A集菌儀(杭州高得醫療器械有限公司);開放式集菌器(北京牛牛基因技術有限公司,批號:20051005)｡
1.2樣品維C銀翹片(云南雄業制藥有限公司,規格/片,批號050301 050401 050412)
1.3 培養基和試劑硫乙醇酸鹽液體培養基(批號, 040212), 改良馬丁液體培養基(批號,0507062), 改良馬丁瓊脂培養基(批號,050520), 玫瑰紅鈉瓊脂培養基(批號,030710), 營養肉湯培養基(批號,050508), 營養瓊脂培養基(批號,050328),膽鹽乳糖增培養基(批號,0504192),北京三藥科技開發公司｡
1.4菌種大腸埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(F)44102]､枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501]､金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]､白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]､黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003](中國藥品生物制品檢定所提供)
2方法
按中國藥典2005版一部微生物限度檢查法(附錄XⅢ C)[4]進行實驗｡
2.1菌液制備取經34℃培養18~24h,大腸埃希菌､金黃色葡萄球菌､枯草芽孢桿菌肉湯液體培養物1mL,加入9mL0.9%氯化鈉溶液中,10倍稀釋至10-5~10-7備用;取經24℃培養18~24h的白色念珠菌液體培養物1mL,加入9mL0.9%氯化鈉溶液中,10倍稀釋至10-6備用;取經培養一周的黑曲霉菌斜面物,加0.9%氯化鈉溶液3mL,洗下孢子,轉移至另一空管,標準比濁后,取1mL加入0.9%氯化鈉溶液中10倍稀釋至10-4備用｡
2.2 菌液的檢驗取上述金黃色葡萄球菌､枯草桿菌､大腸埃希菌10-5~10-7稀釋液各1ml,用45℃營養瓊脂培養基20ml注皿, 各平行測定兩皿,30~35℃培養48小時, 計數, 應約為50~100cfu/ml;取上述白色念珠菌10-5~10-6稀釋液及上述黑曲霉菌10-4孢子懸液各1ml,用45℃玫瑰紅鈉瓊脂培養基20ml注皿, 各平行測定兩皿,23~28℃培養, 逐日觀察計數, 應約為50~100cfu/ml｡結果見表1｡
2.3供試液制備取樣品10mg,加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml,用勻漿議混勻,作為1:10的供試液｡
2.4 回收率的測定
2.4.1 細菌數霉菌數常規法測定試驗組:取1:10供試液1ml､50~100cfu試驗菌同時加入平皿中,立即傾注瓊脂培養基,待凝固后,置規定溫度培養24~72小時逐日觀察結果｡菌液組:測定每一菌株所加的試驗菌數(同菌液檢驗)｡
供試品對照組:取1:10供試液1ml加入平皿中,立即傾注瓊脂培養基,待凝固后,置規定溫度培養24~72小時逐日觀察結果,測定供試品本底菌數
2.4.2 細菌數霉菌數稀釋法測定試驗組: 取1: 10供試液0.2ml/皿､50~100cfu 試驗菌同時加入平皿中,立即傾注瓊脂培養基,待凝固后,置規定溫度培養24~72小時逐日觀察結果｡
菌液組:測定每一菌株所加的試驗菌數(同菌液檢驗)｡
2.4.3 細菌數霉菌數薄膜過濾法測定取1:10的供試液1ml,注入開放式濾器(先用少量緩沖液潤濕濾器),用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜,每次100ml共4次(每次充分振搖濾器,總沖洗400ml),留有少量緩沖液加1ml(50~100cfu) 試驗菌混勻, 抽干后, 取出濾膜菌面朝上貼入規定瓊脂平板培養基中,置規定溫度培養48小時,結果見表2
2.5 回收率的計算按如下公式計算試驗組的加菌回收率:試驗組的加菌回收率=試驗組的平均菌落數-供試品對照組的平均菌落數供試品對照組的平均菌落數×100%
