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生物質(zhì)的優(yōu)缺點范文1
關(guān)鍵詞：化學(xué)性污染；物理性污染；生物性污染；膠體顆粒；懸浮物
中圖分類號：O13文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1671―1580（2015）10―0148―02
一、問題提出
眾所周知，水是地球上所有生命賴以生存的基礎(chǔ)。沒有水，一切生命創(chuàng)造的精彩都將不復(fù)存在。當(dāng)今世界，經(jīng)濟(jì)在高速發(fā)展，我們對于水的需求更大，然而我們卻在面臨前所未有的水危機(jī)，水污染的惡化更使水資源短缺雪上加霜。我們的水資源正在遭受各種污染的侵襲，水污染嚴(yán)重破壞了生態(tài)環(huán)境、影響人類生存，要想實現(xiàn)人類社會的可持續(xù)發(fā)展，首先要解決水污染問題。
由有害化學(xué)物質(zhì)造成水的使用價值降低或喪失稱之為水污染。水的污染有兩類：一類是自然污染；另一類是人為污染。而后者是主要的。水污染可根據(jù)污染雜質(zhì)的不同而主要分為化學(xué)性污染、物理性污染和生物性污染三大類。水中雜質(zhì)按尺寸分，可分為溶解物、膠體顆粒和懸浮物3種。有些雜質(zhì)可以用基于高濃度、外加計量反應(yīng)試劑為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)的物化方法（如沉降、吸附、濕式氧化等） 以及生化技術(shù)等進(jìn)行處理。而對于天然水體和飲用水中低濃度、高毒性、難降解污染物 ，如多溴聯(lián)苯醚、全氟辛酸（磺酸）、消毒副產(chǎn)物、內(nèi)分泌干擾物、PPCPs（抗生素）等。 很難用前述傳統(tǒng)的物化方法和生化技術(shù)等技術(shù)進(jìn)行處理，迫切需要提出建立新型的高效選擇性檢測和消除的原理和方法。
1.利用動態(tài)光反射儀器測量出水中某污染物粒徑隨時間的變化值（見表1），請就給定的數(shù)據(jù)擬合出粒徑隨時間變化的曲線和分布。
2.就測量出的數(shù)據(jù)評價該測量方法的優(yōu)缺點。
3.試建立模型說明如何對這類的污染物進(jìn)行處理，達(dá)到凈化污水的目的。
二、模型假設(shè)
1.假設(shè)污染物顆粒一直處于運動狀態(tài)中，沉降顆粒數(shù)量較少，對測定結(jié)果不產(chǎn)生影響。
2.假設(shè)溫度對污染物顆粒的粒徑影響可以忽略。
3.假設(shè)光照對污染物顆粒的粒徑影響可以忽略。
4.樣本方差σ2已知時，顆粒粒徑為均值。
三、變量說明
對本文對所用到的變量做如下定義：
w：權(quán)值，b：偏置項，ε：不敏感損失函數(shù)，ξi：松弛因子，C：正則常數(shù)，αi：拉格朗日乘子，α*i：拉格朗日乘子，F(xiàn)：高維空間，λi：拉格朗日乘子，λ*i：拉格朗日乘子，γ：核參數(shù)，n：樣本容量，m：水質(zhì)指標(biāo)數(shù)目，N：最高水質(zhì)等級，Ex（j）：原第j個水質(zhì)指標(biāo){x*（i，j）|i=1，2，…，n，}的均值，Sx（j）：原第j個水質(zhì)指標(biāo){x*（i，j）|i=1，2，…，n，}的標(biāo)準(zhǔn)差，di：為第i個樣本的水質(zhì)指標(biāo)與研究水體水質(zhì)指標(biāo)之間的距離，wi：為權(quán)重，x：沿河距離，t：時間，A：過水段面面積，Q：流量，C：謝才Chezy系數(shù)，R：水力半徑，g：重力加速度，C：模擬物質(zhì)的濃度，u：河流平均流速，Ex：對流擴(kuò)散系數(shù)，K：模擬物質(zhì)的一級衰減系數(shù)，V：流速，a，b：用戶設(shè)定參數(shù)。
[參考文獻(xiàn)]
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生物質(zhì)的優(yōu)缺點范文2
【關(guān)鍵詞】食品；微生物檢測技術(shù)；應(yīng)用現(xiàn)狀；展望
食品微生物檢測技術(shù)是當(dāng)前保證我國國民食品安全的重要基礎(chǔ)技術(shù)，隨著國民生活水平的不斷提高，國民對食物的種類和數(shù)量也有了更高的追求。但是現(xiàn)階段由于國民在食用食品的過程中，出現(xiàn)了很多食品安全事故，所以導(dǎo)致國民的生命健康受到了一定威脅，因此，食品管理人員必須要通過食品微生物檢測技術(shù)，提高食品的微生物檢測準(zhǔn)確度，確保在市場上進(jìn)行流通的食品能夠具備相應(yīng)的安全性，在食品的生產(chǎn)、加工及包裝、運輸?shù)冗^程中，要針對不同的環(huán)節(jié)，采取合理的微生物檢測技術(shù)，確保我國國民不會因為食品的微生物污染而出現(xiàn)一系列的病癥。
1 傳統(tǒng)食品檢測技術(shù)
當(dāng)前，一些傳統(tǒng)的食品檢測技術(shù)還在我國食品微生物檢測過程中具有廣泛的應(yīng)用，由于傳統(tǒng)的食品檢測技術(shù)具有豐富的實踐，所以在實際檢測過程中，雖然效率性得不到保障，但是仍然具備一定的準(zhǔn)確性，目前我國常用的傳統(tǒng)食品檢測技術(shù)主要分為顯微鏡檢測法和平板培養(yǎng)法，尤其是在平板培養(yǎng)法的應(yīng)用過程中，由于需要對食品進(jìn)行抽樣檢測，并且提取相應(yīng)的微生物組織，所需要的時間相對較長。因此，傳統(tǒng)食品檢測技術(shù)可能不符合現(xiàn)階段我國逐漸發(fā)展的食品檢測流程。不過仍然要對傳統(tǒng)的食品檢測技術(shù)進(jìn)行相應(yīng)的分析，確保一些科技相對最為落后的地區(qū)，能夠通過傳統(tǒng)的顯微鏡檢測法和平板培養(yǎng)法，對食品中的微生物進(jìn)行合理的檢測，保證我國國民的生命健康和食品安全。
1.1 顯微鏡檢測法
顯微鏡檢測法是現(xiàn)階段在微生物檢測過程中較為常用的方法，通過顯微鏡檢測法不僅可以更加直觀的檢測出微生物的數(shù)量和形態(tài)，還可以提高檢測的效率，通過顯微鏡對食品進(jìn)行檢測，存在的優(yōu)缺點主要體現(xiàn)在以下兩個方面：首先，由于在使用顯微鏡檢測的過程中，只需要通過染色油鏡進(jìn)行鏡檢即可，因此，其在檢測時更加具備快捷性和簡便性。即使一些對于微生物檢測方法不太了解的工作人員，在食品進(jìn)行微生物檢測的過程中，只要掌握了顯微鏡的使用方法，也可以明確食品中的微生物形態(tài)及數(shù)量，同時顯微鏡檢測方法由于在我國食品安全的應(yīng)用過程中時間相對較長，所以具備豐富的實踐經(jīng)驗和理論基礎(chǔ)，所以為食品安全檢測工作人員提供了很多的方便。但是顯微鏡檢測方法也具有一定的缺點，例如在針對微生物進(jìn)行檢測的過程中，由于只可以看到微生物的具置和數(shù)量，但是不能夠明確微生物的生存狀態(tài)，一旦過多的活性微生物在食品中，仍然會導(dǎo)致食品具有較大的毒性。所以顯微鏡檢測法作為傳統(tǒng)檢測技術(shù)中的重要組成部分，在后期的使用過程中，可能會具備一定的局限性。同時負(fù)責(zé)顯微鏡檢測法使用的工作人員也應(yīng)該明確現(xiàn)階段產(chǎn)生的新型檢測技術(shù)，并且盡量結(jié)合新型的檢測技術(shù)與顯微鏡檢測法相結(jié)合，確保能夠提高檢測的準(zhǔn)確性和檢測效率，使我國傳統(tǒng)檢測技術(shù)既不會喪失應(yīng)有的價值，又可以更加廣泛的應(yīng)用在現(xiàn)階段的食品微生物檢測中。
