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經典遺傳學和表觀遺傳學范文1

教學過程中經典理論教學與專題討論課教學這兩條主線需要相互配合，相得彰宜。因此，對于文獻專題的選則應當把握三個原則：所選文獻專題確系當今醫學、生命科學研究領域的前沿與熱點問題（高于課本）；專題與經典理論相聯系（不脫離課本）；專題內容為教學過程中學生興趣較濃、質疑較多而課本講授深度有限的內容（符合學生興趣）。在一門課程教學的具體實施中，根據以上三個原則，由教學組全體教師共同擬定4-5個文獻專題，而后在國際權威科學雜志如《自然》、《科學》及《細胞》上就每一個專題選擇近年來發表的5篇文獻，并指定各專題的輔導教師。文獻內容以能夠體現該專題重要科學概念、里程碑式科學發現及先進的研究技術方法為標準。文獻選定后，由學生依據自身興趣自主選擇，就某一專題形成興趣小組。經過一段時期的分組學習及教師輔導，最終由每個小組推選兩名報告人，在本專題內選定兩篇精讀文獻，以科研論文討論的形式進行學生課堂匯報。例如在《分子遺傳學》的理論教學中，講授了“表觀遺傳學”內容，但囿于課本內容的深度及課時數，僅介紹了其基本概念和發展簡史。然而，學生在課后提問中表現出強烈興趣，該專題也無疑是當今生命科學研究領域的熱點研究問題。

2學生課堂匯報

學生課堂匯報安排在復習指導課之前1-2周，讓學生在結束文獻精讀訓練后，轉而全身心投入復習考試過程。匯報課由主講教師主持，學生代表依次上臺，以幻燈為輔助進行匯報陳述，教研室主任、教授及教學組全體教師共同參與討論，并給予點評。以上述表觀遺傳學文章為例，學生代表先介紹了完成該研究工作的美國研究小組，而后介紹了與課題密切相關的研究背景：組蛋白（Histone，H）泛素化與組蛋白甲基化，與理論課上講授的基本概念密切相關。作者在《分子遺傳學》的DNA結構中講過，一個核小體由兩個H2A，兩個H2B，兩個H3，兩個H4組成的八聚體和147個堿基（bp）纏繞在外面的DNA組成。在哺乳動物基因組中，組成核小體的組蛋白游離在外的N－端可以受到乙酰化，甲基化，磷酸化，泛素化等修飾，從而影響基因的轉錄活性。而本篇文獻則重點討論H2B泛素化與H3甲基化之間的關系。在對研究結果的講解中，學生用逐步深入的科學問題作為邏輯主線，體現出文章作者的科學研究思路。作者首先根據H2B泛素化影響H3甲基化這一保守的生物現象，提出了三種假說：①調節泛素化的Rad6復合物可影響調節甲基化的COMPASS復合物中Set1組分的活性；②Rad6復合物可影響COMPASS復合物中其它組分的活性；③Rad6復合物影響COMPASS復合物中各組分的組裝、穩定性及活性。而后，作者采用酵母Rad6突變體與野生型相對照，利用色譜分析、蛋白雙向電泳、染色質免疫共沉淀等生物技術，對三種假說依次進行驗證和排除，最終揭示Rad6復合物通過影響COMPASS復合物中Csp35這一關鍵組分與染色質的結合，實現H2B泛素化對H3甲基化的調控作用。通過文獻精讀，學生從表觀遺傳學的基本概念（如組蛋白甲基化、泛素化）出發，進入到基本而又深刻的科學問題，了解到上述確切的科學研究結論，以及尋找科學結論所需的生物技術方法。這個學習過程，在引申了經典理論知識的同時，教會了學生自主學習前沿知識的方法，有效地培養了本科學生的科學研究素質。

3文獻討論、點評

在文獻討論過程中，鼓勵學生最大限度的發揮主動性與創造力，發表自己的見解。以上述表觀遺傳學文章為例，H2B泛素化對于H3甲基化的影響不僅存在于第4位賴氨酸上（H3K4），也存在于第79位賴氨酸上，而該文獻的研究對象僅限于前者。有學生在完成文獻精讀后，就H2B泛素化對H3K79甲基化的影響機制提出了自己的假說。教師對于有獨到見解，甚至能提出假說的學生給予高度贊揚，并鼓勵其撰寫科學假說論文，進一步鍛煉自己的科研素質。在每一名學生的匯報及討論結束后，教研室主任、教授給予點評，在肯定其優點的同時指出存在的問題和不足。問題通常表現在背景知識介紹不充分、邏輯主線不明晰、以及研究方法講解不清等方面。

4結語

經典遺傳學和表觀遺傳學范文2

隨著對白血病發病機制的深入研究及其治療方案的改進,白血病的完全緩解率也有明顯的提高,但仍有一部分患者最終會復發。近年來的研究發現, 白血病的復發與微小殘留病密切相關。微小殘留病(minimal residual disease, MRD )是指經過誘導治療達臨床緩解時，白血病患者體內殘留的少量白血病細胞。對患者進行微小殘留病監測對白血病的治療和預后判斷具有非常重要的意義。檢測MRD的關鍵是尋找分子基因標志。細胞免疫表型及遺傳學的異常改變在急性白血病MRD 檢測中占有重要地位。令人遺憾的是，這些方法只適用于少數患者，大多數患者并不具備遺傳學的預后指標。隨著對急性白血病分子生物學發病機制研究的進步，人們把急性白血病的發生歸結為抑癌基因和原癌基因通過遺傳學和表觀遺傳學機制的發生異常改變［1］。DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳調控機制，其與腫瘤發生、發展以及檢測相關機制的研究逐步成為研究的熱點。表觀遺傳學生物標記（Epigenetic biomarkers），特別是DNA 甲基化相關標記檢測擁有遺傳學標記、抗體等標志不具備的優勢。本文就MRD細胞分子遺傳學的檢測方法及DNA甲基化檢測MRD的臨床應用進行綜述。

1 常用白血病MRD檢測方法的研究進展

1.1 分子生物學方法：遺傳學的改變，包括染色體易位/缺失、基因突變等是白血病發生的基礎，其所導致的正常基因表達調控紊亂和功能異常是白血病發生的主要原因。異常的遺傳學改變，已成為急性白血病臨床檢驗資料的重要組成部分。

實時定量聚合酶鏈反應( RQ-PCR ) 方法結合了PCR和熒光探針兩種技術，通過定量檢測白血病細胞中標志性基因實時觀測MRD，是目前檢測MRD最為敏感的方法，靈敏度可達10-4-10-5，已成為臨床實驗室建立MRD檢測方法的首選。其檢測的基因標志包括：（1）染色體異位形成的融合基因。如t(9:22), t(15;17),inv(16), and t(8;21)，T 細胞受體（T-cell receptor ，TCR）重排等，常見的融合基因包括: TEL /AML1、BCR /ABL、E2A /PBX1、MLL /AF4等。（2）在白血病中表達增高的腫瘤基因(如PRAME、 WTI 、PRAME、NPM1、STC- 1 等基因。（3）發生突變的基因(如FLT3 /ITD)。融合基因直接反映了白血病的病理特征,他在疾病發展過程中比較穩定,以其作為PCR檢測MRD的分子標志具有特異性強、敏感度高的優點［2］。但是這些檢查不僅價格昂貴，其檢測的標本為RNA，存在不易保存，結果不穩定的缺點。更令人遺憾的是,由于白血病是一組異質性很大的惡性血液病，各亞型之間遺傳背景不同，這些遺傳學基因標志只能覆蓋1/3的白血病類型，還有2/3類型的白血病不具備遺傳學基因標志，無法在臨床上進行MRD的檢測。即使聯合應用多種基因仍有40%～50%的患者無法找到適當的基因標志檢測MRD，使其疾病狀態缺乏準確的判斷依據。