2.6 控制菌檢查方法的驗證2.6.1 常規法:取1:10供試液10ml加入100ml膽鹽乳糖培養基中,同時加入上述大腸埃希菌液1ml,置35℃培養24小時;取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10ml加入100ml膽鹽乳糖培養基,同時加入金黃色葡萄球菌液1ml,置35℃培養24小時,作為陰性菌對照組｡另取1:10供試液1ml加入10ml膽鹽乳糖發酵培養基中,同時加入上述大腸埃希菌液1ml, 置35℃培養24小時; 取1:10供試液1ml加入10ml膽鹽乳糖發酵培養基中置35℃培養24小時,作為陰性對照｡
3結果與討論
討論: 從表2､表3知: 常規法對大腸埃希菌､白色念珠菌､黑曲霉回收率高于70%,對金黃色葡萄球菌回收率底于70%,對枯草桿菌回收率為0;稀釋法對金黃色葡萄球菌､白色念珠菌､黑曲霉､大腸埃希菌回收率均高于70%,對枯草桿菌回收率還是為0,說明采用稀釋法還不能消除樣品的抑菌活性薄膜過濾法對5株陽性試驗菌株回收率均達到了100%,采用薄膜過濾法可以消除該供試品的抑菌活性｡
4結論
本樣品通過接種5株陽性試驗菌株進行方法學驗證,通過進行三次平行實驗,驗證了其方法的有效性和可靠性,建立了維C銀翹片微生物限度檢查的方法: 細菌數需采用薄膜過濾法(用2.6.1 常規法:取1:10供試液10ml加入100ml膽鹽乳糖培養基中,同時加入上述大腸埃希菌液1ml,置35℃培養24小時;取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10ml加入100ml膽鹽乳糖培養基,同時加入金黃色葡萄球菌液1ml,置35℃培養24小時,作為陰性菌對照組｡另取1:10供試液1ml加入10ml膽鹽乳糖發酵培養基中,同時加入上述大腸埃希菌液1ml, 置35℃培養24小時; 取1:10供試液1ml加入10ml膽鹽乳糖發酵培養基中置35℃培養24小時,作為陰性對照｡
3結果與討論
討論: 從表2､表3知: 常規法對大腸埃希菌､白色念珠菌､黑曲霉回收率高于70%,對金黃色葡萄球菌回收率底于70%,對枯草桿菌回收率為0;稀釋法對金黃色葡萄球菌､白色念珠菌､黑曲霉､大腸埃希菌回收率均高于70%,對枯草桿菌回收率還是為0,說明采用稀釋法還不能消除樣品的抑菌活性薄膜過濾法對5株陽性試驗菌株回收率均達到了100%,采用薄膜過濾法可以消除該供試品的抑菌活性｡pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液每筒沖洗400mL)進行測定､霉菌數和酵母菌數可采用稀釋法進行測定､控制菌大腸埃希菌采用常規法法進行檢查｡
參考文獻
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[3]中國藥典2005年版[S].一部.2005,附錄71.
微生物研究方法范文5
本文提出了一種采用硫酸/鹽酸混合溶液分析棉（亞麻）/再生纖維素纖維混紡產品纖維含量的新方法，并著重分析了采用混合酸溶液法測定纖維素纖維和再生纖維素纖維混紡織物纖維含量的優點及試驗步驟。
關鍵詞：棉（麻）/再生纖維素纖維；混合酸溶液；含量；試驗方法
1引言
目前，國際和國內對于棉（麻）/再生纖維素纖維混紡織物的化學分析方法有多種，例如甲酸/氯化鋅法、硫酸法、鋅酸鈉法等。國內的檢測機構對于此類產品的分析多采用GB/T 2910―2009規定的甲酸/氯化鋅法，該方法適用范圍較廣，但測定過程復雜，影響因素諸多，例如試驗用溶液配制、溶液保存、溶解溫度、溶解時間、修正系數等。各條件對最終結果的影響程度不一，在實際試驗過程中較難控制，易導致試驗結果不準確甚至錯誤。而本文提出了一種采用硫酸/鹽酸混合溶液分析棉（亞麻）/再生纖維素纖維混紡產品纖維含量的新方法――混合酸溶液法，這種方法克服了上述方法的不足，且測試結果準確可靠。
本文重點分析了混合酸溶液法測定棉（麻）/再生纖維素纖維混紡織物纖維含量的試驗原理與方法。其中再生纖維素纖維包括粘纖、莫代爾、萊賽爾三種再生纖維素纖維。
2原理
用硫酸/鹽酸混合酸溶液把粘纖、莫代爾、萊賽爾從已知干燥質量的混合物中溶解去除，收集殘留物，清洗、烘干和稱重；用修正后的質量計算其占混合物干燥質量的百分率，并由差值得出再生纖維素纖維的質量百分率。
