前言：尋找寫作靈感？中文期刊網用心挑選的基于發酵桑葉茶生物活性成分變化分析，希望能為您的閱讀和創作帶來靈感，歡迎大家閱讀并分享。
目前對采用人工接種發酵生產桑葉茶及其對其中DNJ、黃酮、多糖、多酚等主要功能成分含量影響的研究鮮有報道。本文分別以4種菌單獨或組合發酵桑葉制得的桑葉茶，分析其中DNJ、黃酮、多糖、多酚4種功能成分含量變化，為桑葉的深度開發利用提供數據。
材料與方法
1.實驗材料
1）實驗菌種：黑曲霉(AsPergillusniger)，GSICC60108，甘肅省微生物菌種保藏中心；日本根霉(RhizopusjaponicusVuillemin)，GIM3.119，廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心；綠色木霉(Trichodermaviride)，GIM3.443，廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心；青霉(Penicillium)，GSICC61603，甘肅省微生物菌種保藏中心。以上四種菌種的安全等級均高，其生物危害程度為四類，在通常情況下不會引起人類或者動物疾病。
2）實驗樣本：自然發酵桑葉茶、人工發酵桑葉茶由本實驗室自制。
2.試劑與儀器
1）主要試劑：DNJ標準品，北京德威鈉生物技術有限公司；甘氨酸（Gly），sigma公司；9-芴基氯甲酸甲酯（FMOC-Cl），sigma公司；乙腈為色譜純，天津市四友精細化學品有限公司；沒食子酸標準品，中國藥品生物制品檢定所；蘆丁標準品，北京德威鈉生物技術有限公司；其他常用試劑均為分析純。
2）主要實驗儀器：Waters1525HPLC，美國Waters公司；5810型臺式高速離心機，德國Eppendorf公司；Spectrumlab22可見分光光度計，上海棱光技術有限公司；KQ5200DB型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。
3.實驗方法
1）發酵桑葉茶的制備：采摘從頂芽往下數4-10片的新鮮桑葉，去柄，切為4cm×4cm的小葉片，混勻后稱取100g葉片用微波殺青90s，揉捻，加入107cfu菌液10mL(自然發酵只加10mL無菌水)，復揉，28℃發酵5h，微波干燥，制得桑葉茶。（注：加菌量共為107cfu，菌種復配比例為1:1或1:1:1。）2）DNJ的測定測試樣品的制備：取桑葉茶粉末0.5g，加入一定量超純水，80℃水浴浸提2h(每20min搖勻一次)，抽濾后，濾渣再加水浸提2次。合并浸提液，用超純水定容至50mL，即得樣品提取液。DNJ的衍生化及測定方法按照參考文獻[19]進行。色譜條件：色譜柱：C18柱（150mm×4.6×5μm）；流動相：乙腈-0.1%醋酸(50:50，V/V)；流速：1.0mL/min；柱溫25℃；進樣量10μL；紫外檢測器，檢測波長254nm。3）黃酮測定：取桑葉茶粉末0.5g于50mL離心管中，加70%乙醇15mL，80℃水浴80%功率超聲提取15min，7000r/min離心5min，抽濾，得到濾液。如此共提取3次，濾液用70%的乙醇定容至50mL。吸取1.0mL濾液，用AlCl3比色法[20]測定4）多糖測定：取桑葉茶粉末0.250g于蘭蓋瓶中，加入20mL沸蒸餾水，在100%功率下55℃超聲提取20min，將提取液過濾后定容至25mL。取1.0mL濾液用苯酚-硫酸法[21]測定多糖含量。5）多酚測定：按照GB/T8313-2008茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法[22]進行測定。
4.數據統計與分析：各實驗至少重復3次以上，實驗數據用Excel和Spss16進行統計處理。