1.2 平板培養(yǎng)法
在傳統(tǒng)檢測技術(shù)中的第二種經(jīng)典方法為平板培養(yǎng)法，這是在現(xiàn)階段我國食品微生物檢測中最為經(jīng)典的方法，通過這種方法可以對微生物的具體生存狀態(tài)，數(shù)量以及種類等進(jìn)行明確的判斷。平板培養(yǎng)法的優(yōu)點主要體現(xiàn)在實際的培養(yǎng)過程中，由于可以真正的將食品中的微生物進(jìn)行相應(yīng)的培養(yǎng)，并且明確微生物的具體種類，所以在實際檢測的過程中，可以為食品安全檢測提供一定的理論基礎(chǔ)，但是這種方法也存在很多的缺點，例如使用平板培養(yǎng)法時間相對較長，并且操作也相對較為復(fù)雜，而且針對培養(yǎng)的環(huán)境要求更為苛刻，既需要保證無菌培養(yǎng)又需要在適當(dāng)?shù)臏囟群蜐穸拳h(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，所以在進(jìn)行檢測的過程中降低了檢測的效率，因此，這種傳統(tǒng)的檢測技術(shù)，已經(jīng)不再適用于現(xiàn)階段對所有種類食品進(jìn)行檢測的過程中。由于檢測效率相對較低，現(xiàn)階段這種檢測方法已經(jīng)不再被我國食品安全監(jiān)管部門廣泛使用。
2 食品微生物檢測技術(shù)應(yīng)用現(xiàn)狀
由于傳統(tǒng)的食品微生物檢測技術(shù)在實際使用過程中，缺點相對較為明顯，所以在現(xiàn)階段針對越來越多食品種類進(jìn)行微生物檢測時，由于對效率性要求相對較高，所以隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，也提出了很多新型的檢測技術(shù)，這些新型的檢測技術(shù)不僅可以有效的提高食品微生物檢測的效率，還可以改善食品微生物檢測的準(zhǔn)確性，并且對食品中的微生物狀態(tài)進(jìn)行合理的監(jiān)管，因此，通過這些新型的檢測技術(shù)，在現(xiàn)階段我國食品安全監(jiān)管的過程中，可以有效的提高工作質(zhì)量和工作效率。但是因為目前很多新型檢測技術(shù)，沒有相對經(jīng)驗較為豐富的操作人員進(jìn)行操作和檢測，所以現(xiàn)階段新型的食品微生物檢測技術(shù)應(yīng)用現(xiàn)狀不容樂觀，因此還必須要針對這一問題進(jìn)行合理的改善，確保負(fù)責(zé)食品安全檢測的工作人員能夠有更加豐富的檢測經(jīng)驗，并且對所有的新型現(xiàn)代化檢測技術(shù)更加了解，從而確保在針對食品進(jìn)行檢測的過程中，能夠更加熟練的操作相關(guān)儀器設(shè)備。
2.1 食源性病原菌免疫學(xué)檢測技術(shù)
現(xiàn)階段在食品微生物檢測過程中，導(dǎo)致食品出現(xiàn)較多中毒現(xiàn)象的主要原因是，食源性病原菌的干擾，因此要針對食品中食源性病原菌進(jìn)行免疫學(xué)檢測。在檢測的過程中可以使用以下幾種檢測方法，首先可以使用免疫熒光技術(shù)，這種熒光技術(shù)主要是可以通過相應(yīng)的熒光物質(zhì)標(biāo)記食品中的微生物通過熒光物質(zhì)的標(biāo)記以及熒光物質(zhì)的多少，對食品中微生物的種類和數(shù)量進(jìn)行相應(yīng)的檢測，現(xiàn)階段在我國食品微生物金黃色葡萄球菌，沙門氏菌和李斯特菌的檢測過程中已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，免疫熒光技術(shù)在實際使用過程中，由于敏感性相對較高并且速度相對較快，所以在針對一些較為重要的食品微生物檢測過程中，具備非常重要的作用，但是由于免疫熒光技術(shù)在使用過程中需要利用相應(yīng)的配套設(shè)備，而這種設(shè)備的價格相對較為昂貴，并且在實際操作過程中還需要更加專業(yè)的技能和豐富的經(jīng)驗，所以在實際檢測過程中局限性相對較高。尤其是在針對一些傳統(tǒng)的食品進(jìn)行檢測時，由于食品數(shù)量相對較大，并且種類繁多，如果都使用這種昂貴的技術(shù)設(shè)備進(jìn)行檢測，將會造成食品微生物檢測工作耗費大量的資金成本。
2.2 生物芯片技術(shù)
生物芯片檢測技術(shù)也是近年來發(fā)明的一種高科技技術(shù)，其主要的工作原理是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則，利用不同的方法可以將核苷酸片段放入到相應(yīng)的支持物上，然后再保證其與食品中的微生物進(jìn)行雜交，通過這種方法能夠?qū)z測樣品中的基因進(jìn)行較大規(guī)模的檢測，并且由于其操作相對較為簡單快捷，并且特異性較強(qiáng)，所以在實際檢測過程中可以一次性檢測食品中的多種微生物，同時在檢測完成以后，還可以針對檢測結(jié)果進(jìn)行自動化的分析，但是在實際使用過程中，由于其操作流程相對較為復(fù)雜，并且消耗的時間相對較長，費用昂貴，以及對操作人員的技術(shù)水平要求較高，所以在實際使用過程中也沒有得到廣泛的普及。
2.3 核酸探針技術(shù)
核酸探針技術(shù)與生物芯片技術(shù)的應(yīng)用原理相同，其優(yōu)點也是具備靈敏度高特異性強(qiáng)，但是在實際檢測過程中，對于濃度相對較低的微生物檢測，準(zhǔn)確性較差，所以在針對一些較為重要的食品微生物檢測過程中沒有得到推廣。
2.4PCR技術(shù)
PCR技術(shù)在檢測過程中主要的工作原理是使用了DNA復(fù)制原理，在微生物的體外進(jìn)行DNA復(fù)制過程，然后將目的基因當(dāng)做模板進(jìn)行擴(kuò)增，對擴(kuò)增完成后的結(jié)果使用染色觀察，由于這種技術(shù)在使用過程中成本相對較低，并且操作也相對較為簡單，所以在現(xiàn)階段我國食品微生物檢測時，得到了廣泛的應(yīng)用。
2.5 生物傳感器檢測技術(shù)
生物傳感器檢測技術(shù)的主要工作原理是利用生物傳感器的接收和轉(zhuǎn)換功能，在針對食品進(jìn)行檢測的過程中，可以將食品中的微生物轉(zhuǎn)換成人們能夠識別的信號，在這種技術(shù)應(yīng)用時，由于其準(zhǔn)確度相對較高，并且操作較為簡單，所以能夠更加快速的檢測出食品中造成人們出現(xiàn)病癥的微生物及毒素的含量和種類。
3 食品微生物檢測技術(shù)未來展望
總而言之，現(xiàn)階段我國已經(jīng)研發(fā)出的食品微生物檢測技術(shù)種類相對較多，但是在每一種技術(shù)的應(yīng)用過程中，都具備不同的優(yōu)點和缺點，所以在后期針對食品微生物進(jìn)行檢測時要根據(jù)不同檢測技術(shù)的優(yōu)缺點進(jìn)行合理性的選擇，并且根據(jù)現(xiàn)階段某些檢測技術(shù)存在的缺點，相關(guān)檢測部門和技術(shù)研發(fā)部門也應(yīng)該使用更加高科技的技術(shù)以及先進(jìn)的工作原理，對其進(jìn)行合理的改善，保障我國各種食品微生物檢測技術(shù)，都能夠廣泛的應(yīng)用于食品的微生物檢測過程中，這樣既可以提高我國食品的微生物檢測效率，又可以使我國食品更加具備安全性。因此食品安全管理監(jiān)督部門必須要保證各項技術(shù)能夠在盡量降低檢測成本的前提下，提高準(zhǔn)確性和操作的便捷性，同時還要開發(fā)出性能更加穩(wěn)定的檢測技術(shù)，為確保我國食品安全和國民生命健康奠定良好的基礎(chǔ)。