1.2流式細胞術( FCM)：FCM是通過檢測在正常細胞上不表達或低表達而在白血病細胞上表達或高表達的白血病相關免疫表型來定量檢測MRD，能夠準確定量殘留白血病細胞數，并且還能了解殘留白血病細胞的凋亡情況［3］。其優勢是每秒可檢測5 000～10 000個細胞,并能用計算機記錄處理,快速地對各個細胞進行多參數定量分析,靈敏度達到10- 4。但應用此法必須要對患者初發時的免疫表型特征有詳盡了解,以便選擇適當的標志檢測MRD。因為白血病細胞與正常細胞相比, 通常低達10- 5～10- 6, 可能低于FCM檢測范圍而使這種方法缺乏特異性; 而且隨著病程發展, 細胞表面的抗原發生改變, 會導致假陰性結果。

2 異常DNA甲基化檢測白血病MRD的臨床研究進展

DNA甲基化是指在DNA序列不變的情況下，通過影響基因轉錄活性以調控基因的表達。DNA甲基化作為一種表觀遺傳學改變與白血病的發生密切相關，在不改變遺傳信息的前提下導致細胞遺傳特性改變，作為腫瘤性疾病"二次打擊"經典假說的重要補充，已成為白血病研究的新熱點。DNA異常高甲基化導致抑癌基因的失活在白血病發生發展、診斷、監測微小殘留病、預測病情以及指導治療方面都有重要作用，這些表觀遺傳學標志作為MRD監測標志物的臨床研究逐漸引起大家的關注。

P15基因甲基化與白血病的關系目前研究最為深入。73%～93%的急性髓系白血病(AML)和57%的急性淋巴細胞白血病(ALL)患者發生p15基因高甲基化，且持續p15基因高甲基化預示疾病復發。與p15基因甲基化患者相比，p15基因非甲基化患者5年DFS明顯延長（15% v 62.5%；p＝0.02）［4］。

Au等［5］檢測了l7例t-MDS/AMI 患者，l5例存在pl5甲基化。其中5例在發展為治療相關的t-MDS/AML前即已存在pl5甲基化，最早為兩年前。提示pl5甲基化發生在t-MDS/AMI 早期，檢測p15甲基化有助于判斷預后、指導治療。在一組65例急性早幼粒細胞白血病的研究中，31例存在p15甲基化的患者5年無病生存率僅為29．64％ ，顯著低于34例無甲基化的患者79%。p15基因甲基化與預后不良相關。

Id4和zo-1是我室新發現的兩個血液系統相關候選基因，并對其在白血病發生、復發中的作用及應用于MRD檢測進行了系列基礎與臨床研究。

采用MS-PCR的方法對完全緩解期白血病患者骨髓標本檢測id4基因甲基化狀態，結果發現：（1）58例完全緩解的急性白血病人MRD的檢出率為41%，MRD陽性的患者12個月內復發率為62.5%，而非甲基化的患者12個月內復發率僅為10%。（2）16例異基因外周血干細胞移植后的白血病患者中，5例檢測到MRD的患者中有4例在1年的隨訪期出現復發，而11例移植后MRD持續陰性的患者無一例復發。

研究對26例完全緩解的急性白血病患者進行zo-1基因甲基化檢測，MRD檢出率為34.6%，MRD陽性的患者12個月內復發率為57.1%，而非甲基化的患者12個月內復發率僅為15.4%，MRD陽性病人復發率明顯高于陰性者。Id4和zo-1基因甲基化檢測可能成為急性白血病新的生物標記用于預測疾病的預后以及復發。

隨著PCR 技術的進步，將實時定量PCR（real-time PCR）與MSP 結合提高了甲基化分析檢測的特異性和敏感性。高敏感性的甲基化定量PCR為MRD檢測開辟了另一種解決方法。甲基化定量水平的變化對于細胞修復、腫瘤預后、腫瘤化療后的耐藥等提供了新的研究指標，可以從另一個層面上揭示其發生機制。因此，甲基化定量PCR技術被應用與臨床各領域的研究。

Shuchi等［6］以啟動子區高甲基化狀態的雌激素受體α（estrogen receptor α;ER-α）和 p15INT4B 基因做為MRD標志，采用定量甲基化特異性PCR對180例急性白血病患者骨髓標本進行檢測，結果發現：（1）臨床緩解期的AML患者中, ER-α和p15INT4B基因啟動子區呈現高甲基化狀態的患者較低甲基化狀態的患者有更高的復發風險，而且ER-α和p15INT4B基因啟動子區甲基化水平的增高與患者無病生存期（disease free survival,DFS）縮短有明顯相關性。（2）對5名兒童ALL患者ER-α基因啟動子區甲基化程度進行了自誘導緩解后的追蹤檢測，結果提示疾病復發狀態較緩解狀態ER-α基因啟動子甲基化水平增加。其結果與目前常用的MRD監測標志TCR/免疫球蛋白重排水平結果基本一致。

另一研究以啟動子區高甲基化狀態的p73、p15、p57KIP2基因為MRD標志，通過對199例Ph染色體和MLL陰性的處于完全緩解狀態（complete remission,CR）的成人ALL標本進行定量甲基化特異性PCR檢測，研究結果提示p73基因啟動子區甲基化水平與第一次CR持續時間及無病生存期（DFS）及總生存期（overall survival, OS）縮短間有顯著相關性［7］。因此，特定基因的定量甲基化PCR檢測有可能成為一種評估急性白血病復發風險及MRD檢測的有效手段。

結語

白血病作為一種惡性腫瘤，復發是影響其患者生存的主要問題。患者體內白血病微量殘留病是復發的主要根源，對患者進行微量殘留病監測在白血病的治療和預后判斷中具有非常重要的意義。遺憾的是，由于絕大多數患者缺乏明確的遺傳標記作為早期檢測和準確評估MRD的標志，在臨床上常因治療不足導致疾病復發或治療過度引起嚴重并發癥，絕大多數患者在發病后1~3年內死亡。因此，要在白血病MRD早期檢測和指導治療上有所突破，就必須尋找能夠早期診斷白血病MRD的特異性強、通用性好的分子標志物。DNA 甲基化作為腫瘤相關標記，與遺傳學標記、細胞表面抗體等標志具有更多的優勢。首先，臨床常規的腫瘤標記檢測以蛋白或者RNA為對象，必須采集新鮮樣本以確定檢測結果的準確性。而甲基化檢測則以DNA 為樣本，很容易從各種體液中，甚至石蠟包埋組織中得到，極大地擴展了研究資源。其次，甲基化以DNA作為研究對象，較RNA 和蛋白更穩定，更容易保存。進而保證了檢測結果的可靠性。因此，DNA甲基化定量水平的變化對于腫瘤預后、腫瘤化療后的耐藥等提供了新的研究指標，可以從另一個層面上揭示其發生機制。