結果和討論
按照3.2）的實驗方法，對不同濃度DNJ標準溶液進行測定，得到DNJ的標準曲線線性回歸方程為y=15776x-70392，相關系數r=0.9996。式中x為DNJ濃度，μg/mL；y為峰面積。按照1.3.3實驗方法，測定不同濃度蘆丁標準溶液的吸光度，得到蘆丁標準曲線線性回歸方程為y=11.622x-0.0031，相關系數r=0.9997。式中，x為蘆丁濃度，μg/mL；y為吸光度。按照1.3.4的實驗方法，測定不同濃度葡萄糖標準溶液的吸光度，得到葡萄糖的標準曲線線性回歸方程為y=10.909x-0.0021，相關系數r=0.9998。式中，x為葡糖糖的濃度，μg/mL；y為吸光度。按照1.3.5的實驗方法，測定不同濃度沒食子酸標準溶液的吸光度，得到沒食子酸的標準曲線線性回歸方程為y=0.0208x+0.0034，相關系數r=0.9998。式中，x為沒食子酸的濃度，μg/mL；y為吸光度。實驗結果表明，各標準曲線的相關系數均大于0.9990，線性關系良好，可用于樣品中相關活性成分的測定。
2.DNJ標準品和樣品的色譜圖
將DNJ經衍生化后上高效液相色譜儀進行測定，得到如圖1、圖2、圖3所示色譜圖：由色譜圖2可知，在本實驗條件下，DNJ衍生物DNJ-FMOC的保留時間為2.731min，與Gly-FMOC和FMOC-OH的峰間距分別相差2.719min和4.243min，表明這兩種物質均不干擾DNJ的測定。
3.單一菌種發酵桑葉茶中DNJ等活性成分含量變化
分別以黑曲霉、日本根霉、綠色木霉和青霉的單一接種于桑葉中進行發酵生產桑葉茶，與自然發酵生產的桑葉茶比較其DNJ等活性成分含量的變化。實驗結果如表1：從表1可知，用綠色木霉發酵所得桑葉茶中DNJ含量為111.28mg/100g.干重，與自然發酵得到的桑葉茶比較，下降了6.43%，且有顯著性差異（P＜0.05）；而日本根酶、黑曲霉、靑霉發酵后得到的桑葉茶中DNJ含量均上升，特別是日本根酶發酵后DNJ含量為131.56mg/100g.干重，與自然發酵的桑葉茶比較增加10.63%，具有極顯著差異（P＜0.01）。與自然發酵比較，4種單一菌種發酵桑葉茶中多糖含量均下降，其中黑曲霉、青霉、綠色木霉發酵的桑葉茶中多糖含量與自然發酵的比較分別下降了14.48%、8.84%、9.18%，均具有極顯著性差異（P＜0.01）；而日本根霉發酵桑葉茶中多糖僅下降了2.67%，無顯著性差異（P＞0.05）。與自然發酵比較，用日本根霉發酵桑葉茶中黃酮增加了5.78%，有極顯著性差異（P＜0.01）；而黑曲霉、青霉、綠色木霉3種菌發酵桑葉茶中黃酮含量分別降低了23.77%、0.86%、14.73%，其中黑曲霉、綠色木霉發酵的桑葉茶中黃酮下降有極顯著差異（P＜0.01）；而靑霉發酵后黃酮含量下降無顯著性差異（P＞0.05）。與自然發酵比較，用日本根霉、黑曲霉、青霉、綠色木霉發酵桑葉茶中的多酚含量分別降低了9.00%、33.56%、11.74%、24.56%，其中日本根霉發酵桑葉茶中多酚含量下降相對較少，但也有顯著性差異（P＜0.05），而黑曲霉、青霉、綠色木霉發酵的桑葉茶中多酚含量下降有極顯著性差異（P＜0.01）。綜合單一菌種發酵實驗的結果可知，與自然發酵比較，采用日本根霉發酵后所得桑葉茶中DNJ、黃酮含量有極顯著增加；而多糖、多酚含量雖然有所下降，但比實驗的其他菌種發酵后桑葉茶中這兩種成分的下降低很多。因此，從對發酵桑葉茶功能成分影響來看，單一菌種發酵以日本根酶較好。#p#分頁標題#e#
4.菌種兩兩混合發酵桑葉茶對DNJ等功能成分含量的影響
