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初步驗收范文1
女友小A原本是個乖乖女，她對婚姻的設想簡單而美好，那就是，勤勤懇懇持家，安安穩穩過日子，不求大富大貴，但求相親相愛白頭偕老。然而，一腳踏進婚姻的殿堂，她就發現以上設想純屬虛構。男人有大男子主義，家務一點都不干，一有時間就坐在電腦前邊打游戲邊扯淡，吃飯時還會翻著白眼抱怨菜做得太咸粥煮得不爛，對此，小A頑強地忍著。男人玩心不改，動不動就老夫聊發少年狂，撇下老婆去跟一幫狐朋狗友胡吃海喝，對此，小A依舊頑強地忍著。但是，當男人一而再再而三地跟公司的女同事眉來眼去勾勾搭搭時，像“小強”一樣頑強的小A終于忍無可忍了。
新仇舊怨糾結到一起，給小A的發飆注入了山呼海嘯的力量，一番河東獅吼之后，她揚起手，左右開弓，在男人帥呆的臉上留下了十個清晰的指印。小A本以為這兩記耳光會給他們的感情畫上句號，但出乎她意料的是，被打之后的男人不僅沒有因為自尊心受傷而跟她分道揚鑣，反而舌頭磨短了半寸給她道歉，說自己過去狼心狗肺不知道珍惜她，但以后一定會洗心革面痛改前非。接著男人就開始了實際行動，他不再跟狐朋狗友們鬼混，不再跟花花草草們瞎扯，而且還笨手笨腳地學著做家務，其誠意天地可鑒。男人的改邪歸正讓小A徹底明白，這年頭，做淑女不如做烈女，做怨婦不如做悍婦。
不錯，好男人不是天生的，而是一個或者幾個女人打造出來的。打造，打造，你不打，他就不可造。很多時候，一記耳光勝過千言萬語。給他點顏色瞧瞧，他才能知道你是開染坊的。古語說，嚴師出高徒，這話套用在夫妻關系上就是：嚴妻出好丈夫。為什么那些千依百順的女人動輒就被男人無情踢掉，而那些張牙舞爪的女人卻能出人意料地獲取一份天長地久的婚姻，原因就在這里。
這并不是說男人都有受虐傾向，但是他們的生物本性決定了他們貪玩，懶惰，好色，喜新厭舊。即便他們真的愛一個女人，也難免管不住自己那蠢蠢欲動的身體和躍躍欲試的心。為了幫助他們立地成佛，女人們需要曉之以理，動之以情，但是當男人不為情所動時，動之以粗也是必要的。灰太狼先生之所以能建立起勤勞顧家、用情專一的好男人形象，不是因為他天生人格閃亮，那是紅太狼太太舉著平底鍋張牙舞爪一路追殺的結果。
想擁有一個好男人？江湖流傳的《打造好男人之終極秘笈》是這樣寫的：看他小樣的不順眼一聲吼，該出手時就出手，該扁他時就扁他，可以把他打成熊貓眼，但堅決不能慣他的熊貓脾氣。假以時日，男人必然收斂心性，德智體美勞全面發展，于是乎，一個好男人誕生了。
初步驗收范文2
關 鍵 詞： 國民收入分配矩陣；收入分配；收入轉移法；支出轉移法
中圖分類號： F047 文獻標識碼：A 文章編號：1006-3544（2013）05-0048-03
世界上第一個嚴格意義的社會核算矩陣是由Richard Stone教授和他的研究團隊在20世紀60年代為英國建立的社會核算矩陣（Social Accounting Matrix，SAM） [1] 。在我國，李寶瑜引入了矩陣形式表示國民收入流量 [2-3] ，劉揚稱國民收入流量矩陣為國民收入分配矩陣 [4] 。 在上述文獻的基礎上，本文對國民收入分配矩陣中的平衡關系，部門收入支出的計算方法及部門間收入分配轉移的方法等進行了初步研究。
一、 國民收入分配矩陣的編制方法和原理 [3]
（一）國民收入分配矩陣的一般形式
國民收入分配矩陣的一般形式見表1。
（二）國民收入分配矩陣表中的符號表示
國民收入分配矩陣中所有的字母均為矩陣。W為部門（n個）間的收入流量矩陣；U為各部門在各分配項目（m個）上的收入矩陣；Y為增加值列向量；G為總收入列向量；S為各部門在分配項目（m個）上的支出矩陣；Z為可支配收入列向量；F為各項（m個）收入合計數列向量。AT表示矩陣A的轉置矩陣 [5] ，即，若A=（aij）n×m，則AT=（aji）m×n。U=（uij）n×m，其中uij表示第i部門在第j項目上的收入；S=（sij）m×n，其中sij表示第j部門在第i項目上的支出。Y=（y1，y2，…，yn）T，其中yi表示第i部門的增加值；G=（g1，g2，…，gn）T，其中gi表示第i部門的總收入；Z=（z1，z2，…，zn）T，其中zi表示第i部門的可支配收入；F=（f1，f2，…，fm）T，其中fj表示第j項收入的 從W矩陣的數據可以看出，非金融企業部門的收入主要來自部門內部（5728億）、 金融機構部門（4679億）和國外部門（3406億），非金融企業部門的支出主要流向住戶部門（71 803億）、政府部門（51 911億）。
參考文獻：
[1]王其文，李善同. 社會核算矩陣原理、方法和應用[M]. 北京：清華大學出版社，2008.