4 結(jié)束語
綜上所述，現(xiàn)階段，我國食品安全檢測技術(shù)在應(yīng)用過程中，雖然某些技術(shù)沒有得到廣泛的推廣，但是隨著其性能的不斷改善，依然可以應(yīng)用在我國食品微生物的檢測過程中。除了檢測技術(shù)的發(fā)展和改善，食品安全管理監(jiān)督部門，也應(yīng)該給予食品安全問題高度的重視，確保能夠徹底解決善食品安全問題。
參考文獻(xiàn)
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生物質(zhì)的優(yōu)缺點范文3
關(guān)鍵詞:植物組織;RNA;提取
中圖分類號:Q942文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:1005-569X(2010)03-0029-03
1 引 言
RNA是一種重要的遺傳信息分子,細(xì)胞中的RNA可以分為mRNA、tRNA、rRNA三大類,這三大類都存在于細(xì)胞質(zhì)中。因此,植物總RNA提取的實質(zhì)就是裂解細(xì)胞,釋放出RNA,并去除蛋白和DNA等雜質(zhì),最終獲得高純產(chǎn)物的過程。
總RNA是植物分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ),在基因cDNA克隆、基因體外翻譯、cDNA文庫構(gòu)建、cDNA末端快速擴(kuò)增(Rapid amplificathion of cDNA ends, RACE)、差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR(Diferential display reverse transcription-PCR, DDRT-PCR)、抑制性消減雜交(suppression subtractive hybridization, SSH)等研究時均需要高質(zhì)量的RNA(裴東、谷瑞升,2002)。所以,對不同植物材料中RNA提取方法的改進(jìn)一直為研究人員所重視。
提取植物RNA有很多方法,目前應(yīng)用較多的有CTAB法、SDS法、異硫氰酸胍法(張志剛等,2006)、熱硼酸鹽法(李宏、王新力,1999)以及商業(yè)試劑盒Trizol等。由于不同植物、不同植物的不同部位都有其各自的生理結(jié)構(gòu)特點,因此沒有一種方法是適用于所有的植物組織,不能用一成不變的操作去提取不同植物材料的RNA,而必須在熟悉RNA提取基本原理及要點的情況下,根據(jù)各種方法自身的特點,對提取方法進(jìn)行篩選和適當(dāng)?shù)母倪M(jìn),獲得一種對目的材料高效的RNA提取方法(盧圣棟,1999)。
2 RNA常見的提取方法
2.1 異硫氰酸胍法
異硫氰酸胍是強(qiáng)烈的蛋白質(zhì)變性劑,它不僅能強(qiáng)烈抑制RNA酶的活性,還能有效的解離白與核酸的復(fù)合體,與加入的β-巰基乙醇和N-月桂酰基氨鈉(Sarkosy1)共同對RNA產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用。這種方法的優(yōu)點在于有強(qiáng)烈的蛋白質(zhì)變性劑,它能強(qiáng)烈的抑制植物材料及緩沖液中的RNA酶的活性(望飛勇,何勇等,2004)。
2.2 CTAB法
該法以CTAB為變性劑,利用較高濃度的CTAB不僅能對植物細(xì)胞有較好的裂解作用,而且還能有效地分離白與核酸的復(fù)合物,同時沉淀總核酸,然后再選擇性地分離出RNA。CTAB法是核酸提取的常用方法,它不僅適于植物總RNA的大量提取,而且也適于DNA的提取(程水源等,2005)。
2.3 熱硼酸法及改良熱硼酸法
熱硼酸法(黃鳳蘭等,2005)在提取過程中經(jīng)強(qiáng)烈振蕩和溫浴,能提高RNA的產(chǎn)量。該技術(shù)將硼酸緩沖體系、蛋白酶化合物依靠氫鍵形成復(fù)合物,二硫蘇糖醇(DDT)作為還原劑,聚乙烯吡咯烷酮(PVP)可與多酚化合物形成復(fù)合體,它們都可以抑制植物組織中酚類物質(zhì)與RNA的結(jié)合的氧化以及酚類物質(zhì)的氧化(WANG和VODKIN,1994),通過Li+沉淀剩余的酚類物質(zhì),從而與RNA分開。因此,該技術(shù)非常適于富含酚類物質(zhì)的植物組織中總RNA的提取。
2.4 苯酚法
苯酚法(顧紅雅等,1995)是通過苯酚、氨基水楊酸和三異丙基萘硫酸鹽共同抑制RNA,使蛋白與核酸分離,經(jīng)氯仿、苯酚抽提純化,用3mol/L 醋酸鈉來沉淀總RNA。
2.5 陰離子去污劑法
去污劑法(盧圣棟,1993)的去污劑多用SDS,主要作用是使白與核酸復(fù)合物分離,并與β-巰基乙醇、苯酚等共同抑制RNA酶的活性,使蛋白質(zhì)變性,最后經(jīng)氯仿、苯酚抽提純化,用3mol/L 醋酸鈉來沉淀RNA。
2.6 LiCl-尿素法
LiCl-尿素法(姚紅艷等,2003)是用LiCl選擇性地沉淀RNA,用高濃度的尿素,抑制RNA并分離白與核酸。該方法簡單、試劑低廉,但有時會存在DNA污染、丟失一些小分子量的RNA(如5SRNA)以及Li+和Cl-的殘留等問題,可能會干擾mRNA的反轉(zhuǎn)錄和體外翻譯。
2.7 Trizol試劑快速提取法
Trizol試劑快速提取法特點是快速、高效,用高濃度的異硫氰胍破碎細(xì)胞,使RNA酶失活,并沉淀蛋白,乙醇沉淀核酸,DNA酶消化殘留的DNA,去除雜質(zhì),并將RNA吸附到硅化膜上,用DEPC-水溶液洗脫膜上的RNA即可。
2.8 改良的Gomez法
改良的Gomez法(Lpez和Lim,1992)加入巰基基乙醇做還原劑,避免酚類物質(zhì)的氧化。利用SDS對蛋白進(jìn)行變性,多糖通過高濃度的K+和乙醇來沉淀,LiCl專一沉淀RNA時也可將部分多糖留在上清液中。
2.9 CsCl超離提取法
CsCl 超離提取法(歐陽浩鑫等,2004)利用梯度沉降提取植物總RNA,優(yōu)點是提取方法簡單,提取RNA量大。
2.10 植物組織總RNA提取試劑盒
許多公司根據(jù)科研需要,研制出一些提取RNA用的試劑或試劑盒,可根據(jù)需要進(jìn)行選擇。使用試劑盒提取植物組織總RNA的優(yōu)點是提取速度快、用時短,RNA產(chǎn)量和質(zhì)量高;但往往價格很貴、一次提取量少。
3 RNA提取中的常見問題
3.1 酯類物質(zhì)、多糖和蛋白質(zhì)的影響
(1)酚類物質(zhì)的干擾。一般用如Li+、Ca2+等沉淀、離心、苯酚/氯仿抽取等方法去除,但它只能去除未被氧化的酚類物質(zhì),因此在提取總RNA的初始階段要注意防止酚類被氧化。抑制酚類被氧化的方法一般有:a. 還原劑法:一般在提取緩沖液中加入β-疏基乙醇、二硫蘇糖醇(DTT)等還原劑,能有效抑制酚類物質(zhì)的氧化;b. 螯合劑法:采用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)與酚類化合物形成螯合物,使之不能成為多酚氧化酶的底物而抑制它們的氧化,并可在以后的抽提過程中除去這些螯合物;c. 此外還有牛血清白蛋白法(BSA)、Tris一硼酸法、丙酮法均可抑制酚類化合物的氧化。
(2)多糖的干擾。多糖在植物組織中含量豐富,用鹽酸胍處理可以除去一些多糖,用LiCl沉淀可將部分多糖留在上清液中,用低濃度的乙醇可沉淀多糖(SU 和Gibor,1998),也可用醋酸鉀沉淀多糖。Fang等(1992)認(rèn)為緩沖液中高濃度的NaCl或加入一定濃度的2-丁氧乙醇也有助于除去多糖。
(3)蛋白質(zhì)的干擾。在提取緩沖液中加入蛋白質(zhì)變性劑,如異硫氫酸胍、鹽酸胍、硫基乙醇、苯酚、SDS、CTAB等可去除大部分蛋白質(zhì),也可以利用蛋白酶K降解蛋白雜質(zhì),最后再用苯酚/氯仿抽取去殘存的蛋白質(zhì)。