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經典遺傳學和表觀遺傳學范文3

表觀遺傳學

惡性腫瘤的發生涉及多種基因功能的異常，導致異常的除了以往我們研究得很多的基因突變、基因缺失等遺傳改變外，近年來表觀遺傳學成為了研究熱點。1999年Jones等在Nature上撰文“Cancer epigenetics comes of age”[1],表明腫瘤研究進入了新的時期。表觀遺傳是指DNA序列不發生變化，但基因表達卻發生了改變，并且此種變化在發育和細胞增殖過程中能穩定傳遞[2]。表觀遺傳學的主要研究方向包括以下幾個方面：DNA甲基化修飾；組蛋白修飾(組蛋白的乙酰化、去乙酰化及磷酸化、去磷酸化等)；基因印跡等。和很多傳統遺傳學改變不同的是，許多表觀遺傳的改變是可逆的，這便為很多疾病尤其是惡性腫瘤的診斷與治療開拓了廣闊的前景。

DNA甲基化概況

DNA甲基化是目前研究得最多的表觀遺傳學機制，它是一種常見的DNA修飾，指在DNA甲基轉移酶（DNMT）催化下將甲基加到CG二核苷酸的胞嘧啶上，使之變成5′-甲基胞嘧啶（5-mc）的化學修飾過程[3]。CpG二核苷酸在基因組中呈非隨機分布，在5′端啟動子區CpG位點高度聚集在一起，稱為CpG島。目前已經研究證實有三種與DNA甲基化相關的酶，DNMT1、DNMT3a、DNMT3b，普遍認為DNMT3a和DNMT3b可以催化新生甲基化形成，而DNMT1主要在DNA復制時維持其甲基化狀態。很多研究都表明，腫瘤細胞DNA總體甲基化水平低于正常細胞，但某些CpG島甲基化程度增高。基因組DNA過低甲基化可促進雜和性丟失（LOH）[4]，導致基因組有害基因轉錄表達，例如激活原癌基因，使癌基因或相關因子得以表達，胚胎干細胞在缺乏DNMTl時基因組過低甲基化，宿主保護機制削弱，有利于基因組重復子同源性重組，從而導致整個基因組不穩定性增加；此外，在細胞染色體中心粒劇同存在高度密集甲基化區域，如果失去致密的甲基，可導致基因損傷和突變。

人類基因組中約有45000個CpG島，雖然僅占基因組DNA 的1 %～2 % ，但存在于所有管家基因和少量組織特異基因的5′端調控區。CpG島在正常組織中處于非甲基化狀態，但在細胞發生癌變時某些腫瘤抑制基因啟動子區的CpG島發生甲基化，以致這些基因表達沉默，導致了腫瘤的發生。概括地講，DNA 甲基化抑制基因表達的機理為[5-6]：① 甲基化CpG島直接抑制序列特異性轉錄因子與DNA的結合，從而抑制轉錄；② 甲基化CpG激活阻遏蛋白因子從而抑制轉錄；③ 甲基化CpG與甲基化CpG結合蛋白家族成員結合，通過組氨酸去乙酰化酶作用抑制轉錄；④ 甲基化CpG的甲基化胞嘧啶突入雙螺旋主溝，抑制轉錄因子與DNA的結合。DNA 甲基化能增加基因突變率。5一甲基胞嘧啶可自發或在S_腺苷蛋氨酸作用下引起鄰位脫氨而使甲基化CpG變成TpG，這種突變能力較非甲基化的CpG 高12倍[7]。

隨著研究的深入，腫瘤發生的經典“二次打擊理論”并不能解釋某些惡性腫瘤其DNA序列完整，沒有突變、缺失，但其腫瘤抑制基因卻表達失活；也無法解釋MMR（錯配修復系統）在沒有突變情況下，其相關基因為何失活。DNA甲基化理論很好的解釋了上述現象，因此又被稱為“腫瘤發生的第三種機制”[8]，由此拓寬了腫瘤研究的視野，CpG島甲基化對腫瘤抑制基因失活的關鍵作用越發凸現出來，成為腫瘤研究熱點也不足為奇。

CpG島甲基化與腫瘤

CpG島甲基化與惡性腫瘤、衰老與某些遺傳性疾病[9-10]有關，很多研究表明在乳腺癌、頭頸腫瘤、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、結腸癌等多種惡性腫瘤[11-13]中不同程度的存在一個或多個腫瘤抑制基因CpG島甲基化。

Esteller等[14]對600 份標本予以甲基化檢測,包括12種基因:腫瘤抑制基因 （p16INK4a ,p15INK4b ,p14ARF ,p73 ,APC ,BRCA1) ,DNA修復基因( hMLH1 , GSTP1 ,MGMT) 以及轉移、浸潤相關基因(CDH1 ,TIMP3 ,DAPK) ]和15 種腫瘤(結腸癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、肝癌、腎癌、肺癌、頭頸部腫瘤、乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、膀胱癌、腦瘤、白血病和淋巴瘤) ,從中得出許多重要信息,提出建立某些腫瘤的甲基化圖譜的設想,為早期診斷、治療以及預后判斷提供依據。

Fukai等[15]早期及進展期肝癌中都檢測到,p16INK4a 基因啟動子甲基化而引起其轉錄失活。Yang等[16]研究51 例肝細胞癌組織中多個相關基因的甲基化狀態,結果多基因發生甲基化: SOCS21 ( 65 %) , GSTP ( 54 %) , APC ( 53 %) , Ecadherin(49 %) 及p15 (49 %) ,其中53 %的肝細胞癌有兩個以上的抑癌基因甲基化,而在正常組織中為0 %。結果顯示,抑癌基因的甲基化是肝細胞癌發生過程中的普遍事件,說明DNA 甲基化與基因轉錄活性和表達呈負相關,且對腫瘤形成起到重要作用。Corn[17]對31 例食管腺癌的Ecadherin 基因甲基化狀態進行研究,84 %的病例發生甲基化,而相應的正常組織大多為非甲基化;同時對4 例正常的食管組織進行研究,發現其正常鱗狀細胞上皮沒有1 例發生甲基化。Ecadherin 發生甲基化是其失活的一個重要原因,可能是引起食管腺癌重要原因。所以DNA 甲基化狀態改變是抑癌基因失活方式之一,是致癌的一個關鍵因素。Kang、Waki [18-19]對非腫瘤胃黏膜和胃癌組織進行P16、hMLH1、DAP2kmase、Ecadherin、THBS1 及TIMP2S 等基因檢測后發現,相關基因CpG島高甲基化在胃癌發生過程中可較早出現,并趨向與胃癌發生過程相一致,提示相關基因甲基化可作為診斷早期胃癌的一項較為敏感的指標。