[2]李寶瑜. 國民收入流量表與模型研究[J]. 統計研究，1996（2）：16-19.
[3]李寶瑜. 中國國民收入流量表研究[J]. 統計研究，2001（6）：14-18.
初步驗收范文3
關鍵詞：資產處置；工作思路；調研；改進
隨著農行完成逾8000億元不良貸款剝離及注資,農行的不良貸款率大幅下降,信貸資產質量顯著改善,為農行的成功上市鋪平了道路。農行剝離的不良資產處置方式不同于其他三家國有銀行,以前的銀行,包括中行、工行、建行,都是最后不良貸款交由四家資產管理公司來進行處置。農行這次的不良貸款,是由財政部和農業銀行建立共管帳戶,財政部委托農行成立專門的資產處置機構進行清收。對于農行而言,加快財政部委托不良資產的處置,既是對國家、對社會的責任,也是拓展收入來源,加速自身發展的需要。
一、資產處置工作面臨的形勢和挑戰
當前,農行資產處置工作面臨著嚴峻的形勢和挑戰,在深入分析不良資產處置工作任務的同時,我們應該看到既有有利因素,也有不利因素。
有利方面:一是我國實施積極的財政政策和適度寬松的貨幣政策,加大投資,擴大內需,有利于企業提高經濟效益;二是有利于制定和實施整體的不良資產解決方案,提高各類不良資產處置效率;三是有利于通過整合當地多方面信息資源,以及在金融、財務、司法等領域的資源和其它各種社會關系資源,依托專業清收隊伍,以專業技能和操作手段,提高了資產處置的力度;四是有利于集約經營管理,節約清收費用和人力資源。
不利方面:一是宏觀經濟面臨的國內外環境將更加趨緊,尤其是我國經濟內生性變化帶來的周期性調整壓力可能會明顯大于往年,經濟進一步向下調整的壓力已經顯現,出口增長壓力較大,消費增長趨于放緩,勞動力成本增加,企業贏利能力明顯下降,客戶現金流趨緊,不利于貸款清收;二是我國信用體系尚不完善,不良資產剝離后,客戶心態會發生變化,存在逃廢債傾向;三是地方政府出于維護社會穩定、利益分配等原因,不同程度的存在地方保護主義;四是雖然近年來執法環境有所改善,但執行難問題仍沒有從根本上解決,尤其政策性放款如供銷系統、公共事業單位執行難的問題仍然存在。
二、資產處置工作存在的主要問題
一是委托資產質量低下,清收難度大。損失類貸款占比較高,經過多年的清收,并且采取了多種措施,包括依法清收等等,剝離的不良貸款的清收難度很大。
二是地方政府保護。近年來,由于企業轉制等諸多原因,導致職工上訪事件增多,地方政府為保持穩定要求有關部門在處理企業資產時要做好穩定工作,結果造成在執行企業資產時難度很大,執行不下去。
三是存在逃廢債現象。由于農行股改不良資產剝離,經過媒體等報道,目前,貸款客戶的心態發生了變化,存在拖、賴債等現象,所以在清收過程中要比剝離前付出更大的精力,采取更強更有力的措施。
四是剝離的個人客戶筆數較多,金額較小,分布區域廣,管理和清收難度較大,缺乏更為有效的清收措施。
五是貸款正常維護都會產生一定的成本和費用,而預期的收益具有較大的不確定性。如何在成本和效益之間權衡,也是一項難以抉擇的現實選擇。
三、資產處置的主要工作目標和重點
隨著股份制改革的整體推進,我行的資產重組和財務重組目標已經實現,目前正穩步推進IPO融資上市,業務經營方式將發生重大變化。為此,結合總行制定的3510戰略目標,將“風險控制”理念貫穿于資產處置全過程,充分考慮風險與收益平衡,致力于提高自身風險管理能力,確定我行總體工作目標:即最大限度收回不良資產,降低處置成本,提高處置效率,實現處置收益最大化。
管理目標:全面落實風險管理責任體系。不良資產抓降、監測、控制有機結合,實行客戶、風險管理、資產處置等部門的一體化管理,形成各司其職,各負其責的良好工作氛圍。加快資產處置工作職能轉變,打破傳統的工作模式,將風險管控關口前移,變以往的事后補救式被動管理為事前、事中風險隱患的預防。
人員目標:建立一支高素質的資產處置專業隊伍。實行精細化管理,選聘責任心強、專業素質高的員工專職負責委托資產處置工作,同時配備懂經營、會管理、理念新,道德水準高的管理人員。
經營目標:實際剝離的委托不良貸款,在充分盡職調查核查的基礎上,形成真實可信的估值結果。通過盡職調查和估值,為不良資產處置提供定價依據,研究個案處理辦法,制訂全年乃至今后三年的處置計劃和工作方案,并組織實施。
當前資產處置工作重點:
1.制定處置工作實施細則。認真研究即將出臺的委托資產處置相關制度、辦法,結合我行委托資產實際狀況,在授權范圍內進行必要的細化,研究探索委托資產處置的有效模式。