(4)次級代謝產(chǎn)物的干擾。在植物組織中次級代謝產(chǎn)物很容易與RNA結(jié)合并被共同抽提出來,從而阻礙RNA的分離。因不能確定這些次級代謝產(chǎn)物是什么物質(zhì),所以,目前還沒特別好的方法來解決這問題。一般用選擇性沉淀和梯度離心等方法來純化。
3.2 外源物質(zhì)的污染。
(1)研缽、玻璃制品、塑料制品和電泳槽的污染。
(2)研究人員造成的污染。
(3)實驗所配制溶液的污染。
3.3 內(nèi)源物質(zhì)的污染
植物細(xì)胞破碎后細(xì)胞內(nèi)源RNA酶會降解mRNA。對于內(nèi)源RNA酶的污染可以從三個方面著手加以解決:一是選用恰當(dāng)?shù)奶崛》椒?盡量縮短提取時間;二是加入適量的RNA酶抑制劑可有效地抑制RNA酶的活性;三是所有的操作盡量在低溫下進(jìn)行,可降低RNA的活性。
4 RNA純度和完整性的分析
最常用的檢測方法是使用紫外分光光度計檢測RNA樣品OD260和OD280的值,通過計算它們的比值判斷總RNA的純度和含量,如OD260/OD280在1.8~2.0范圍內(nèi),則說明所提取的RNA沒有明顯降解。也可以通過甲醛變性凝膠電泳檢測,根據(jù)分離條帶的完整性和亮度估計其純度和含量,如果含有比較完整的28S rRNA和18S rRNA條帶,且28S rRNA條帶的亮度大約是18S rRNA條帶亮度的2倍,則說明獲得的總RNA質(zhì)量較好。這種方法相對簡單,但靈敏度低,利用溴化乙錠法染色至少需要200ng的RNA。但如果用SYBR、GOLD SYBR和GoldViewna II染色,則能檢測到1 ng和2 ng的總RNA,極大提高了靈敏度。
5 結(jié) 語
高質(zhì)量的RNA是進(jìn)行基因克隆,基因表達(dá)研究等的前提。但由RNA很容易被RNA酶降解,而且RNA酶廣泛存在而且不易變性失活,因此,RNA提取過程中控制RNA酶的活性是極為關(guān)鍵的。在植物RNA提取的不同方法中,CTAB法成本低廉,且能有效地去除樣品中的蛋白質(zhì)、多糖、多酚等物質(zhì),提取的RNA完整性好,純度高,但是步驟繁瑣,耗費時間較長。快速SDS法提取的RNA中可能含有微量Li+和Cl- ,它們會干擾RNA的反轉(zhuǎn)錄和體外翻譯,可向RNA溶液中加入0.1 倍體積3mol/ L 醋酸鈉和2.5倍體積的無水乙醇沉淀,12 000 r/min 離心5min,75 %的乙醇洗滌沉淀1次,用適量DEPC處理的水溶解進(jìn)行進(jìn)一步純化(Zhang和Clarke,2001)。Trizol一步提取法快速、簡捷,所需試劑種類少,提取的RNA純度高、完整性好,結(jié)合高鹽沉淀法可從多糖多酚含量高的樣品中獲取高質(zhì)量的RNA;但Trizol試劑價格比較貴,多應(yīng)用于小量樣品的提取,所得的RNA數(shù)量比較有限,不適合對RNA需求量大的研究(望飛勇,2004)。
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生物質(zhì)的優(yōu)缺點范文4
關(guān)鍵詞：中藥 提取物 溶解性能 分析
0 引言
近年來，運用中藥提取物直接制成制劑越來越廣泛，中藥提取物的溶解性能直接影響制劑的制備工藝、穩(wěn)定性及藥效，但有關(guān)中藥提取物溶解性能的研究報道較少，而對溶解性能考察方法的探討更是缺乏。對混合物質(zhì)的溶解性能研究已經(jīng)廣泛地出現(xiàn)在食品、化工、化學(xué)等領(lǐng)域，研究的主要方法有沉淀法、電導(dǎo)率儀法、粒徑法等，其原理主要是測定混合物質(zhì)的飽和溶解度。目前，未曾見將這些方法應(yīng)用于中藥提取物溶解性能研究的報道。
雷公藤制劑在臨床上多用于治療類風(fēng)濕、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、移植反應(yīng)等多種自身免疫性疾病，其療效已被廣泛認(rèn)可。雷公藤口服制劑因毒副作用較多，在臨床上的應(yīng)用受到很大的限制，因此，雷公藤外用制劑的研究越來越多。本實驗以雷公藤提取物在外用制劑常用試劑中的溶解性能為研究對象，對其溶解性能的考察方法進(jìn)行探討。
1 材料
1.1 儀器電子天平（BT25S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；離心機(jī)（GL-16，上海安亭科學(xué)儀器廠）；數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9140）；超聲波清洗器（KQ3200E，昆山市超聲儀器有限公司）；激光粒度儀（Zetasizer Nano S，馬爾文儀器有限公司）；高效液相色譜儀（Agilent1200，安捷倫科技有限公司）。
1.2 試藥異丙醇(上海溶劑廠，批號20060523)；無水乙醇(安徽安特生物化學(xué)有限公司，批號8512073606)；肉豆蔻酸異丙酯( IPM，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號30158628)；甘油（汕頭市西隴化工廠，批號05120221）；蒸餾水（實驗室自制）；油酸（汕頭市西隴化工廠，批號0304081）；雷公藤提取物（桂林市三棱生物制品有限公司，批號06072）；雷公藤甲素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號111567－200502）。
2 方法與結(jié)果
2.1 方法
2.1.1 沉淀法主要通過向一定量溶劑中加入過量溶質(zhì)進(jìn)行溶解，過濾并恒重未溶解溶質(zhì)，計算溶解量。計算公式為：溶解量＝100×（W溶質(zhì)加入量－W未溶解溶質(zhì)量）/W溶劑質(zhì)量。操作如下：分別稱取雷公藤提取物0.3，0.6，0.6，0.6，0.5，0.5g，各加入4ml水、無水乙醇、異丙醇、油酸、IPM、甘油，30℃超聲20min，放置至常溫，離心，濾過，沉淀物烘干至恒重。
2.1.2 指標(biāo)成分溶解量法雷公藤甲素為雷公藤提取物中的主要有效成分，故以雷公藤甲素為指標(biāo)，考察雷公藤提取物在不同溶劑中的溶解情況，即溶解性能。
2.1.3 粒徑測定法主要通過向一定量各溶劑中加入等量溶質(zhì)使溶解，再進(jìn)行混懸液的粒徑測定，根據(jù)混懸液粒徑分布間接反映溶質(zhì)在不同溶劑中的分散情況，即溶解特性。操作：分別稱取雷公藤提取物0.2g，各加入水、無水乙醇、異丙醇、油酸、IPM、甘油5ml，30℃超聲溶解20min，依參考文測定粒徑。
2.2 結(jié)果
2.2.1 沉淀法測定結(jié)果表明不同溶劑中雷公藤提取物的溶解能力為：無水乙醇＞異丙醇＞油酸＞IPM＞水＞甘油。
2.2.2 指標(biāo)成分溶解量法測定結(jié)果表明不同溶劑中雷公藤提取物中雷公藤甲素的溶解能力為：無水乙醇＞異丙醇＞油酸＞IPM＞水＞甘油。
2.2.3 粒徑測定法測定結(jié)果表明等量雷公藤提取物溶于一劑，形成混懸液的粒徑為：IPM＞油酸＞無水乙醇＞異丙醇（水和甘油對雷公藤提取物的溶解能力較差，形成懸浮液粒徑過大，超出儀器測量范圍）。
3 討論
沉淀法為常用的溶解量測定方法，國標(biāo)GB5750－85和衛(wèi)生部《生活飲用水衛(wèi)生規(guī)范》中用于測定生活飲用水中溶解性總固體的量。該法相比其它兩種測定方法，操作方便快捷，儀器設(shè)備簡單，極其適用于水及其他低沸點溶劑中中藥提取物的溶解量測定，且能全面客觀地反應(yīng)出中藥提取物在各溶劑中的溶解情況。但該法的烘干、恒重步驟給測定高沸點溶劑中中藥提取物的溶解情況帶來一定困難。例：測定雷公藤提取物在油酸(沸點286℃)、甘油(沸點290℃)中的溶解量時，需運用紅外及其它手段進(jìn)行烘干、恒重，無法用常規(guī)烘箱操作。相比粒徑測定法及指標(biāo)成分溶解量法，該法實驗誤差相對較大，且溶質(zhì)消耗量大，不適合貴重藥物及毒性藥物的溶解性能考察。