DNA甲基化檢測方法

盡管DNA甲基化對細胞的生物活性有重要的影響，但對它的檢測要比檢測DNA的堿基序列相對困難。這主要是由于甲基化的胞嘧啶并不影響C：G核苷酸的配對，并且在聚合酶鏈反應(PCR)過程中，胞嘧啶上的甲基通常會被丟失。隨著技術的進步，現在檢測甲基化的手段也豐富起來，不僅可探測某段DNA序列的甲基化分布，而且還能大通量地了解整個基因組甲基化的程度。本文著重介紹應用普遍、易于開展的兩種方法：

(一)亞硫酸氫鈉法(Sodium Bisulfite法):亞硫酸氫鈉可將非甲基化胞嘧啶轉化為尿嘧啶，后者經聚合酶鏈反應(PCR)擴增克隆變成胸腺嘧啶而產生T:A配對，但對甲基化的胞嘧啶亞硫酸氫鈉則沒有作用，這樣甲基化狀態不同的DN段就可轉化為有堿基序列差異的2個片段。這種方法對小樣本有很好的檢測能力，是現在研究的主流方法，細分為以下兩種。

（1）甲基化特異性PCR(MS―PCR)：通常在亞硫酸氫鈉處理后，分別針對目的片段完全甲基化的情況和完全非甲基化的情況設計引物。這樣樣本DNA即可根據自身的甲基化狀態分別在相應的PCR組中進行擴增，并將結果通過凝膠電泳圖像顯示出來。根據擴增條帶所在的PCR組可判斷樣本中甲基化的狀況。MS―PCR的特異性很高，操作簡便，費用和耗時都較小，但只能部分檢測DNA甲基化的狀態。對MS―PCR進行適當改進后，設計出半巢式PCR 和巢式PCR ；而改進的實時MS―PCR 可對產物進行定量分析。這些方法都可提高MS―PCR的靈敏性。

（2）亞硫酸氫鈉法依賴的基因測序法(BSP bisulfite sequence-PCR)：是一種對DNA樣本進行亞硫酸氫鈉處理和PCR擴增克隆及DNA測序結合的檢測方法。然后，根據核苷酸序列中C―T轉化情況可判斷樣本中的甲基化狀態，如與原序列比較，發生了C―T的轉變，則表示該處未發生甲基化，如沒有C―T轉變，則發生甲基化。此方法通過測序可獲得樣本DNA序列中較全面的甲基化信息。

以上兩種方法大體過程有很多相似之處，但在引物的設計上有較大差別，BSP引物不包括CpG位點，在CpG位點的上下游，擴增后通過測序檢測該位置的甲基化狀態(測序如果CG不變則為甲基化，如果CG變為TG則為非甲基化）。MSP是根據修飾后甲基化和非甲基化的引物不同擴增出不同的條帶而判斷是否為甲基化(只擴增出MSP條帶表明為甲基化，如果擴增出USP則表明為非甲基化)。

(二)甲基化敏感的限制性內切酶法: 一些限制性內切酶可識別位點中含有的CpG雙核苷酸序列，并結合非甲基化的識別序列，而對發生甲基化的序列則無結合活性。在此基礎上，可設計出許多檢測甲基化的方法。這些方法分為兩大類：一種是檢測某個DNA序列或基因甲基化狀態的方法。如Southern法，甲基化敏感的限制性圖譜(MSRF法)；另一種是檢測整個基因組或大通量檢測許多基因的方法，如限制性標志物全基因組掃描(RLGS)、差異性甲基化雜交分析(DMH)和甲基化CpG島擴增子分析(MCA)等。這種方法易進行自動化和大通量基因檢測。

治療和應用前景

與基因突變不同,腫瘤發生中DNA甲基化等表觀遺傳學事件的發生是可以逆轉的。因此,在惡性腫瘤和癌前病變中通過去甲基化處理可以恢復某些關鍵性抑癌基因的功能而起到預防和治療腫瘤的作用。由甲基化引起基因沉默而出現的腫瘤,可通過DNA甲基轉移酶非競爭性或競爭性抑制劑抑制甲基化的發生,活化沉默的抑癌基因,從而達到治療腫瘤的目的。去甲基化藥物: 5-氮胞苷(5-azacytidine)和5-氮- 2′-脫氧胞苷(5-Aza-2′- deoxycytidine)及其衍生物可以抑制甲基轉移酶活性,在一些難治性腫瘤,特別是在白血病治療方面已取得了一定的療效[22]。應用反義寡核苷酸,針對DNMT1mRNA 的反義寡核苷酸能降低DNMT1蛋白水平,誘導去甲基化和腫瘤抑制基因p16 的再表達,也能抑制小鼠模型腫瘤的生長。這種療法已進入臨床一期試驗,顯示一定抗腫瘤活性。章揚培[20]等從1987 年始,先后進行了20 株中國人腫瘤細胞系甲基轉移酶(MGMT) 活性與對烷化劑亞硝脲耐藥性的研究,分析患者MGMT 水平,此為依據對MGMT水平調節,可對患者實施不同的烷化劑治療方案。

由于DNA甲基化對基因抑制是多種腫瘤都有的特性，且腫瘤的發生常常涉及多個抑癌基因的失活，各種腫瘤都有各自不同的抑癌基因失活，而去甲基化藥物針對的是整個基因組而不是特定的基因，可同時恢復多個抑癌基因的表達。但同時這也使得腫瘤中的很多致癌基因由于去甲基化而甲基化程度更低，導致了他們的表達增加，相反又促進了腫瘤的發生，所以一些臨床試驗用去甲基化藥物治療實體腫瘤的效果還不是很理想[21],應用前景受到了限制。因此理想的藥物應該是特異性的甲基化劑而不是非選擇性的去甲基化劑，這需要我們更深一步的研究和探討。

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經典遺傳學和表觀遺傳學范文4

在分子生物學和計算機技術等相關技術飛速發展的今天，多種高新技術如多重PCR、高通量測序等技術的出現，使得在短時間內快速準確地測定線粒體全基因組序列成為可能，而且隨著高通量測序成本的不斷降低，線粒體全基因組序列分析已逐漸成為線粒體DNA檢測的主要手段。尤其是二代測序技術的出現，使得法醫工作者能夠方便地獲得更全面的線粒體基因組信息，在提高線粒體DNA檢測識別率的同時，能夠獲得更多樣品來源信息。二代測序通過一個檢測過程就能得到目前所需的所有信息，非常適用于微量檢材的檢驗。有實驗室對線粒體全基因組測序結果進行分析，發現其能夠提供除高變區外的單倍體類型，從而獲得更全面的樣本mtDNA單倍群信息。更全面的單倍群信息的應用可明顯降低線粒體DNA異質性的假陽性率，同時還能夠對組織特異性進行檢測。Parsons、Coble等提出，相對于僅對高變區進行測序分析，對線粒體的全基因組測序比對能夠明顯提高線粒體DNA在人群中的分辨力。除此之外，線粒體DNA本身還包含有許多其它的信息。線粒體在體內作為能量供給站，其編碼的基因包括呼吸鏈的相關蛋白、氧化磷酸化相關蛋白、部分rRNA和tRNA等。相對于控制區，編碼區的變異率較低，編碼區的序列能夠提供樣本來源有關的疾病信息，如有研究發現心肌病、腫瘤或動脈粥樣硬化等疾病與線粒體DNA序列突變有關。