2.落實處置工作責任制。委托資產實行分戶到人,雙人管戶原則,明確主要責任人,負責分管客戶的資產處置方案制定、具體實施和債權的日常維護。
3.了解掌握客戶資產現狀。認真開展盡職調查,形成全面的債務分類和回收可行性分析報告。深入了解與債務關聯的可執行資產狀況,對委托處置客戶進行分類排隊,確定潛力客戶、一般客戶、無效客戶,分別采取不同的處置手段,使資產處置方式、方法更接近于實際,實現資產處置收益最大化。
4.確定處置清收工作重點。處置工作優先放在處置周期時間短,見效快的項目上。一是對受國家宏觀經濟政策限制企業采取堅決措施,防止金融危機、經濟衰退對上述企業造成沖擊,導致資產迅速減值,資產質量進一步惡化。二是借股改之機存在逃廢債僥幸心理的客戶。三是產權制度變革、借款主體資格變更,特別是政策性破產企業,避免企業變更或破產造成債權的終結。
5.加大處置工作力度。分別采取依法清收、領導包大戶、責任清收、減免表外利息等有效方式,集中人力、法律、費用等有效資源,確保清收工作取得實效。
四、資產處置采取的主要工作措施
1.明確部門職責分工。結合剝離后的工作,明確部門人員職責和各單位的管理責任,樹立大風險管理觀念,實現業務部門風險管理關口前移,從業務風險產生的源頭上進行有效控制。
2.完善考核獎懲機制。完善資產處置考核約束措施,制定不良資產監測考核細則,強化監測職能,嚴格考核。
3.發揮協同作戰的整體優勢。充分發揮原經營行的人員優勢和信息優勢,協調原經營行與委托資產處置經營部的協同工作,對已落實還款計劃的委托資產還款情況進行監督。同時,對懸空債權承債協議進行落實,使其有實質性的進展。
4.加強資產風險防范。強化監管、強化檢查,提高制度的約束力。以人為本,加強人生觀價值觀教育,提高制度執行的自覺性。加大監管及時發現風險隱患,實行客戶尋訪雙人及登記匯報制,收貸收息客戶到行,內外勤分離;抵債資產收取審查、審議審批程序化;處置項目審查審批制,通過市場尋價、合理評估,處置損失認定適當,嚴格處置方式,堅持公平的市場運作,確定拍賣保留底價,對中介機構實行公開或邀請招標,協議處置實行“陽光”操作。對我行的實物資產權屬情況進行重新確認,特別是防止抵債資產產權過戶風險和看管風險,杜絕接收后資產因管理造成的人為減值。
5.注重貸款時效維護。加強貸款訴訟時效管理,使我行的到期未到期債權始終置于司法保護之下。及時向債務人或擔保人發催收通知書、律師函等形式延續訴訟時效保全債權;密切重點行業產權制度變更,爭取最大限度獲得破產債權的清算額度,避免企業破產成為我行債權的終結日。
6.加大以下幾種委托資產的清收力度:借款人有還款能力但拒不還款的賴債行為或各種惡意逃廢債行為的;借款人雖無還款能力,但有可變現資產暫未變現的;借款人雖無還款能力,但保證人有能力和有資產的。
7.加大訴訟執行力度,充分利用法律手段對委托資產進行處置清收。組建訴訟案件管理團隊,實現對本行委托不良資產訴訟案件的集約化、規范化管理。對已涉訴的客戶進行梳理,區別已勝訴在執行、已勝訴未執行、已尚未判決等情況,加強與縣區兩級法院的溝通,盡量加快判決及執行速度,盡早處置,取得清收效果。對債權債務關系明晰、訴訟時效有效、借款人確有可執行財產的不良資產項目,收集相關資料,制定項目處置預案,在充分論證效益評估的基礎上,確有必要訴訟的,果斷訴訟,力爭做到快立、快審、快結和快執行。強化訴訟時效管理,明確時效管理責任,建立訴訟時效臺帳,采取各種催收措施保證訴訟時效的連續,維護我行的權益。
8.對政府干預形成的或有公務員參預形成的委托資產采取向借款人單位發函、公開曝光等措施,借助社會輿論的壓力促使其還貸。
9.加強與政府部門溝通、協商,積極探索國有企業老陳欠貸款的解決途徑,使不良資產處置收益最大化。
五、對資產處置工作的建議
一是建議出臺有針對性的清收政策,根據借款人的還貸能力和貸款方式出臺包括減免息、打折、打包、拍賣債權等清收政策。
二是建議出臺減免稅費等優惠措施,使資產處置效率高、收益大。
三是建議各級財政部門密切配合資產處置工作,對財政擔保的不良貸款由財政部門合理安排資金償還不良貸款,同時對其他政府或企業貸款財政部門也可協調清收工作。
四是建議在嚴防道德風險的基礎上,進一步出臺加快處置抵債資產措施,對于抵債手續存在瑕疵、自然貶值速度較快(廠房、車輛、原材料等),不再深挖歷史責任和現實責任,最大程度地減少這部分資產損失。
參考文獻:
初步驗收范文4
作品眾多
但也是“拖稿女王”