分別將黑曲霉、日本根霉、綠色木霉和青霉兩兩混合接種于桑葉中進行發酵生產桑葉茶，與自然發酵生產的桑葉茶比較DNJ等功能成分含量的變化。實驗結果如表2：從表2可知，用日本根酶+綠色木霉、青霉+綠色木霉、黑曲霉+綠色木霉、黑曲霉+青霉混合發酵的桑葉茶中DNJ含量與自然發酵比較均有一定增加，但無顯著性差異（P＞0.05）；而經日本根酶+青霉、日本根酶+黑曲霉發酵的桑葉茶中DNJ含量與自然發酵比較有輕微降低，但無顯著性差異（P＞0.05）。而由日本根酶、黑曲霉、靑霉單獨發酵生產的桑葉茶中DNJ含量均上升，而將它們兩兩混合后發酵生產的桑葉茶中DNJ含量卻無此變化。表明這些菌種兩兩混合發酵對桑葉茶DNJ增加并無協同作用，反而可能具有一定的拮抗作用。從表2可知，黑曲霉+綠色木霉發酵的桑葉茶中多糖含量與自然發酵相比增加了0.57%，日本根霉+黑曲霉發酵的下降了1.21%，但差異無顯著性（P＞0.05）；日本根霉+綠色木霉、青霉+綠色木霉、日本根霉+青霉、黑曲霉+青霉發酵的桑葉茶多糖含量分別下降了8.93%、8.84%、8.46%、5.09%，有極顯著性差異（P＜0.01）。而用4種菌單獨發酵的桑葉茶中多糖含量僅日本根霉發酵的與自然發酵比較下降差異無顯著性，而其他3種菌發酵的桑葉茶多糖含量下降均具有極顯著性差異。表明這4種菌兩兩混合后發酵生產桑葉茶與單獨接種一樣，會導致其中多糖含量下降。由表2可知，經日本根霉+綠色木霉、黑曲霉+青霉發酵桑葉茶中黃酮含量與自然發酵比較分別下降7.51%和9.22%，有極顯著性差異（P＜0.01）；青霉+綠色木霉、日本根霉+青霉、黑曲霉+綠色木霉、日本根霉+黑曲霉發酵后桑葉茶中黃酮含量與自然發酵比較分別增加了5.00%、3.11%、0.12%、2.41%，除青霉+綠色木霉發酵的增加有顯著性差異（P＜0.05）外，其他發酵的差異不顯著。而當用4種菌單獨發酵的桑葉茶中，除日本根霉發酵的桑葉茶中黃酮明顯增加外，其余3種菌發酵的桑葉茶中黃酮含量均下降。實驗結果表明，這4種菌兩兩混合發酵對桑葉茶中黃酮含量有下降的作用。由表2可知，用青霉+綠色木霉、日本根霉+青霉發酵后的桑葉茶中多酚含量與自然發酵比較分別增加了6.87%、9.06%，均有顯著性差異（P＜0.05）；日本根霉+綠色木霉、黑曲霉+綠色木霉、黑曲霉+青霉、日本根霉+黑曲霉發酵桑葉茶中多酚含量分別降低了9.08%、15.19%、15.57%、13.12%，均具有顯著性差異（P＜0.05）。而用4種菌單獨發酵的桑葉茶中多酚含量與自然發酵比較均降低，其中日本根霉發酵的下降相對較少。實驗結果表明，如用青霉+綠色木霉、日本根霉+青霉兩兩混合發酵對桑葉茶中多酚含量的增加有一定的協同作用。
5.種菌種混合發酵桑葉茶對DNJ等功能成分含量變化
分別將黑曲霉、日本根霉、綠色木霉和青霉按1:1:1的比例混合接種于桑葉中進行發酵生產桑葉茶，與自然發酵生產的桑葉茶比較其中DNJ等功能成分含量的變化。實驗結果如表3：將黑曲霉+綠色木霉+青霉、綠色木霉+日本根酶+青霉、黑曲霉+綠色木霉+日本根霉、黑曲霉+日本根酶+青霉分別命名為A、B、C、D。可知，經A、B、C,3種菌種混合發酵生產的桑葉茶中DNJ含量與自然發酵得到的桑葉茶比較，分別增加了4.41%、5.20%、8.10%，其中經C混合發酵得到的桑葉茶中DNJ與自然發酵的比較具有顯著性差異（P＜0.05）；而D發酵得到的桑葉茶中DNJ含量與自然發酵的比較降低了5.79%，但無顯著性差異（P＞0.05）。而當用日本根酶、黑曲霉、靑霉發酵生產的桑葉茶中DNJ含量均上升，而將它們三種菌混合發酵生產的桑葉茶中DNJ含量雖有增加，但不如單獨接種日本根霉增加的多，進一步證明它們混合發酵對桑葉茶中DNJ增加的影響無協同效應，而是可能具有拮抗作用。