1線粒體測序

線粒體DNA測序，主要有傳統的Sanger測序法，以及以DNA合成為基礎的二代測序方法。Sanger測序法是以雙脫氧核苷三磷酸（dideoxynucleotidetriphosphate,ddNTP）終止反應為基礎的測序方法。近年來由于硬件的不斷更新，亦能用于線粒體的全長測序，但由于其時間和成本均較高，該方法的推廣和應用受到很大限制。目前，Sanger測序法仍是唯一符合法醫學驗證標準的測序法。二代測序，又稱新一代測序（nextgenerationsequencing,NGS），它以DNA合成為基礎，在多個片段同時復制時，通過檢測每條DNA鏈復制過程中釋放的離子轉化成的電信號或者DNA新鏈摻入時釋放的熒光信號而實現高通量并行測序。二代測序法能在短時間內完成對線粒體基因組的高深度測序，相對經典Sanger測序法靈敏度更高。

1.1測序策略測序的策略根據測序目的以及測序平臺的不同而有不同選擇。根據獲得線粒體DNA方法的不同可將測序分為直接測序和間接測序。直接測序是指先通過DNA提取或擴增獲得足夠的線粒體DNA后對其進行測序。由于檢材量的限制，直接提取得到的DNA量往往非常有限，通常需對線粒體DNA進行PCR擴增或探針捕獲進行富集后測序。對于線粒體DNA16569bp全基因組的擴增，需使用多對引物進行分段擴增。有文獻推薦使用65對引物或34個擴增片段對線粒體全基因組進行分段擴增，也有報道僅使用12對相互重疊的引物也能獲得良好的線粒體全基因組擴增效果。由于法醫鑒定中的檢材大部分為降解檢材，為了提高DNA的檢出率，測序的策略應盡量采用較小的擴增片段，并且為避免擴增片段間的相互干擾，還應該減少不必要的擴增子數目。對于線粒體DNA而言，因其序列包含較多高變位點，且存在與核染色體高度同源的序列，使得線粒體測序策略的選擇有一定難度。Fendt等先將16kb長的線粒體DNA擴增為A、B兩個約8.5kb長的片段，然后用48對測序引物對上述兩個長片段進行測序。此方法適合于DNA質量較好的線粒體樣本。Lyons等利用Sanger法對人群的線粒體全基因組進行測序，采用的是將16kb的線粒體全基因組序列在96孔板中分成8個擴增子進行擴增，然后再利用多個測序引物進行多重擴增，共將其分為135個片段來進行測序。此方法大大降低了核線粒體DNA（nuclearmitochondrialDNA,NUMT）的干擾，使得測序DNA起始用量降至50pg~1ng。間接測序是指先通過測序得到樣品所有的DNA序列信息后，通過生物信息學的方法將線粒體DNA序列篩選出來。此方法很難進行質量控制，也極易受假陽性和核DNA的干擾。在二代測序方面，Mikkelsen等用二代測序平臺對10個無關個體的線粒體全基因組進行了檢測，采用的是將整個線粒體DN段分為2個擴增子進行測序。Schonberg和Templeton等也是先將線粒體DNA分成2個片段進行特異擴增后，再用物理方法將其打斷為適當大小的片段進行測序。此方法雖然可以減少其它非線粒體DNA的污染，但是如此大的擴增子在法醫降解檢材中很難擴增得到，而Templeton等在擴增片段前還利用探針捕獲的方法對線粒體DNA進行富集，能夠明顯提高二代測序的數據質量。

1.2線粒體DNA異質性線粒體DNA的異質性，是指在同一個來源的線粒體基因組中，同一位置上出現兩種或兩種以上的分子類型。現在的研究多認為異質性的產生跟瓶頸理論有關，且多發生在高代謝的組織上，如毛發等。線粒體的異質性可分為兩種，一種是長度異質性（lengthheteroplasmy,LHP），另一種為點異質性（pointheterolasmy,PHP）。異質性的發生類型多種多樣，包括：同一組織來源，不同細胞間；同一細胞，不同線粒體拷貝間；同一線粒體中，不同線粒體DNA分子間。異質性的出現，為法醫線粒體DNA鑒定帶來一定挑戰。但需要注意的是，異質性并非出現于線粒體基因組的必然之物。傳統異質性的研究是通過Sanger法測序獲得的，但通過Sanger法判斷點異質性易受到引物或者異質點位置的干擾，且沒有一個確定的異質性標準，靈敏度也較低；而利用二代測序的方法，能夠得到整個線粒體DNA序列的異質性位點信息，并且由于是通過雙向測序獲得，其結果更加準確可靠。通過目前二代測序對線粒體DNA異質性的研究表明，線粒體DNA異質性的發生率要高于以往的研究結果，但到底是由于檢測方法敏感度的增加導致的假陽性還是由于異質性的確比之前認為的更易發生，以及如何將此方面研究應用于法醫學實際案例，尚需進一步深入研究。除此之外，為了避免不完整測序造成的將可能的單倍型誤認為變異，現在一些線粒體DNA數據庫以全基因組范圍的單倍群為基礎。

2線粒體全基因組測序應用研究

目前，已有多個實驗室對線粒體全基因組進行深入研究，由此線粒體全基因組數據近年飛速增長，僅2014年增加約15%，其應用范圍也越來越廣泛，包括法醫學中個體識別、親屬關系鑒定以及嫌疑的排除，臨床醫學上相關疾病的診斷、治療及危險因素的判斷等。在衰老的機制研究中，人們也普遍認為線粒體基因組變異與衰老有關。

2.1法醫學應用早在新的測序方法出現前便有學者研究發現線粒體的全基因組測序相較于高變區的測序有更高的識別能力，但由于種種限制使得通過將編碼區的SNP位點聯合高變區測序成為全基因測序的替代，但這始終無法達到全基因組測序的高分辨率。新的技術出現后，許多學者便嘗試將其用于法醫學的研究，包括Loreille等利用二代測序平臺對高度降解的未知名骨骼樣本進行了線粒體全基因組測序。King等對2014年英國出土的懷疑為理查三世的尸骨進行了鑒定，通過Y染色體、線粒體和表觀遺傳SNP相關位點的聯合應用確認該遺骨確為理查三世。其中線粒體就是采用DNA雜交捕獲后的長片段擴增，在二代測序平臺上獲得全基因組數據，并得到了完美比對結果。另外，因為對于一些稀有的疑似單倍型的判斷依賴于準確的人群調查，已有的數據大多僅基于非編碼區的數據，而隨著越來越多的認識發現線粒體全基因組的分析更全面和準確，Just等便用高通量的Sanger測序法對3個民族588個美國個體進行全基因組測序，為將來的全基因組比對提供了更好的基礎支持。除此之外，Bouhlal等通過二代測序的方法輔以一代驗證對一對同卵雙胞胎進行了線粒體全基因組測序，發現了低頻率的不同的異質性位點，但考慮到核DNA的干擾，且該實驗也缺乏不同年齡段的參考數據，因此有待進一步研究證實。