在諸多的青春作家中，落落的作品絕對不算少，小說、散文集、攝影集，同時還是雜志《文藝風象》的主編，這樣的工作狀態讓不少不了解落落的人都會誤以為她是個工作狂，但落落說，自己并不屬于勤奮型，甚至因為強大的拖沓癥，被同事們冠以“拖稿女王”的稱號。
“《剩者為王》對于我來說是一本特別難寫的書。剩女這個題材寫得我很難受，這是我第一次用第一人稱來寫，投射了太多自己在書里面，還包括身邊的朋友、父母，太過的掏心掏肺，讓我經常難以從書中抽離?！甭渎湔f，因為總是糾結到底是應該投入還是抽離，所以前期四個月她一個字都沒寫出來，情緒上也出現了抵觸。“我的稿子就一拖再拖，后來公司實在忍無可忍，我才拼命說服自己跨過這個障礙。”落落笑說，因為要趕稿，而且覺得在家里實在寫不出來，為了逼迫自己，后來她直接搬到了公司。“我覺得可能我家的寫作風水不好，不適于寫作。但是公司的風水挺好，在公司寫作很順，所以我就帶著被子、牙刷等生活用品駐扎公司，刷牙洗臉全在公司廁所搞定。從9月底到10月底，有將近一個月的時間宅在公司?！?/p>
如今書已經出了，再回想當初寫作時糾結的情感投入問題，落落說，她實在是一個不適合寫虛構故事的人，“我的創作一定要源于真實，因為寫虛構的東西，我心里總沒有底，而如果是以真實為基礎的故事，我就會特別有感覺?！甭渎溥€說，為了寫好“剩女”，她還去相了幾次親，“就當是去取材了。”
不當編劇，不出鏡
2010年落落推出了《剩者為王》第一部，主題直指“剩女”話題，生動地勾畫出這一“外表光鮮、事業有成卻感情曲折”的特殊女性群體，引發讀者強烈反響，銷量超過30萬冊。而該書一上市，就被著名導演滕華濤簽下影視劇版權，并進行影視劇籌備。如今，郭敬明作品《小時代》的選角風波正鬧得沸沸揚揚，對于自己是否會參與《剩者為王》的選角，落落說，這是她第一次賣出作品的電視劇版權，因此已經很滿足，不會再多過問電視劇的進展情況 ?！捌鋵嵨沂悄欠N性格很‘慫’的人，所以我根本不可能在影視劇露臉客串。雖然之前導演有問過我是否要參與劇本的工作，當時我想都沒想，就直接拒絕。因為劇本的寫作要求在語言上有著非常強大的表現力，但我的長項并非在此，我比較擅長人物的內心刻畫，所以我根本當不了編劇?！倍鴮τ谑欠耜P注過目前已經在熒幕上大火一把的同類剩女題材電視劇作品，如《大女當嫁》等，落落則說，因為剩女題材其實涉及的問題或故事會很類似，為了避免受到別人的影響，自己刻意回避去看同類的作品，“我想很單純地寫我和我身邊的故事。”
下一個故事將回歸校園
初步驗收范文5
【關鍵詞】 腹腔鏡 腎上腺切除 手術徑路 護理
nursing study of patients underwent laparoscopic adrenalectomy with different operational route
【Abstract】 Objective To study the main points of nursing in laparoscopic adrenalectomy with different operational route.Methods Nursing for 25 patients with adrenocortical adrenoma accepted laparoscopic adrenalectomy with different operational route.Results 25 patients were successfully undergone operation.Usually patients would be encouraged to increase activity in 24～48 hours after operation.The mean hospital stay was 5.3 days.The complications of the operation were not occurred.The following-up period lasted from 1 to 12 months.Conclusion The pre-operation and post-operation nursing care should ensure the safety of the operation according to characteristics of the disease and different operational route.