生物質(zhì)的優(yōu)缺點范文5
現(xiàn)場檢測主要方法有酶抑制速測法（如試紙法、光度法、pH計法）、免疫速測法（如放免、酶免吸附、熒光發(fā)光）、傳感器法（如酶傳感器、免疫傳感器、細(xì)胞傳感器、微生物傳感器）以及化學(xué)速測法等。這些方法在某些檢測項目上，基本上能在較短的時間內(nèi)完成定性、半定量或定量檢測，操作便捷，一般的專業(yè)技術(shù)人員經(jīng)短時間培訓(xùn)就能完成設(shè)備操作，檢測成本低。其缺點是多存在前處理簡單，目標(biāo)物提取不充分，環(huán)境條件不易完全滿足實驗要求，水、電、氣供應(yīng)不便利等諸多不利因素，導(dǎo)致檢測結(jié)果準(zhǔn)確性不高，定性檢測靈敏度偏低。目前市場上食品快檢設(shè)備品種多，但多為單個或單類項目的檢測設(shè)備，單個設(shè)備又不能獨立完成檢測任務(wù)。為克服現(xiàn)場檢測不利因素，提高快速檢測效率，近年，車載作為檢測平臺運用到食品安全現(xiàn)場快速檢測中。由于車載工具空間和負(fù)重大，一定程度上彌補(bǔ)了現(xiàn)場檢測設(shè)備不足的問題；同時，還可以滿足檢測設(shè)備需要的水、電、氣、溫度、濕度等實驗條件。但存在成本高、維護(hù)難、車載精密儀器抗震性較差等問題，因而，限制了其廣泛應(yīng)用。
2食品快速檢測技術(shù)在日常監(jiān)督中的應(yīng)用
2.1食品中農(nóng)藥殘留的快速檢測
目前，市場農(nóng)藥主要分為有機(jī)磷類、有機(jī)氯類、氨基甲酸酯類和擬除蟲菊酯類，約2萬多個品種。在我國食品農(nóng)藥檢測上，國家制訂了《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》標(biāo)準(zhǔn)，對其中136種農(nóng)藥進(jìn)行了嚴(yán)格限定，雖不同食品、不同農(nóng)藥限量要求不同，但殘留限量基本上都小于0.5mg/kg。但較日本、歐盟等西方國家主要還存在檢測的指標(biāo)少，技術(shù)手段有限等問題。日常衛(wèi)生監(jiān)督中，農(nóng)藥殘留檢測方法主要依據(jù)國家快速檢測方法，即速測卡法，因檢測成本低、操作簡單、快速、無需其他儀器等優(yōu)點而應(yīng)用較普遍，其常見農(nóng)藥的檢出限為0-3～3.5mg/kg[13]，而國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的含量普遍限制在0.5mg/kg以內(nèi)，故快速檢測結(jié)果要遠(yuǎn)高于國家規(guī)定殘留限量。因此，可用來對食品農(nóng)殘測定定性和初篩。另外，酶抑制分光光度法、化學(xué)速測法、生物傳感器、免疫分析等方法在日常衛(wèi)生監(jiān)督中也有使用報道，但因靈敏度低、選擇性差、方法難以標(biāo)準(zhǔn)化等缺陷而不能廣泛推廣。例如，用酶抑制法檢測食品中的重金屬，因重金屬種類多，不易找到對多種金屬都敏感且重復(fù)性好的酶，如用一種酶檢測一種金屬，就遠(yuǎn)達(dá)不到快速檢測目的，另外還存在目標(biāo)物質(zhì)的提取率低、干擾性大等諸多亟待解決的問題。
2.2食品中獸藥殘留的快速檢測
我國是畜禽產(chǎn)品生產(chǎn)大國，獸藥殘留引起的食品安全問題也是困擾我們多年的問題。通常講的獸藥殘留物，主要是抗生素、激素等7類藥物。農(nóng)業(yè)部第235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》標(biāo)準(zhǔn)中，對94種獸藥制定了最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，同時規(guī)定9種獸藥不得檢出。在日常衛(wèi)生監(jiān)督中，獸藥殘留快速檢測方法主要是免疫學(xué)方法，其中膠體金免疫色譜試驗測定法（也叫膠體金試紙、速測卡）、酶聯(lián)免疫吸附測定法使用最普及，其方法方便、敏感、特異，并設(shè)計有質(zhì)控區(qū)以排除操作不當(dāng)或速測卡失效帶來的檢測結(jié)果不準(zhǔn)問題。目前，已有硫酸鏈霉素等18種獸藥殘留快速檢測試劑盒以及鹽酸克侖特羅等18種快速檢測速測卡得到廣泛應(yīng)用，其檢測時間一般在1～15min，檢出限能達(dá)到ng級，檢測物包括畜禽肉、魚肉、奶制品、禽蛋、飼料等。
2.3食品中有毒有害微量元素的快速檢測
食品中有毒有害的微量元素一般指對人體有顯著毒性的元素，例如砷、汞、鎘、鉛、鋅、銅、鉻、鋇、銻等元素，常見的汞化合物(如甲基汞)、砷化物（如砒霜）、鎘（如“鎘大米”）等。主要來源于工業(yè)排放及電池、電器等日常用品對環(huán)境的污染，通過植物系統(tǒng)遷移轉(zhuǎn)化、累積放大，最后由食入的食物和水危害到人體。目前，快速檢測方法主要是試劑盒方法，適用范圍主要是食物、水及中毒殘留物的快速檢測，該方法一般只能做到定性或半定量；還有報道生物傳感器技術(shù)、酶抑制法等方法，這些方法和技術(shù)雖現(xiàn)場得到運用，但穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、以及使用壽命短等缺點還需不斷改進(jìn)和加強(qiáng)。
2.4食品中微生物的快速檢測
從近年國家衛(wèi)生部公布的食物中毒起因分析，微生物污染是食物中毒的首要因素。微生物檢測涉及的指標(biāo)主要有菌落總數(shù)、大腸菌群和致病菌三項。因傳統(tǒng)檢測的時效性差，在日常衛(wèi)生監(jiān)督中快速檢測技術(shù)尤顯重要，目前市場應(yīng)用的快檢方法多，差別大，各有優(yōu)缺點。如免疫檢測技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)、生物傳感器技術(shù)、蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)、快速測試片法、全自動微生物分析系統(tǒng)等，在檢測時間上，雖較傳統(tǒng)方法大大縮短了檢測時間，但還不能滿足現(xiàn)場衛(wèi)生監(jiān)督的需要。
2.5食品添加劑快速檢測
食品添加劑本是為了改善食品品質(zhì)和色、香、味，以及為防腐保鮮和加工工藝的需要而加入食品中的化學(xué)合成或天然物質(zhì)，必須符合《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》GB2760及歷年增補(bǔ)規(guī)定。但從當(dāng)前我國食品添加劑存在問題看，主要是非法添加和濫用。
2.5.1非法食品添加物的快速檢測
目前，我國市場上常見非法添加物主要有甲醛、吊白塊（次硫酸氫鈉甲醛）、蘇丹紅、三聚氰胺、溴酸鉀、罌粟殼等。日常衛(wèi)生監(jiān)督中，現(xiàn)場快速檢測方法主要有速測管法（按國標(biāo)方法制成的）、試紙法、速測卡法等。常規(guī)檢測項目有：奶制品的三聚氰胺檢測，豆制品、粉絲、面條等的吊白塊檢測，水發(fā)產(chǎn)品的甲醛檢測，辣椒制品、咸鴨蛋（蛋黃）的蘇丹紅檢測，飲料中水溶性非食用色素檢測等。
2.5.2易濫用的食品添加劑快速檢測