2.2線粒體相關疾病由于線粒體在體內的主要功能是氧化供能，其變異極有可能導致疾病的發生。將線粒體單倍群與一些相關疾病，如白血病、Ⅱ型糖尿病、老年癡呆癥等進行相關性研究發現線粒體全基因組的單倍型類型是疾病發生的相關因素。由于全基因組檢測技術的普及，使得線粒體基因的功能研究能夠進一步深入。Atilano等使用了分子克隆和線粒體全基因測序的方法，確認了不同單倍群對甲基化的差別調控影響了炎癥反應。另外，Zaragoza等利用全測序分析的方法對母系遺傳的心肌病病人進行線粒體測序，發現了更多與疾病相關的變異位點。

2.3衰老機制氧化應激是人體衰老的分子機制之一，當細胞出現氧化劑和抗氧化劑的不平衡時便會導致氧化應激的累積。現在認為在氧化磷酸化過程中產生的活性氧作為強氧化劑對細胞的老化有重要的作用，線粒體作為細胞內重要的產生活性氧的器官便在衰老的過程中起著重要的作用。隨著年齡增長，線粒體發生的變異也明顯增多，目前也尚未明確是由于衰老導致的變異還是由變異造成的衰老，許多實驗也能明顯觀察到隨著年齡增長線粒體基因組的變異也隨之增加[35]。新的技術為線粒體全基因的變異檢測提供了新的解決方案，為線粒體和核DNA的聯合分析提供了可能。能否將線粒體全基因的變異與死亡年齡推斷聯系起來應用于法醫實際應用中，有待進一步的研究。

3展望

經典遺傳學和表觀遺傳學范文5

關鍵詞：生物信息學 交叉學科 學生培養

一、生物信息學的產生

生物學是一門古老的學科，在人類歷史發展的長河中，人類從未停止過對生命奧秘的探索。人們逐漸認識到，雖然生物種類多種多樣，但是它們的最基本分子卻是相同的。DNA、RNA和蛋白質等分子構成了生命的基本單位，再由細胞到組織、器官，最后器官系統組成完整的生物體。

傳統的生物學研究中，由于受到技術水平的限制，生物學家多采用低通量的生物實驗方法，其研究對象通常是一個基因或者幾個基因組成的通路。在這種情況下，實驗后的簡單觀察就可以滿足研究需要。隨著生物研究的不斷深入，積累了大量實驗數據，人們不禁想到，如何把不同的實驗結果整合起來？另一方面，隨著生物技術的發展，大量新興技術出現，產生了海量的數據。例如90年代興起的基因芯片技術，單張芯片就可以測定成千上萬個基因在某一狀態下的表達情況。1990年啟動的人類基因組計劃更為生命科學的研究提供了海量的序列數據。面對如此多的數據，以前依靠生物實驗研究單個或幾個基因的方法很難再適用，生命科學、統計學、計算機科學和信息科學等若干學科的交叉學科――生物信息學應運而生。生物信息學以計算機、統計、模式識別等方法為手段，以生物數據為研究對象，通過對大量生物數據的儲存、處理和分析，提取其中有意義的生物知識[1]，從而最終揭示蘊藏在核酸序列和蛋白質序列中的信息，對了解生命活動的基本規律出貢獻。

二、生物信息學在生命科學研究中的作用

作為一門新興的學科，大家對生物信息的作用并不十分明確。很多人認為生物信息學只是為實驗科學服務。從廣義上講，這種說法也不無道理，但是生物信息學并不是實驗科學的附屬品，與生物實驗一樣，它也是解決生物問題的一種手段。為了解決生物問題，生物學家依靠的是實驗臺，生物信息學家依靠的是計算機。

在生命科學的發展過程中，以分子生物學的產生為界，可以分為傳統生物學和現代生物學。傳統生物學和現代生物學取得的成就為生命科學的發展做出了巨大貢獻。人類基因組計劃啟動以來，人們一度認為只要把各種生物基因組的全部堿基排列順序測定清楚，生命的遺傳奧秘就會顯露無余，但是真實的情況遠不像想象的那樣簡單。人類的個體發育開始于一個單細胞受精卵，受精卵經過一系列的細胞分裂和分化，產生具有不同形態和功能的細胞，不同細胞之間相互作用構成各種組織和器官。雖然人類基因組中有兩萬多個基因，但是在單個細胞當中，同時起作用的基因往往是很少的。有些基因只在特定階段起作用，有些基因只在特定組織起作用。只關心某個基因或蛋白的功能是不夠的，因為在不同時空條件下，同一個基因或蛋白的功能可能不同。生物是一個復雜的系統，其表型和功能不僅體現于基因數量和序列的不同，更體現在基因、蛋白以及其他生物分子之間的相互作用之中。因此，把研究對象當成一個整體，系統地分析內部的相互關系尤其重要。但是無論是傳統生物學還是現代生物學，都是一門實驗學科，生物學的發展中缺乏一種系統思想。生物信息學可以從大量生物數據中提取有意義的生物知識，通過對已有數據的總結，進一步推測生物體的某些性質和變化趨勢，生物信息學為大量生物數據的整合提供了可能，與生物實驗一樣，是生物研究中的一種重要途徑。

三、生物信息學學生的培養

生物信息學是一門交叉學科，要求學生具有較好的分子生物學、計算機科學、數學和統計學素養，目前國內只有少數幾個學校設立了生物信息學本科專業，大部分的學生都是進入研究生階段才開始生物信息學的培養。在進入生物信息學專業前，本科階段可能接受過計算機、統計學、信息學、生物學等某一方面的教育，但要進行生物信息學的研究，大多需要補充其他方面的知識。

生物信息學研究可以分為兩類：第一，在深刻理解生物問題的基礎上，利用計算技術解決生物問題，第二，為生物學家提供性能更好的方法（算法）。理工科背景學生的生物知識較少，但是對于各種計算方法的原理和使用非常熟悉，對于這類學生的培養，第二類問題比較適合他們入門。在生物信息領域，有很多經典的分類問題。這些問題已經明確了分類目標，并且大都有通用的數據集。但是這類工作也受到了生物學家的質疑，因為大部分工作都是把已有的經典算法用在生物數據上，由于對生物問題不夠了解，最后成為只有做生物信息的人才看的方法。這也在一定程度上導致了部分生物學家對生物信息存在偏見，認為生物信息就是提出新算法，做一些數據庫。要想真正讓生物學家認識到生物信息學的重要性，就要以解決生物問題為根本出發點，即使是做預測方法，也要建立在解決生物問題的基礎上。做出更好預測方法的關鍵是深入理解生物問題并抓住關鍵特征。舉個例子，要把男生和女生分開，我們可以根據很多特征，比如身高、體重、頭發長短，雖然大多數情況下來說，男生比女生高、比女生重、比女生頭發短。但是只基于這些特征還是會造成很多的分類錯誤，因為這些特征不是男生女生差別的最根本因素。如果我們是根據性染色體來分，那正確率的提高就非常顯著了。在預測問題中，利用五花八門的方法并不是關鍵，如何能夠對生物問題深入了解并找到關鍵特征，才是最主要的。