【Key words】 laparoscopy adrenalectomy operational route nursing
自1992年首次報道施行腹腔鏡腎上腺切除以來，已有越來越多的醫務人員從事這一微創新方法。臨床上形成了兩大派系手術徑路，即經腹腔徑路、腹膜后腔徑路。本文將25例腎上腺腫瘤患者施行腹腔鏡不同手術徑路的護理要點如下。
1 臨床資料
1.1 一般資料 1999年12月～2003年12月共收治腎上腺腫瘤患者25例，男15例，女10例，年齡25～68歲，平均39.5歲；25例均為單側病變，其中2例合并其他臟器病變。
1.2 手術徑路 根據腎上腺疾病的性質和腫瘤大小、位置，選擇適宜的手術入路。腹腔入路是最早采用的入路方式，也是普外科醫生最多的方法，其特點是操作空間大，解剖標志清楚，手術視野清晰，可較早地控制腫瘤血供，并能同時處理雙側病變，且適合較大的腺體腫瘤切除。本組7例單側病變及2例合并其他臟器病變者需施行腹腔鏡聯合手術［1］；余下的單側病變，均行腹腔入路腎上腺切除術；腹膜后入路具有入路直接，術時不需牽拉許多器官，只需牽拉腎上極、膜尾和腎上腺本身，損傷小，易于處理腎背側病變，克服了因腹腔內既往有手術、外傷、感染等病史不能應用腹腔鏡的限制。本組資料中16例行腹膜后入路腎上腺切除。
1.3 結果 本組25例均獲得手術成功，無中轉開放手術。除1例術后第2天出現低血鉀并及時糾正外，其他24例均未發生腸漏、尿漏、出血、感染等并發癥，平均住院天數為5.3天。所有患者病理檢查報告與術前診斷相同。隨訪1～12個月，無一例復發。
2 護理
2.1 健康知識宣教 將健康知識宣教貫穿于患者整個過程。重點做好入院介紹及詳細的入院評估，講解各項檢查的目的及檢查前后應注意的事項，術前準備的注意事項，擬采用的手術入路的特點，手術前后治療用藥的目的及注意事項。通過健康使患者對疾病及手術方式均有所了解，消除其恐懼，增強其對疾病康復的信心，使患者在疾病治療中由被動變主動，積極配合治療和手術。
2.2 術前護理 良好的術前準備是腎上腺手術成功的先決條件之一，術前準備的好壞極大的著手術的恢復是否順利。
2.2.1 心理護理 此類疾病患者術前的心理狀態與其他疾病術前的心態并不完全相同，尤其是嗜鉻細胞瘤患者，因瘤體分泌大量腎上腺素和去甲腎上腺素，使患者的情緒一直處于高度緊張狀態，易致血壓波動［2］，加上對疾病缺乏了解和對手術的恐懼、憂慮等易致嗜鉻細胞瘤患者術前出現高血壓危象，因此護理上多關心安慰和疏導患者，為患者創造一個安靜、整潔、舒適、安全的環境，盡量減少一切不良刺激。對情緒激動不能入睡者遵醫囑給予鎮靜藥物，以保證患者充分的休息和足夠的睡眠。
2.2.2 術前協助患者完成全身檢查 包括血型、血尿常規、交叉配血試驗、肝功能、腎功能、心電圖、胸透、生理生化檢查、內分泌實驗室檢查，重要的是CT、MRI掃描明確病變的部位。
2.2.3 對不同手術入路的術前護理要點
2.2.3.1 皮膚準備 腹腔入路手術應注意臍部及會的清潔消毒，尤其是臍部，術前指導患者用肥皂水反復清洗臍部，然后再用蘸有0.5%碘伏棉球清除臍窩污垢并消毒數次；腹膜后入路則按傳統腎上腺手術范圍行皮膚準備。
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【摘要】 本研究的目的是改造豬紅細胞（pRBC）表面抗原，使之與靈長類動物相容，以探討異種輸血的可能性。結合使用α半乳糖苷酶(AGL)酶解和甲氧基聚乙二醇（mPEG）修飾改造豬紅細胞表面異種抗原，并輸注給獼猴，觀察pRBC在獼猴體內活存時間及安全性；使用免疫抑制劑（蛇毒因子CVF和地塞米松）延長pRBC在獼猴體內的存活時間；建立失血性貧血獼猴模型，觀察輸注pRBC治療失血性貧血獼猴的可能性。結果表明： AGL酶解能夠去除豬紅細胞表面主要異種抗原（α－Gal抗原），減弱其與獼猴血清的凝集反應，酶解技術與mPEG修飾技術結合可以使豬紅細胞與獼猴血清更為相容。異種輸血試驗表明，雙修飾的pRBC在獼猴體內存活時間為12小時，使用免疫抑制劑后，可延長至40小時；pRBC在獼猴體內8小時的存活率為38％，在輸注pRBC的8小時內，失血獼猴的血紅蛋白和紅細胞壓積可維持在失血前的正常水平。結論：改造后的pRBC可安全地輸注給獼猴，改善失血獼猴的貧血癥狀，提示用豬紅細胞進行異種輸血是可能的。
【關鍵詞】 豬紅細胞
Preliminary Study on Xenotransfusion from Porcine Red Blood Cell into Rhesus Monkey
Abstract In order to study the possibility of xenotransfusion from porcine red blood cell (pRBC) to primate，the antigens on pRBC surface were modified to make it more compatible to primate sera. Porcine RBCs were subjected to both enzymatic removal of membrane α-Gal antigens with recombinant α-galactosidase (AGL) and covalent attachment of succinimid propionate-linked methoxypolyethyleneglycol (mPEG-SPA) to camouflage non-αGal antigens. The effects of double modifications were determinated by hemagglutination and clinical cross-match testing with rhesus sera. In vivo clearance rates and safety of modified pRBCs were measured after it was transfused into Rhesus monkey with or without immunosuppressant treatment .The validity of pRBC was detected in exsanguine Rhesus monkey model. The results showed that AGL could effectively remove α-Gal xenoantigens on pRBC membrane and reduce hemagglutination. The combination of mPEG modification with AGL treatment could significantly increased compatibility between pRBCs and Rhesus monkey sera. Modified pRBCs were detectable in Rhesus monkey blood at 12 hours after transfusion，and their survival time was 40 hours in the immunosuppressant-treated Rhesus monkey. In vivo survival rates of pRBCs were 38% in exsanguine Rhesus monkey at 8 hours after transfusion，and during that time，the hemoglobin and hematocrit of Rhesus monkey were maintained at the same level as before it lost blood. It is concluded that the modified pRBC can be safely transfused into Rhesus monkey and relieve the anemic symptom exsanguine Rhesus monkey . It suggested that pRBC can be hopefully used as a blood substitute for primate and human in the future.