濫用的食品添加劑主要有：防腐劑、著色劑、膨松劑、增稠劑、甜味劑、漂白劑等。日常衛(wèi)生監(jiān)督中，現(xiàn)場快速檢測方法同上。常規(guī)需檢測食品有：罐頭、干貨食品、白糖中的二氧化硫檢測，肉制品、鹵制品中的硝酸鹽、亞硝酸鹽檢測，泡菜、腌菜中的著色劑、防腐劑和甜味劑檢測，糕點類的膨松劑、增稠劑和甜味劑檢測，饅頭中使用的漂白劑硫磺熏蒸等檢測項目。以上這些常規(guī)檢測中，操作較簡便，但檢出限得不到要求，可以作為初篩檢測。石亞麗等綜述了生物傳感器技術(shù)在食品添加劑檢測中的應(yīng)用，從報道看生物傳感器技術(shù)有快速、線性關(guān)系好、檢出限低等優(yōu)點，但缺點也較突出，還沒有得到很好的推廣。
2.6其他與食品相關(guān)的有毒有害物質(zhì)的快速檢測
日常衛(wèi)生監(jiān)督中，除以上檢測項目以外，還有像生物毒素、餐飲具潔凈度、消毒效果評價等方面檢測項目。生物毒素中，通常檢測項目有：肉毒素的快檢、金黃色葡萄球菌腸毒素的快檢、黃曲霉素的快檢、河豚毒素的快檢等，方法主要以酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。林壯森等把酶聯(lián)免疫吸附法與其他方法進(jìn)行比較，優(yōu)勢明顯。柳潔等對市售大米、面粉、食用油樣品中AFB1的污染狀況用酶聯(lián)免疫吸附法檢測分析，回收率為74.6%～109%，加標(biāo)樣品6次平行測定的RSD分別為0.63%～2.8%；楊運云[28]等用酶聯(lián)免疫法檢測蓖麻毒素，檢出限為0.02mg/L，都證明了酶聯(lián)免疫法的優(yōu)勢。餐飲具潔凈度檢測的方法主要是三磷酸腺苷熒光檢測法（ATP法），操作簡單、靈敏度、精確度都很高。
3食品快速檢測技術(shù)的發(fā)展方向
食品快速檢測技術(shù)發(fā)展到今天，無論在設(shè)備的種類、數(shù)量上，還是在方法創(chuàng)新研究上，都有較大的發(fā)展。目前，在食品快檢領(lǐng)域，檢測項目達(dá)到100多種，常用的檢測項目也有60種左右。總體看，食品安全快速檢測設(shè)備的發(fā)展將呈現(xiàn)小型化、集成化、模塊化、自動化、信息化等趨勢。衛(wèi)生監(jiān)督中亟待解決的快速、實時、動態(tài)、精確檢測技術(shù)將是未來發(fā)展方向。
3.1向?qū)嵱谩⒈銛y、模塊、項目齊全的方向發(fā)展
設(shè)備的設(shè)計，在外型上將向能適應(yīng)復(fù)雜環(huán)境、多任務(wù)的要求，且方便攜帶、運輸；在外包裝上要充分考慮防水、抗壓、耐磨的實際需要，應(yīng)提高設(shè)備在潮濕、高寒地區(qū)的穩(wěn)定性，并提供不同環(huán)境條件下儀器設(shè)備的工作參數(shù)，以便操作人員根據(jù)現(xiàn)場條件進(jìn)行結(jié)果修正；在檢測項目方面將向多、全方向發(fā)展，如感官、理化、毒理、微生物等指標(biāo)，可以以模塊、單元的形式出現(xiàn)，可任意組合，以滿足不同工作任務(wù)需要。不同單位可以根據(jù)自身工作任務(wù)的特點，選擇性地配備不同模塊，或者依據(jù)檢測項目要求定制食品快檢設(shè)備。
3.2向快速、實時的方向發(fā)展
日常衛(wèi)生監(jiān)督中，樣本檢測時效性強(qiáng)，也就是要求能在盡可能短的時間內(nèi)實時對食品進(jìn)行現(xiàn)場快速檢測，并能及時給出檢測結(jié)果。那些耗時長，不能及時出結(jié)果的檢測技術(shù)將逐漸被更快速的檢測技術(shù)所取代。例如現(xiàn)行的微生物檢測方法，在確保靈敏度和準(zhǔn)確性的前提下，將逐漸被短時間能出具結(jié)果的檢測方法所取代，有人報道生物傳感器技術(shù)的應(yīng)用，該方法30min就能出結(jié)果，遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于目前通用方法24h或更長時間出結(jié)果。
3.3向靈敏度、精確度更高的方向發(fā)展
目前，國內(nèi)外現(xiàn)場快檢設(shè)備主要通過試紙比色法、分光光度法等方法進(jìn)行檢測，在靈敏度和精確度上都需要進(jìn)一步提高。往往靈敏度高的，重復(fù)性較差、精確度也較低；而精確度較高的，靈敏度又較低。未來的檢測設(shè)備的發(fā)展首先要考慮靈敏度，以降低漏檢率，確保有問題的檢測樣品不會漏檢，能在第一時間發(fā)現(xiàn)問題。在確保靈敏度基礎(chǔ)上要向更精確的方向發(fā)展，定性指標(biāo)，誤差不能高于5%，定量指標(biāo)，誤差不能超過10%。
3.4樣品前處理將向標(biāo)準(zhǔn)化、自動化方向發(fā)展
樣品前處理對于食品安全檢測結(jié)果影響很大。由于現(xiàn)場樣品前處理缺乏規(guī)范，各類現(xiàn)場檢測設(shè)備對前處理要求不一，快檢結(jié)果差異較大。因此，前處理技術(shù)必需針對不同類型樣品的現(xiàn)場前處理進(jìn)行明確規(guī)范，形成標(biāo)準(zhǔn)化操作程序。同時，應(yīng)多采用自動化程度高、處理效果好的前處理設(shè)備。當(dāng)前普遍采用的手工前處理方法，處理時間過長，處理效果較差，檢測目標(biāo)物提取不完全，檢測結(jié)果偏移較大。目前，實驗室前處理使用的自動粉碎、半自動研磨、自動攪拌、低速離心、超聲萃取等設(shè)備，種類較全，效果較好，將其小型化后應(yīng)用于現(xiàn)場檢測也將是一個發(fā)展方向。近年，固相微萃取技術(shù)（SPME）在食品檢測前處理方面發(fā)展較快，特別是微量成分萃取，如食品的風(fēng)味、食品中的農(nóng)藥殘留、食品中的有機(jī)物等方面優(yōu)勢明顯，隨著SPME使用的固定相涂層種類增多，SPME技術(shù)將可能與更多的分析儀器聯(lián)用，實現(xiàn)自動化，這也是樣品前處理的一個發(fā)展趨勢。
4結(jié)束語
生物質(zhì)的優(yōu)缺點范文6
關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)雙向電泳；植物蛋白質(zhì)樣品制備；TCA/丙酮法；酚抽法
中圖分類號：Q51 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.06.002
Abstract： Two-dimensional electrophoresis is the fundamental technology of proteomics， it makes great progress in protein analysis of animals and microbes. However， it makes little progress in protein analysis of plants due to the hardness of the preparation of plant protein’s samples suited for two-dimensional electrophoresis. In this paper， methods for the preparation of plant protein's samples were reviewed， merits and drawbacks of these methods were analyzed， and the research focus on the preparation of plant protein's samples in the future was putted forward.