作為一門新興的學科，大家對生物信息的了解還很少，很多人對它的定位也不同。但既然是生物信息，就是先生物后信息，可見生物的重要性。所以，在生物信息的研究過程中，對生物問題只限于表面地理解，勢必不能做出好的工作。只有對生物問題有了深入了解，才能發現其中的問題。能夠找到值得做的問題，可以說工作已經成功了一大半。當然，解決問題過程中也會有很多困難，比如發現了值得研究的課題，但在解決的過程當中發現某些數據無法獲得，或者某些技術超出了自己的能力范圍。在這種情況下，可以首先想想有沒有其它變通的辦法可以解決問題，如果經過慎重的考慮都無法找到，就要果斷的放棄。這里要強調一定要慎重考慮，不能遇到一點困難就放棄。

相比理工科背景的學生，生物背景的學生有著扎實的生物學知識基礎。但是如果是從本科階段直接進入生物信息學，由于還沒有進行過實驗操作，他們對生物問題的理解也很難非常深入。不管是理工科背景還是生物背景的學生，豐富的生物學知識都是進行好的生物信息學研究的前提。在培養學生時不可忽視對其基礎生物學知識的傳授和教育，并適當引導其對生物學問題的思考。生物學問題可以很大也可以很小。大的生物學問題任何一個懂得基礎生物學知識的人都可以提出，但也是最難解決的，比如到底是什么改變使細胞惡變，自身免疫病是如何形成的，心血管病糖尿病等復雜疾病是如何發生的，為何有人容易生某種病而其他人不易感。小的生物學問題就是各自領域的具體研究課題，比如表觀遺傳學領域的DNA去甲基化酶是否存在，基因表達調控領域的轉錄起始頻率是如何決定的，RNA領域的大量非編碼RNA的作用，蛋白修飾領域新發現的修飾如何調控蛋白的功能等等。在腦中提出并試圖思考一系列大大小小的生物學問題是對學生培養目標的第一步。這些問題的產生的前提是對生物學知識的熟悉掌握。然而在對學生培養的過程中沒必要也不可能告訴他們所有的知識，生物學知識教育的原則是為他們打開門，當他們思考問題的時候知道去哪里找到相關的知識。

另一方面，只有生物學基礎知識和問題是不夠的。很多問題在生物信息學產生之前就存在了，傳統的方法無法帶給人們問題的答案。人們一直期待新的方法去理解和解決這些問題。生物信息學的產生無疑提供給人們另一種思考生物問題的方式，為一些經典問題的解決提供了可能。例如最近的大規模的腫瘤基因組測序和分析使我們發現了很多新的腫瘤相關基因[2]。對于生物背景的學生，在教學中要把這樣的例子介紹給學生，生物背景的學生在理解信息學理論方面會存在困難。最初很難要求他們理解所有具體過程。但是至少要讓他們知道這些方法的基本原理，還有在什么情況下使用。這樣在以后的研究中遇到類似問題才能想到應該選擇什么樣的信息學工具去解決，在具體應用過程中加深對整個過程的理解。生物背景的學生如果想成為生物信息學專家，只會應用是不夠的，補充一些計算機、統計、信息方面的基礎知識是必不可少的。

生物信息學是一門仍處在快速發展之中的學科。還沒有一本教材能夠滿足生物信息學教學的需要，生物信息學立足于分子生物學、模式識別、計算機科學與技術、數學和統計學等學科，所以學生要先對這些學科的基本概念和系統有一個較為全面和直觀的認識，為日后的科研打下堅實的基礎。另外，培養過程中要包括大量的實例介紹，對一些重要的應用還加以詳細解剖，使得同學們不再僅掌握理論，而是能夠學會如何在實際工作中靈活應用這些理論。在此基礎之上，向同學們推薦一些最新的論文、期刊、參考讀物和相關的學術報告，讓同學們能夠切身感受到學科發展的前沿，培養學生的創新能力。21世紀是生命科學的時代，也是信息科學的時代。生物信息學在這樣的歷史條件下產生并壯大，它作為多個領域的交叉新興學科，對生命科學研究有著巨大的推動力。生物信息學是一門應用性非常強的學科，也是一門非常活躍的前沿學科，良好的教學效果必須以先進的內容體系為基礎，我們應時刻注意以科研促進教學，教學科研相長，使教學研究達到更高的水平。

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經典遺傳學和表觀遺傳學范文6

基因組測序的完成，為我們提供了生命的第一套密碼。從基因組數據中提取蘊藏的大量信息，闡明千變萬化的生命現象，是生物學家所面臨的更大挑戰。眾所周知，生命活動的基本單位是細胞，人體中數百種細胞分工合作，形成各種組織和器官，最終組合成一個完整的個體。

生物體中，每個細胞內都有一套完整的基因組，為實現正常生物功能，生物體在不同環境、不同發育階段，選擇不同基因適度表達。即使是最簡單的生物也有數百個基因，這些基因遵循一定的表達調控機制，依照特定的時空順序進行有序的表達。在一個特定的時刻，一個特定細胞中所有表達基因的組合，最終限定了這個細胞的生物學功能。轉錄組學（Transcriptomics）著重研究高度復雜精確的基因表達調控過程。通過對不同細胞類型之間表達模式差異的研究，轉錄組學試圖從動態的角度刻畫出一幅生命活動的“動畫”。

隨著基因組數據的增長，DNA芯片（DNA Chip）技術得到廣泛應用。DNA芯片也稱基因芯片（Gene Chip)、生物芯片（Biochip）或微陣列（Microarray）。20世紀90年代中葉DNA芯片技術出現前，傳統分子生物學技術通常只能同時對少數幾個基因的表達情況進行研究。決定生物形態或某種生物現象通常是成百上千的基因共同作用的結果，作為一種能夠獲得大量基因表達圖譜的高通量技術，DNA芯片應運而生。

一、 DNA芯片原理

DNA芯片的基本原理與生物學中Southern雜交等實驗技術相似，都是利用DNA雙螺旋序列的互補性，即兩條寡聚核苷酸鏈以堿基之間形成氫鍵配對（A與T配對，形成兩個氫鍵；G與C配對，形成三個氫鍵）。DNA芯片通常以尼龍膜、玻璃、塑料、硅片等為基質材料，固著特定序列DNA單鏈探針（Oligo），并與被檢測序列單鏈cDNA序列互補結合（通常稱雜交）。被檢測序列用生物素或熒光染料標記，通過熒光染料信號強度，可推算每個探針對應的樣品量。一張DNA芯片，可固著成千上萬個探針，具體數目則取決于芯片設計和制備方法。

根據制備方法，DNA芯片主要可以分成三類：

1) 利用機械裝置將cDNA序列或者其他PCR產物點在芯片上作為探針；

2) 利用機械裝置將事先合成的寡核苷酸鏈序列點在芯片上作為探針；

3) 不事先合成寡核苷酸鏈，而直接在芯片上通過原位合成技術同時合成所有探針。

后兩種方法，需要綜合考慮探針的靈敏性（Sensitivity）和特異性（Specificity），避免非特異性雜交干擾結果；此外還需要考慮GC含量以及退火反應溫度，以保證整個芯片可在相同條件下進行雜交實驗，所有探針都有比較一致的雜交效率。不同方法生產的芯片探針長度不一，Affymetrix公司的芯片采用短探針，只有25個核苷酸；而NimbleGen公司所用探針相對較長，可達70個核苷酸。一般來說原位合成芯片可在同一張芯片內容納更多探針。