Key words porcine red blood cell；Galα1-3Gal；α-galactosidase；methoxypolyethyleneglycol；xenotransfusion blood
血液供應的嚴重短缺是臨床輸血面臨的難題。豬血液生理生化指標與人類非常接近，無傳染甲肝、乙肝和艾滋病等疾病的危險，因而近年來人們開始探討豬紅細胞作為人類紅細胞替代品的可能性，以緩解血源緊張的矛盾［1-4］。
豬紅細胞輸給人體會產生強烈的排斥反應，這主要是由豬紅細胞表面的異種抗原引起的。研究證明豬紅細胞表面存在兩類異種抗原，即α-半乳糖(α-Gal)抗原和非α－半乳糖(non-Gal)抗原。α-Gal抗原是主要異種抗原，它表達于除人和舊大陸猴外的所有哺乳動物體內，只是種類和個體間表達量有所差異［5-7］。人體內存在天然抗-α-Gal抗體，如果將豬細胞、組織和器官移植給人和靈長類， 人和靈長類會出現超急性排斥反應（HAR），導致移植物被迅速清除。研究表明，使用α半乳糖苷酶（AGL）能有效清除豬細胞表面Galα1-3Gal抗原（α-Gal抗原）末端的α-Gal殘基，減弱HAR的程度，延長移植物的存活時間［2，8，9］。甲氧基聚乙二醇（mPEG）是無毒性、無免疫原性的高分子化合物，已被用于修飾蛋白和多肽類藥物，延長藥物的半衰期，提高治療效果。國外和我們前期的研究均表明，mPEG可與人紅細胞膜表面的-NH2、-OH共價結合，非特異性地遮蔽血型抗原，修飾后的紅細胞與相應抗血清的凝集反應減弱或消失［10，11］。本研究結合AGL酶解技術和mPEG修飾技術，改造豬紅細胞（pRBC），檢測改造后的pRBC與獼猴血清的相容性。在此基礎上，把雙修飾的pRBC輸注到獼猴體內，觀察雙其在獼猴體內的活存時間，探討異種輸血的可能性。
材料和方法
血液和試劑
豬血液為無特定病原體的豬血，由北京市SPF育種中心提供；抗體：Isolectin B4-Biotin（Sigma），Streptavidin-FITC（Southern Biotech，USA）；試驗獼猴及獼猴血清由北京市動物園提供；基因重組咖啡豆α－半乳糖苷酶（rC－AGL，簡稱AGL）為本研究室研制；mPEG-SPA（20 kD）購自美國Nektar。
血液標本的采集與處理
頸靜脈采豬血，肝素抗凝，4℃保存?？鼓娜?00×g離心5分鐘，棄上層血漿，生理鹽水洗滌沉淀紅細胞。
AGL改造豬紅細胞及α-Gal抗原清除
取壓積pRBC，用等滲磷酸-檸檬酸-NaCl緩沖液（58 mmol/L Na2HPO4，21 mmol/L檸檬酸C6H8O7·H2O，77 mmol/L NaCl，pH 5.6±0.5，PCS）洗滌4次，按每毫升PCS紅細胞懸液中添加酶量為0、50、100 U，分別加入AGL，26℃反應2小時，PBS（pH 7.4）洗滌。
用PBS將酶解前后的pRBC稀釋為0.2％懸液，1.5%的多聚甲醛固定，室溫過夜，加入生物素標記的IB4凝集素，24℃反應2小時，PBS洗滌后加入FITC-鏈親和素，24℃反應30分鐘，PBS洗滌，用流式細胞儀（FACS Calibur，Becton Dickinson）檢測紅細胞表面的熒光強度，計算α-Gal抗原的清除率。
酶解后的豬紅細胞(EpRBC)的mPEG-SPA修飾
用PBS（pH 8.0）洗滌酶解后的pRBC 4次，稀釋成12%細胞懸液，在紅細胞懸液中加入mPEG-SPA至終濃度為1.0，2.0，3.0 mmol/L，混勻后25℃反應1小時，PBS洗滌紅細胞。
紅細胞與mPEG結合的兩相法檢測
文獻報道［12，13］，PEG8000 (Sigma) 和葡聚糖T500 (Pharmacia) 組成的兩相系統(5%葡聚糖 T500、35% PEG8000、0.15 mol/L NaCl、6.84 mmol/L Na2HPO4、3.16 mmol/L NaH2PO4，pH 7.4)可分離mPEG修飾的紅細胞。用50 ml的聚丙烯離心管盛兩相溶液，室溫靜止過夜，分層后，用吸管吸取上相（PEG），試管底部扎孔收集下相（葡聚糖），棄中間層（上下相在3天內使用）。取上、下相各500 μl于EP管中混合，mPEG-pRBC和對照紅細胞（108 cells/ml）各10 μl加到此EP管中，上下顛倒20次，靜止15分鐘，紅細胞在兩相中分配（設重復），計算上相中的細胞數與加入到系統中總細胞數的百分比，即為分配率，亦即被修飾的紅細胞比率。