Key words： two-dimensional electrophoresis； preparation of plant protein's samples； TCA acetone precipitation method； phenol method
隨著人類基因組框架圖的公布和擬南芥等模式生物基因組序列測定的完成，生命科學(xué)研究逐漸進(jìn)入后基因組時代。盡管已有多種植物的基因組被測序，但在這些植物基因組中往往有一半以上基因所表達(dá)的功能是未知的。而蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者，是生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者，是揭開基因表達(dá)功能的一把金鑰匙。直接研究蛋白質(zhì)的表達(dá)模式和功能模式成為生命科學(xué)發(fā)展的必然趨勢。蛋白質(zhì)組的研究應(yīng)運而生，而研究蛋白質(zhì)組的科學(xué)則被稱為蛋白質(zhì)組學(xué)[1-2]。
由于蛋白質(zhì)組學(xué)是從整體層面研究細(xì)胞、組織、器官甚至個體內(nèi)的蛋白質(zhì)表達(dá)變化，所以需要強(qiáng)有力的方法來分離和顯示上千種蛋白質(zhì)。而蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)具有高分辨率、快速和簡單的優(yōu)點，因而成為蛋白質(zhì)組學(xué)的支撐技術(shù)。目前雙向電泳技術(shù)在微生物和動物蛋白質(zhì)分析上取得較大進(jìn)展，但在植物蛋白質(zhì)分析上往往難以取得比較理想的實驗效果，使得植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究相對落后于動物和微生物蛋白質(zhì)組學(xué)研究。究其原因，主要是植物組織（尤其是綠色葉片）中含有多酚類、醌、脂類及其他多種次生代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)一旦存在于植物蛋白質(zhì)樣品中就會嚴(yán)重干擾蛋白分離效果及電泳圖譜質(zhì)量，無法很好地顯示出植物中各種蛋白質(zhì)之間的差異。同時，植物組織中存在的蛋白酶能夠水解目的蛋白，降低蛋白質(zhì)樣品的純度。由此可見，植物蛋白質(zhì)樣品的制備是植物蛋白質(zhì)雙向電泳實驗的關(guān)鍵，只有制備到純度高、雜質(zhì)少的蛋白質(zhì)樣品才可能獲得質(zhì)量高的電泳圖譜。因而有必要歸納和總結(jié)適于雙向電泳的植物蛋白質(zhì)樣品制備技術(shù)，便于研究者根據(jù)實際情況選擇合適的樣品制備方法，獲得良好的電泳分離效果和高質(zhì)量的電泳圖譜[3-4]。
1 植物蛋白質(zhì)樣品制備方法
植物蛋白質(zhì)樣品的制備，要準(zhǔn)確分析蛋白質(zhì)樣品來源的成分，在維持目的蛋白活性和結(jié)構(gòu)不變的基礎(chǔ)上逐步去除無關(guān)物質(zhì)，獲取合適的蛋白質(zhì)樣品。在長期的植物蛋白質(zhì)組研究中，研究者們根據(jù)研究的對象和目的，在實驗中逐漸摸索，發(fā)明并改進(jìn)了5種常用的樣品制備方法。
1.1 TCA/丙酮法
TCA/丙酮法的原理是利用蛋白質(zhì)在丙酮溶液的疏水條件下變性使蛋白質(zhì)濃縮并去除污染物。根據(jù)謝進(jìn)等[5]的實驗，TCA/丙酮法主要操作步驟是：洗凈植物組織，使用液氮速凍，進(jìn)行低溫條件下研磨或超聲處理，加入以TCA/丙酮為主要成分的溶液振蕩混勻，沉淀過夜，再低溫離心去上清，反復(fù)操作洗滌沉淀到丙酮溶液無色為止，敞口揮發(fā)丙酮，再將沉淀凍存。實驗操作應(yīng)當(dāng)在低溫環(huán)境下用盡量短的時間完成，以免蛋白質(zhì)大量變性。
1.2 酚抽法
酚抽法的原理是利用了蛋白質(zhì)和脂類溶于酚相而難溶于水相的特性。鹽類、核酸、多糖通過溶于水而被去除，脂類通過溶解在乙酸銨甲醇溶液中被去除，再用冷丙酮溶解去除色素和銨離子。操作步驟是：洗凈植物組織，使用液氮速凍，進(jìn)行低溫條件下研磨或超聲處理成粉末狀，轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，加入蛋白質(zhì)提取液振蕩混勻，再加入等體積的Tris-飽和酚，冰浴，振蕩混勻，低溫離心處理，逐步抽取酚相，向酚相加入乙酸銨甲醇溶液低溫沉淀過夜，低溫離心后獲取沉淀。將沉淀用預(yù)冷丙酮多次洗滌，敞口使丙酮揮發(fā)，將沉淀低溫保存[6]。彭存智[7]在運用酚抽法提取紅樹葉蛋白時將Tris-飽和酚換為酸性的水飽和酚，而劉楠等[8]在運用酚抽法提取蒙古沙冬青根蛋白時將洗滌沉淀的丙酮換為甲醇溶液，也取得預(yù)期的實驗效果。在使用酚抽法時，應(yīng)當(dāng)增加離心力和離心時間，盡可能地把密度大的糖分離至上清液的上層。
1.3 Tris-HCl法
Tris-HCl法的基本原理是利用去污劑SDS破壞疏水鍵，增加蛋白質(zhì)的溶解性，而Tris-HCl平衡pH值，防止蛋白質(zhì)變性。根據(jù)曾廣娟等[9]和田忠景等[10]的實驗，Tris-HCl法的主要操作步驟是：洗凈植物組織，使用液氮速凍，進(jìn)行低溫條件下研磨或超聲處理成粉末狀，轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，并加入SDS、甘油和Tris-HCl為主要成分的緩沖液，振蕩混勻，低溫離心處理后提取上清，加入TCA/丙酮混勻，低溫離心后獲取沉淀。將沉淀用80%預(yù)冷丙酮多次洗滌，室溫風(fēng)干，低溫保存。
1.4 Trizol沉淀法
Trizol是一種新型RNA抽提試劑，可以直接從組織中提取RNA。它促進(jìn)不同種屬不同分子量大小的多種RNA的析出，通過分層分別將不同層中的RNA（上層）、DNA（中層）、蛋白質(zhì)（下層）分離純化出來，效率極好。根據(jù)周雪等[11]和康俊梅等的實驗[12]，Trizol沉淀法的主要操作步驟是：洗凈植物組織，使用液氮速凍，進(jìn)行低溫條件下研磨或超聲處理成粉末狀，轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，先后按比例加入Trizol和氯仿，振蕩混勻，低溫離心處理后去除上層水相中的RNA，加入無水乙醇沉淀去除中間層和下層酚相中的DNA和與之結(jié)合的高豐度的組蛋白，振蕩混勻，低溫離心處理后提取上清，先后按比例加入Trizol和異丙醇，振蕩混勻，低溫離心處理后提取沉淀，沉淀用95%乙醇和無水乙醇洗滌，真空干燥后低溫保存。