除Affymetrix公司生產的芯片外，其他芯片多采用雙色雜交系統，即使用Cy5（紅）和Cy3（綠）兩種染料分別標記所比較兩種樣品的cDNA序列，然后雜交至同一芯片。實驗結果掃描輸入計算機，通過染料熒光強度，可間接比較兩種樣品表達量高低。在一張芯片同時雜交兩種樣本，可減少用不同芯片所帶來的系統誤差。

二、 DNA芯片的應用

(一)傳統基因表達芯片

傳統基因芯片常用于檢測一組細胞中全部基因在特定時刻的表達譜。換言之，基因表達產生的mRNA含量，就是DNA芯片要檢測的指標。通過將提取的總mRNA反轉錄為cDNA并雜交到具有不同基因探針的DNA芯片上，就可得到不同基因在不同條件、不同發育階段下的表達情況。

通過比較不同條件下的基因表達譜差異，可發現與某種疾病或者特殊處理相關的特定類型基因，并可進一步用于臨床診斷或基因工程等。目前，基因表達芯片已廣泛用于各個方面，如在醫學研究中比較腫瘤細胞與正常細胞間、動物服用藥物前后等不同情況下基因表達差異，在植物學研究中研究抗旱、抗病種系與普通種系的基因表達差異等。以雙色DNA芯片系統進行基因表達量檢測實驗為例，一般DNA芯片實驗步驟包括以下幾步。

1) 準備雜交樣品，一般分別從樣品細胞和對照細胞中提取。

2) 提取的mRNA通過反轉錄得到更穩定的cDNA，這個過程中分別對樣品細胞和對照細胞加入不同熒光染料（雙色芯片實驗）或者生物素（單色芯片實驗）進行標記。

3) 兩種樣品同時雜交到制作好的芯片上，芯片上每個點都與分別標記有兩種不同熒光的樣品競爭結合。

4) 通過激光掃描儀器可以獲得每個點的熒光強度，熒光強度范圍為0～65536（216)。這個步驟中應注意實際熒光強度測量值是可以調節的，應該有意識控制大多數樣品熒光強度處在總體范圍中間偏上位置，太高易產生太多過飽和值，強度超過上限（通常為65536)，掃描儀器無法測量；太低則容易受隨機誤差干擾。例如，若隨機誤差強度為50，則信號強度為100，則信噪比過低；反之，若信號強度為10000，信噪比大大加強。

5) 整合兩種不同顏色強度可得到虛擬圖譜，綠色點表示處理后的細胞中該基因表達量高，紅色點反之，黃色點表示處理前后表達水平相當，而黑色點則說明兩個顏色標記的樣品均無表達，如圖1所示。

圖1右下角為一張DNA芯片掃描結果，左上角為局部放大。綠色點表示處理后的細胞中該基因表達量高，紅色點反之，黃色點表示處理前后表達水平相當，而黑色點則說明兩個顏色標記的樣品均無表達。

需要注意的是雜交強度不僅代表基因表達水平實際差異，還可能受非特異性雜交影響。為盡量排除這種因素，Affymetirx芯片中設計了不匹配核苷酸探針作矯正依據。此外，染料效率不同帶來的系統誤差需用均一化方法進行矯正。

DNA芯片作為一種高通量實驗技術，不可避免地存在較大誤差，也難以像傳統生物學實驗那樣給出確定結果。因而，最初DNA芯片技術主要用于獲得大規模基因表達譜。然而，mRNA表達水平僅僅是基因調控的結果，沒有代謝途徑等信息，只能得到一個表達譜，而無法解釋為什么會有這樣的表達譜。比如同樣是在光照條件下高表達基因，有些基因可能處于光信號傳導通路上游，直接受光誘導；而有些基因則可能由聯系光通路以及其他代謝途徑的關鍵轉錄因子激活。這種信息必須結合其他相關知識及實驗才能獲得。

隨著基因組測序計劃進展，基因注釋技術不斷提高，以及生物實驗所積累的知識不斷增加，DNA芯片得到的結果可以從全局角度分析特定生命過程中的問題。例如，通過聚類分析（Clustering）可以把具有相似表達趨勢的基因歸類，再結合基因注釋系統（Gene Ontology）和已知功能基因等注釋信息對每個類別進行總結，探討這種共表達現象在生物學上的意義，進而可以進行代謝途徑分析，從全局觀點和系統生物學視角探索基因轉錄調控乃至生命過程機理。

3) MIDAS（Microarray Data Analysis System）是數據預處理模塊，支持LOWESS、Iterative Linear Regression、Slice Analysis等多種常用歸一化算法。同時，MIDAS還支持通過標準的t-檢驗、MAANOVA、SAM等方法尋找差異表達基因。

4) MeV（MultiExperiment Viewer）用來進行聚類和分類，以及結果的可視化顯示。目前支持包括層次聚類（Hierarchical clustering）、K-mean聚類、自組織圖聚類（Self-Organizing Map，SOM）等多種聚類算法，以及支持向量機（Support Vector Machine，SVM）等多種分類算法。

4.BASE

BASE是一個基于Web的芯片數據管理與分析平臺。與上述主要基于單機的分析軟件包不同，BASE的設計目標是提供一個可以供多人協同工作的平臺。因此，BASE在數據管理方面投入了很多精力，將芯片數據管理與芯片數據注釋融為一體，用戶可以通過瀏覽器方便地查詢實驗進度、觀察實驗結果，并及時和其他相關人員分享信息。

同時，BASE也提供了一組簡單的工具，供研究人員對數據進行一些快速分析。BASE中包含了一個基于Java Applet的三維可視化工具，可供用戶從多個角度查看數據分析結果。

5.Matlab Bioinformatics Toolbox

Matlab是經典的科學計算軟件，由美國MathWorks公司開發。它集數值運算、符號運算及圖形處理于一體，廣泛應用于工程和科學計算。類似于R，Matlab的核心部分注重提供一個快速、高效且穩定的平臺支持，通過針對不同領域與應用編寫特定工具（Toolbox），滿足不同客戶的專門需求。最新版Matlab 7附帶Bioinformatics Toolbox，是Matlab第一個專門針對生物信息應用而開發的工具箱。該工具箱為芯片數據處理提供了歸一化和聚類分析，包括層次聚類和K-mean聚類。此外，通過與統計工具箱配合使用，用戶還可通過經典的t-檢驗及ANOVA等方法尋找差異表達基因。與其他專業軟件相比（見表1），目前該工具箱芯片數據分析功能還很有限，特別是很多2003年以來發展的新方法都沒有包括。

除了Matlab Bioinformatics Toolbox以外，用于學術研究目的時，上述軟件都可以免費獲得。

四、 小結

隨著大規模基因組測序的完成，生物學家開始從相對靜態的基因組研究轉向更為動態的基因表達過程研究。通過對不同細胞類型之間表達模式差異的研究，可以從動態的角度刻畫出一幅生命活動的“動畫”，來進一步探索生命的奧秘。