3試驗
3.1標準
FZ/T 01057.4―2007纖維鑒別方法：溶解法；AATCC 20A.12.3：59.5%硫酸法。
3.2試樣
純棉筒子紗線、純亞麻筒子紗線、不同比例的淺色棉（亞麻）/再生纖維素纖維混紡試驗樣品。
3.3設備
電熱鼓風烘箱、水浴恒溫振蕩設備、真空抽濾裝置、0.0001電子分析天平、量筒、密度計、稱量瓶、三角燒瓶、燒杯、玻璃砂芯坩堝、干燥器、生物顯微鏡。
3.4試劑
36%~38%鹽酸（分析純）；
70%（m/m）硫酸：98%（m/m）的硫酸312.5 mL倒入230 mL的蒸餾水（三級水）中攪拌均勻即可；
混合酸溶液：70%（m/m）硫酸20 mL與35%（m/m）鹽酸800 mL充分混合均勻即可；
1%（m/m）稀氨水：取50 mL氨水（試劑5）加水845mL稀釋即可。
3.5試驗步驟
3.5.1纖維修正系數d
取100 mL硫酸/鹽酸混合酸溶液于250 mL具塞三角燒瓶中，放置在23℃~25℃的恒溫水浴中。分別取質量為m0經預處理的純棉筒子紗線、純亞麻筒子紗線樣品放入上述溶液中，振蕩25 min~30 min。
用真空裝置抽吸過濾上述溶解液，把殘留物移回具塞三角燒瓶中用同溫度同濃度的50 mL硫酸/鹽酸混合酸溶液充分振蕩、洗滌，并用真空裝置抽吸過濾。
把殘留物重新移回具塞三角燒瓶中用同溫度蒸餾水充分振蕩清洗，抽吸過濾，然后用1%（m/m）稀氨水中和清洗并使殘留物浸沒于溶液中10 min，再用常溫的蒸餾水充分清洗，真空抽吸過濾，直至采用pH試紙測試試樣呈中性，把剩余殘留樣品烘干、冷卻，稱重記為m。纖維修正系數計算公式如公式（1）所示，結果記錄如表1所示。
由表1可知，硫酸/鹽酸混合溶液對于棉、亞麻纖維的質量修正系數分別為1.05、1.10。
3.5.2樣品測試步驟及驗證結果
取質量為m0（m0 ≥1.00 g）經預處理的待測樣品放入100 mL硫酸/鹽酸混合酸溶液中，按照3.5.1的方法進行試驗，剩余殘留樣品的質量記為m1，纖維含量計算公式如公式（2）所示。
其中：P――不溶組分凈干質量百分率，%。
棉/再生纖維素纖維混紡織物纖維含量與亞麻/再生纖維素纖維混紡織物纖維含量驗證結果分別如表2、表3所示。
表2棉/再生纖維素纖維混紡織物纖維含量測試結果
表3亞麻/再生纖維素纖維混紡織物纖維含量測試結果
由表2、表3可知：對于各種棉（亞麻）/再生纖維素纖維的混紡產品纖維含量測得值與設計混紡比例的偏差均小于1%，符合FZ/T 01053―2007的規定。
4結論
1）對于各種混紡比例的棉、亞麻/再生纖維素纖維產品，硫酸/鹽酸混合酸溶液法測得的含量結果與實際混紡比例偏差均在FZ/T 01053―2007規定的允許偏差范圍內，可滿足檢測需求。
2）此方法所用溶劑配制過程簡潔、安全，且試樣溶解過程影響因素較少，溶解溫度、時間易控制，結果穩定性良好。
微生物研究方法范文6
【關鍵詞】微生物采油技術 微生物 發展
1 微生物采油技術概述
1.1 微生物采油的涵義及分類
微生物采油技術是指將篩選的微生物或微生物代謝產物注入油藏，經微生物的生命活動或代謝產物的某些特性作用于原油，改變原油的某些物化特性，從而提高原油采收率的技術。根據實施過程與方法的不同，分為地上微生物采油技術與地下微生物采油技術。地上微生物采油技術是指在地上經微生物發酵工程研制、生產微生物的某種代謝產物注入油藏而提高原油采收率。即利用優良微生物在地上發酵生產采油制劑的技術。目前，廣泛應用的有微生物多糖和微生物表面活性劑。地下微生物采油技術將在地上模擬油藏條件篩選的微生物菌種與營養物注入油藏，微生物在油藏中運移，生長繁殖產生多種代謝產物，作用于原油而提高原油采收率； 或用生長繁殖的菌體細胞及代謝產物封堵貯油巖層大的孔道，調整水驅油剖面；或將營養物注入油藏，激活油藏內的原生微生物生命活動提高原油采收率。由于地上微生物采油技術，存在純種發酵，產品單一，且成本較高，因此，相比之下地下微生物采油技術更有發展前景。
1.2 微生物采油技術的現狀與發展趨勢