雙修飾的pRBC與獼猴血清的配血實驗
2.0%的pRBC懸液20 μl，與40 μl獼猴血清混合，250×g離心30秒，肉眼和顯微鏡下觀察紅細胞凝集程度。
少量輸血實驗
5 ml AGL和mPEG修飾的壓積pRBC，PBS(pH 72)洗滌，加入異硫氰酸熒光素（FITC，Sigma）37℃反應20分鐘，生理鹽水洗滌，重懸至壓積為50％。在輸血前，將受血猴麻醉，分為3組： ①自身輸血組，受血猴取出10 ml猴血，離心去白細胞，熒光素標記后回輸；②無免疫抑制劑試驗組，將10 ml經FITC標記的雙修飾pRBC經靜脈輸入受試獼猴（體重約為6.0 kg）；③免疫抑制劑試驗組，將10 ml經FITC標記的雙修飾pRBC經靜脈輸入受試獼猴，受試猴接受免疫抑制劑處理。具體免疫方法為：在輸血前24小時，按0.05 mg/kg體重的量將蛇毒免疫抑制因子〖眼鏡蛇毒因子（cobra venom factor，CVF)，中國科學院昆明動物研究所研制］靜脈注射給受試猴，并在輸血前半小時靜脈注射地塞米松（5 mg，0.5 mg/kg）以及第二次注射CVF（200 μg，002 mg/kg），輸血后1小時再次靜脈注射地塞米松（5 mg）。整個試驗過程中，監測受試猴的心率、血壓；在輸血后的5、10、15、30分鐘及1、2、4、8、12、24、28、32、36、40、44、48小時取血，流式細胞儀檢測熒光細胞百分率，計算pRBC在獼猴體內的活存時間，并在輸血4小時后進行血常規、血生化和尿常規檢測。
失血猴模型輸血實驗
從獼猴體內放血12％（體重10 kg，放血100 ml），建立失血性貧血獼猴模型。將實驗分為兩組，其中一組輸入相同體積代血漿（羥乙基淀粉-鹽水注射液），另一組使用免疫抑制劑處理受試猴（方法同少量輸血試驗），輸入相同體積雙修飾的pRBC (40 ml壓積紅細胞)和代血漿（50 ml），靜脈滴注輸血，然后檢測失血前后及輸血/液后不同時間點的血紅蛋白(Hb)和紅細胞壓積(Hct)，并在放血前及輸血/液4小時后進行獼猴的血生化、尿常規檢測，記錄獼猴心率、血壓變化。
結 果
AGL酶解改造后的豬紅細胞表面抗原分析
IB4凝集素可特異地與以α-Gal為末端的多糖結合［14］，用來檢測酶解前后pRBC表面α-Gal抗原的變化情況。流式細胞術檢測結果表明，以未酶解pRBC的熒光標記率為100％，使用≥50 U/ml的AGL可有效清除pRBC表面主要異種抗原—α-Gal抗原，清除率達99.42%（圖1）。
紅細胞與mPEG結合的兩相法檢測
圖2為mPEG-SPA修飾的酶解后的豬紅細胞在兩相中的分配，從圖中可看出未修飾的紅細胞分布在界面下相，mPEG修飾的紅細胞均勻分布在上相，mPEG-SPA濃度為2.0 mmol/L時，＞80%的mPEG-RBC分布在上相，mPEG-SPA為3.0 mmol/L時，紅細胞的修飾率大于90%。這種技術對于規模化分離回收被修飾的紅細胞和應用于輸血是非常重要的。
AGL酶解和mPEG-SPA遮蔽雙修飾的pRBC與獼猴血清的配血試驗
AGL基本清除了pRBC表面的α-Gal抗原后，配血試驗顯示，EpRBC與猴血清仍然有凝集反應，但凝集程度有所減弱（從++++降到++），凝集時間延長。進一步使用mPEG-SPA修飾EpRBC，鏡檢結果表明，隨著mPEG-SPA濃度的升高，修飾的pRBC與獼猴血清的鹽水凝集反應逐步減弱，當mPEG濃度為2.0 mmol/L時，鹽水凝集反應完全消失（圖3），這說明AGL和mPEG-SPA雙修飾能有效清除和遮蔽豬紅細胞表面主要和非主要異種抗原。
轉貼于
少量輸血試驗
所有受試猴在輸血過程中和輸血后，呼吸、心率、血壓和血氧飽和度均無大幅度的波動，無明顯的輸血反應癥狀出現。流式細胞術檢測結果表明，輸入的pRBC約占獼猴體內總紅細胞數量的4％左右，這與理論值是一致的，以此為100％，計算輸血后不同時間點pRBC存活的百分率。檢測結果表明：自身回輸組，3天后檢測紅細胞存活率在90%以上；無免疫抑制劑試驗組，在輸血后12小時時仍可檢測到FITC標記的pRBC；免疫抑制劑試驗組，輸血8小時時有38%pRBC存活，而在輸血40小時后，獼猴體內仍可檢測到熒光標記的pRBC（圖4）。