從表3可知，用黑A、B、C、D發酵的桑葉茶中多糖含量與自然發酵比較分別降低了7.16%、13.96%、10.99%、9.41%，差異具有極顯著性（P＜0.01）或顯著性（P＜0.05）。而用4種菌單獨發酵的桑葉茶中多糖含量僅日本根霉發酵的與自然發酵比較下降差異無顯著性，而其他3種菌發酵的桑葉茶多糖含量下降均具有極顯著性差異。表明這4種菌三三混合后發酵生產桑葉茶與單獨接種一樣，會導致其中多糖含量下降，而且它們的這種降低作用可能具有協同性。經A、B、C、D發酵桑葉茶中黃酮含量與自然發酵比較分別下降了為2.34%、8.41%、16.86%、9.30%，除A外，差異均有極顯著性（P＜0.01）。而當用4種菌單獨發酵得到的桑葉茶中，日本根霉發酵的桑葉茶中黃酮明顯增加，其余3種菌發酵的桑葉茶中黃酮含量均下降。表明，這4種菌三三混合發酵對桑葉茶中黃酮含量可能具有協同的下降作用。經A、B、C、D發酵后桑葉茶中多酚含量與自然發酵比較分別降低了13.31%、12.52%、23.92%、7.67%，均有極顯著性差異（P＜0.01）。而用4種菌單獨發酵的桑葉茶中多酚含量與自然發酵比較也是降低的，其中日本根霉發酵的下降相對較少。表明，用4種菌單獨或三三混合發酵都將導致生產的桑葉茶中多酚含量下降。
結論
1.與自然發酵比較，單獨接種這4種菌發酵生產桑葉茶中以接種日本根酶可使其中DNJ含量達到0.133g%，比自然發酵的增加10.63%；而將4種菌兩兩混合發酵而生產的桑葉茶中DNJ含量無影響；而將黑曲霉+綠色木霉+青霉、綠色木霉+日本根酶+青霉、黑曲霉+日本根酶+青霉3種菌種混合發酵生產的桑葉茶中DNJ含量比自然發酵的有一定增加，但增加得不如日本根霉發酵的多。
2.與自然發酵比較，單獨接種4種菌發酵生產桑葉茶中，除接種日本根霉生產的桑葉茶多糖含量無明顯變化外，其余3種菌均使發酵桑葉茶多糖含量下降；將4種菌兩兩混合接種發酵生產的桑葉茶中，只有黑曲霉+綠色木霉和日本根霉+黑曲霉發酵的桑葉茶中多糖含量未受到影響，其余的菌種兩兩混合發酵都使桑葉茶中多糖含量下降；而將4種菌三三混合發酵均可使生產的桑葉茶中多糖含量明顯下降。
3.與自然發酵比較，單獨接種4種菌發酵生產桑葉茶中，除用日本根霉發酵桑葉茶中黃酮增加了5.78%，靑霉發酵對其中黃酮含量無影響外，另2種菌均使發酵桑葉茶中黃酮含量降低；將4種菌兩兩混合發酵生產桑葉茶，除青霉+綠色木霉發酵的可使黃酮含量增加5.00%外，其余的對發酵桑葉茶中黃酮含量無影響或使其下降；將4種菌三三混合發酵生產桑葉茶，除黑曲霉+綠色木霉+青霉對其中黃酮含量無影響外，其余的均使桑葉茶中黃酮含量下降。#p#分頁標題#e#
4.與自然發酵比較，單獨接種4種菌發酵生產桑葉茶可使其中多酚含量下降，其中日本根霉發酵桑葉茶中多酚含量下降9.00%，相對相對較少；將4種菌兩兩混合發酵生產桑葉茶，除青霉+綠色木霉、日本根霉+青霉發酵后的桑葉茶中多酚含量增加，其中日本根霉+青霉發酵的增加9.06%，較多，其余的使發酵桑葉茶中多酚含量降低；將4種菌三三混合發酵生產的桑葉茶中多酚含量均明顯下降。
通過對上述研究結果的分析發現，用日本根酶單獨發酵得到的桑葉茶中DNJ與自然發酵比較增加了10.63%，多糖含量未受到影響，黃酮含量增加了5.78%，多酚含量下降了9.00%，但與其他菌發酵的比較下降是最少的；經黑曲霉發酵后黃酮、多糖、多酚含量均分別下降了23.77%、14.48%、33.56%，是下降最高的。DNJ是桑葉茶中最主要的功能性成分。因此，認為日本根霉是在所用的實驗菌種中保證發酵桑葉茶功能性質最好的菌種。
我們在以后的研究工作中，在保證桑葉茶安全性的前提下，還將進一步篩選其他的微生物與日本根霉共同作用，期望能進一步提高DNJ等功能成分含量，使發酵桑葉茶成為人們喜愛的、有明顯保健作用的飲品。（本文圖、表略）
本文作者：肖洪 沈以紅 黃先智 丁曉雯 張亞瓊 梁菡峪 張迪 單位：西南大學食品科學學院，重慶市農產品加工重點實驗室 重慶家蠶基因組生物學國家重點實驗室 重慶西南大學蠶學與生物系統研究所