2009年，“世界石油微生物技術大會”于尼日利亞召開，微生物采油技術進一步引起了世界的關注。早在1926年，微生物采油的想法就已經提出，上世紀中葉美國與蘇聯成功的進行了微生物采油實驗。我國的微生物采油技術起步較晚，大約在上世紀60年代開始了微生物煉油的研究，經過多年的努力，在這一方面的研究取得了較大的成就。直到現在，全國多個油田都開展了微生物煉油技術的應用，取得了明顯的效果。對于石油微生物遺傳學研究，目前已經建立了細菌以烷烴、奈和水楊酸、甲苯和二甲苯三類典型烴類物質生長的遺傳學模型。在高粘采油機理的研究方面，篩選高粘性優良菌種，探討高粘性采油機理。成為了急需解決的技術難題。各國的研究結果表明，微生物提高采收率技術在成本上很有優勢，有著極大發展空間。微生物采油十分環保，比起其他的采油方式對環境的污染很小，不會對環境造成2次污染，不會對人體健康帶來威脅，這一種綠色工藝。由此可見，微生物采油技術將會有更好的發展前景，為人類的發展做出一定的貢獻。
2 微生物采油技術機理
2.1 微生物改變原油結構
微生物生長代謝能降解原油的重組分變成輕組分 ， 產生的 CO2、 H2、 N2、 CH4等氣體增加油層壓力 ，細菌對油層直接作用，在貯油巖石表面生長繁殖，占據孔隙空間而驅出孔隙中的原油，降低原油中的某些組分而降低原油粘度，從而使其流動性變好。
2.2 微生物改變驅油環境
微生物生長代謝產生能促使油釋放的代謝產物，如低分子量的醇、有機物、生物表面活性劑等，使油水界面張力降低，從而使原油從巖石中釋放出來，從而提高采收率；溶劑性產物可溶解原油，生成的CO2、 H2、CH4等小分子產物可起到溶解驅油的作用；微生物可以產生有機酸，增加孔隙度，提高滲透率，增加油層壓強等使其更容易開采出來；微生物代謝產生的生物聚合物可控制液體流動，或者形成選擇性封堵。
3 微生物采油技術的方法及優缺點
3.1 微生物采油技術方法
用于微生物采油的微生物必須是厭氧或兼性厭氧型微生物；這內微生物在油層高溫、高壓、高鹽等極端環境下能正常生長繁殖并產生代謝；大多數采油微生物能以烴類作為碳源，并能以貯油層內的無機鹽作氮源或作營養元素；采油微生物必須與其注入油層的環境條件相配伍相適應。微生物采油技術根據實施過程與方法的不同，分為地上微生物采油技術與地下微生物采油技術。另外也可以分為微生物采油方法分為生物工藝法與微生物地下發酵提高采收率法。采油界普遍認為，地上微生物采油技術實施的是微生物純種發酵，產品單一，且成本較高。如將篩選的微生物混合菌種或單一菌種，注入貯油巖層，在貯油巖層這個巨大的天然的發酵罐中生長繁殖，產生多種代謝產物，菌體細胞和多種代謝產物聯合作用于原油，改變原有的某些物化性能，提高原油采收率。所以地下微生物采油技術是較地上微生物采油技術更先進的高新技術，有著更廣闊的開發應用前景。現正推廣應用。鑒于地下微生物采油技術解決的技術性問題不同，采用的方法及工程實施不同，近30―35年在世界范圍內開展的地下微生物采油現場試驗及應用主要分成六大類：微生物清蠟處理法、單井增產微生物處理法、微生物驅油法、微生物壓裂液壓裂法、激活油藏微生物群落發和微生物選擇性封堵法。
3.2 微生物采油技術的優缺點
3.2.1微生物采油技術的優點
微生物采油技術的優點：首先它對環境的污染較小，不會傷害人類的身體健康。其次這項技術與其他技術相比，成本更低，更加經濟。再者微生物采油工藝工程十分簡單，所需設備與其他技術相比更是簡單的多。微生物采油的方向廣，使用與重質油、輕質油等各種類型的原油。最后微生物一起體積優勢，能夠達到其它技術多不能達到的死角。
3.2.2微生物采油技術的缺點
微生物采油技術的缺點：首先微生物采油技術不能在冬季施工，這將有礙有采油量，給企業帶來一定的損失。其次微生物產生的生物聚合物可能產生沉淀，影響采油的正常進行。再者在重金屬含量、溫度較高及鹽度較大的情況下，微生物很容易遭到破壞。最后微生物的施工條件很難恰當的把握。
4 結論
生物技術在國外一直是熱門，隨著生物技術的發展，微生物采油技術日趨成熟，我國的對生物技術的重視程度及在生物技術上的發展與國外相比還有很大的距離，但本世紀以來，生物技術在我國得到了極大的發展。生物技術極其的有用，而微生物采油更是重中之重，它不僅緩解了國際石油壓力，還降低了石油價格，減輕消費者的經濟壓力。如此重要的一門技術，需要更加廣闊的發展空間，其必將為人類帶來巨大的財富。
參考文獻
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