1.5 尿素-硫脲提取法
尿素-硫脲提取法的基本原理是利用尿素和硫脲破壞疏水鍵、還原劑DTT破壞二硫鍵增加蛋白質(zhì)的溶解性，并使得蛋白酶失活。根據(jù)劉偉霞等[13]和王海玲等[14]的實驗，尿素-硫脲提取法的主要操作步驟是：洗凈植物組織，使用液氮速凍，進(jìn)行低溫條件下研磨或超聲處理成粉末狀，轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，溶于尿素、硫脲、SDS、DTT、Triton-114為主要成分的溶液中，振蕩混勻，低溫離心處理后提取上清，加入預(yù)冷丙酮，低溫過夜，離心后收集沉淀，揮發(fā)掉丙酮。樣本中存在尿素，溶液溫度不能超過37°C。
TCA/丙酮法是促使蛋白質(zhì)在水中沉淀進(jìn)而分離的方法，屬于沉淀類方法；酚抽法和Trizol沉淀法是利用酚類物質(zhì)萃取蛋白質(zhì)進(jìn)而分離的方法，屬于萃取類方法；Tris-HCl法和尿素-硫脲提取法是促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解于水進(jìn)而分離的方法，屬于溶解類方法。
除此以外，Wei等[15]將TCA/丙酮法與酚抽法結(jié)合為TCA-丙酮-酚抽法后用于提取蛋白。楊秋玉等[16]提取4種杜鵑葉片蛋白質(zhì)時就采用TCA-丙酮-酚抽法：即先采用TCA-丙酮法沉淀蛋白，凍干后按照酚抽法的程序萃取蛋白。提取的蛋白質(zhì)樣品再進(jìn)行雙向電泳，獲得比較理想的電泳效果。TCA-丙酮-酚抽法兼有沉淀類方法和萃取類方法的特點。
2 植物蛋白質(zhì)樣品制備方法比較
植物組織的蛋白質(zhì)是動態(tài)的，至今沒有一種通用的制備方法能將材料中的蛋白全部提取出來。研究目的的不同，是盡可能獲得多的蛋白還是僅獲得興趣蛋白，影響了制備方法的選擇。但是無論是采用哪種方法，有一點必須做到的是盡可能多地去除核酸、多糖、多酚類、脂類、鹽類等雜質(zhì)，否則會影響蛋白分離效果和電泳圖譜質(zhì)量。不同的研究對象含有的雜質(zhì)不同，因此也影響了制備方法的選擇。
TCA/丙酮法是植物蛋白質(zhì)樣品制備最基本的方法。它的優(yōu)點是耗時少、容易操作，減少了蛋白酶的修飾作用，蛋白質(zhì)粗提物產(chǎn)量大，一般作為植物蛋白提取的初始方案。缺點是蛋白質(zhì)容易變性，很難重新溶解，對一些植物組織中多酚類物質(zhì)的去除能力有限，因而可以加入適量的吸附劑PVPP或PVP對TCA/丙酮法進(jìn)行改良。劉國勇等[17]的實驗證實不溶于水的PVPP去除酚、醌類物質(zhì)的效果比可溶于水的PVP好。
酚抽法的優(yōu)點是能夠去除大量干擾物質(zhì)，獲得相對較多的低分子量蛋白。在植物組織含有大量易水解的多糖或易溶于水的鹽類時如海濱木槿和枇杷葉片組織[18-19]，酚抽法能夠?qū)⑵漤樌胨喽コＬ貏e是含有大量多酚類、多糖和色素等次生代謝產(chǎn)物的頑拗植物組織，在蛋白分離效果方面酚抽法比TCA/丙酮法優(yōu)勢明顯。缺點是操作復(fù)雜耗時，Tris-飽和酚具有一定的毒性，易對環(huán)境造成污染。
Tris-HCl法的特點是加入SDS以增強(qiáng)蛋白質(zhì)的溶解性，Tris-HCl緩沖液平衡pH值，遠(yuǎn)離各種氨基酸溶解度最小的等電點，因而其優(yōu)點是能夠分離出酸性蛋白、極高極低分子量蛋白，在疏水性蛋白的提取方面也有所改善，缺點是緩沖液需要密封保存。
Trizol沉淀法的特點是使用能夠分離DNA和RNA的Trizol試劑，因而優(yōu)點是能夠去除大量干擾物質(zhì)如DNA、RNA和高豐度組蛋白Rubisco。缺點是操作較為復(fù)雜，耗時耗力，成本較高。Trizol沉淀法用得比較少，一般用于植物葉片和幼苗的蛋白質(zhì)提取，如野牛草葉片、紫花苜蓿幼苗和黃花苜蓿幼苗[12，20-21]。
尿素-硫脲提取法的優(yōu)點是對低分子量蛋白質(zhì)分辨效果較好，價格低廉，操作簡便。缺點是在電泳中能夠檢測到的蛋白質(zhì)斑點較少，對多酚類、色素、鹽類等干擾物質(zhì)的去除能力不夠。從文獻(xiàn)中來看，尿素-硫脲提取法用得比較少。
TCA-丙酮-酚抽法則將TCA-丙酮沉淀法和酚抽法融合在一起，去除引起樣品溶液黏稠的多糖和核酸效果較好，在樣品溶液過于黏稠時相比于酚抽法具有一定的優(yōu)勢[16]。但該法也存在著操作繁瑣、蛋白損失較大的缺點。此方法在擬南芥葉片、非洲山毛豆葉片、銀杏小孢子葉球[22-24]等很多植物蛋白的提取中均取得了較好效果。
3 結(jié)論與展望
到目前為止，適于雙向電泳的植物蛋白質(zhì)樣品制備方法總共有6種，它們分別是：TCA/丙酮法、酚抽法、Tris-HCl法、Trizol沉淀法、尿素-硫脲提取法、TCA-丙酮-酚抽法：TCA/丙酮法是最基本、應(yīng)用最為廣泛的方法，蛋白質(zhì)粗提量大，加入PVPP可以去除多酚類；酚抽法適合于含有大量多糖、鹽類等次生代謝產(chǎn)物的植物蛋白質(zhì)樣品提取；Tris-HCl法能夠分離出酸性蛋白和極高極低分子量蛋白；Trizol沉淀法適合于含有大量高豐度組蛋白Rubisco的植物葉片和幼苗的蛋白質(zhì)提取；尿素-硫脲提取法能夠分離出低分子量蛋白且操作簡便；TCA-丙酮-酚抽法去除引起樣品溶液黏稠的多糖和核酸效果較好。
在現(xiàn)在的植物蛋白質(zhì)雙向電泳的實驗中，研究者往往需要同時運用多種方法進(jìn)行樣品制備并進(jìn)行比較。希望在日后的研究中，研究者能夠在前人研究的基礎(chǔ)上，依據(jù)樣品自身的特性次生代謝物成分和研究目的總結(jié)歸納各種方法的適用范圍，做到具體問題具體分析，摸索優(yōu)化出適合各種植物組織蛋白質(zhì)樣品制備的實驗方案，加快植物蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展，更好地服務(wù)于生命科學(xué)研究。
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