受試猴的尿常規和血生化等多項指標檢測表明，各組的血清K、尿素氮，膽紅素和轉氨酶等均有一定程度的上升。值得注意的是，無免疫抑制劑試驗組總膽酸升高了15倍。尿常規指標中，無免疫抑制劑試驗組受試猴在輸豬紅細胞后，尿液中出現大量的尿膽原，尿蛋白和尿紅細胞（均為+++）；而免疫抑制劑組在輸豬紅細胞后，尿液中未出現尿膽原和尿蛋白，僅紅細胞有略微的增加，與自身回輸組相似（表1）。這些結果說明使用免疫抑制劑可減輕異種輸血的免疫反應。Table 1. Blood and urine biochemical analysis of autologous blood transfusion Rhesus monkey and transfused pRBC Rhesus monkey with or without immunosuppressant (CVF) treatment（略）
失血性貧血獼猴的pRBC治療
為了檢測雙修飾后pRBC是否在獼猴體內行使紅細胞的功能，我們建立了失血性貧血獼猴模型。獼猴失血約12％后，輸入代血漿-羥乙基淀粉，恢復血容量，失血獼猴出現貧血癥狀，表現為面色蒼白，血紅蛋白和紅細胞壓積降低等（3小時內Hb降低了15%，RBC降低了13%）（圖5）。失血后3小時，獼猴血清中乳酸脫氫酶(LDH，乳酸脫氫酶是一種糖酵解酶)的水平升高了約5倍，說明動物無氧酵解水平上升，提示動物處于缺氧的狀態；而輸入雙修飾pRBC治療的貧血獼猴，面色紅潤，輸血3小時后，LDH僅為放血前的1.5倍，明顯低于未治療貧血猴（表2）；其它生化指標變化不大。在輸血后8小時內，受試猴體內血紅蛋白和紅細胞壓積與失血前一致（圖5），維持正常水平，而未治療的獼猴在失血18小時內一直表現典型的貧血癥狀。這說明經酶解和mPEG包裹的雙修飾豬紅細胞輸給獼猴在一定時間內可發揮正常的攜氧功能，因此失血獼猴未出現失血后的貧血癥狀。這一結果提示異種輸血的可能性。Table 2. Blood and urine biochemical analysis of hemorrhagic Rhesus monkey and pRBC treated hemorrhagic Rhesus monkey（略）
討 論
據統計，我國每年的血液需求量為50億毫升，但目前的供應量僅為16億毫升，供需之間存在巨大差距，血液來源問題已經成為制約臨床輸血應用的瓶頸。在實行義務獻血法后供需矛盾更顯突出，很多病人由于不能及時獲得輸血治療而延誤搶救的最佳時機。為解決這一矛盾，人們開始尋找紅細胞代用品，其中以化學修飾的牛血紅蛋白和納米氟碳乳劑最為成功，但它們不完全具備有形紅細胞的功能。豬紅細胞無論從形態、結構，還是生理功能、生化特征，都與人紅細胞極為相近，近年來逐漸成為人紅細胞代用品研究的對象。
研究表明，將豬的細胞或器官移植到人體內，會引起強烈的免疫排斥反應，主要是超急性排斥反應（HAR），人血液中的天然抗體與豬細胞表面主要異種抗原α－Gal結合，激活補體系統，導致在數分鐘內被排斥。去除豬細胞表面的α－Gal抗原、抑制補體系統激活、清除人體內的天然抗體是克服HAR的三條技術途徑。異種輸血比異種器官移植更有可能實現，因為成熟紅細胞無核，缺乏細胞器，使用AGL可永久去除pRBC的α-Gal抗原。
為克服異種輸血的HAR，我們首先使用基因重組咖啡豆α-半乳糖苷酶(AGL)處理pRBC。結果表明，AGL可以有效地清除pRBC表面的α-Gal抗原，AGL濃度為50 U/ml時，抗原清除率達到99.4%以上。然而，AGL處理的pRBC與猴血清仍有弱凝集反應。這可能是由于pRBC表面還存在non－Gal抗原或殘存少量的α-Gal抗原分子，因此必須將異種抗原完全去除或遮蔽。為此，我們進一步用SPA端基活化的mPEG修飾AGL處理過的pRBC，mPEG-SPA與紅細胞膜蛋白以酰胺鍵的形式共價結合［10］，其形成的高度水化膜和柔韌的長鏈阻止抗體等大分子的進入，對抗原起到空間遮蔽作用。隨著mPEG-SPA濃度的升高，pRBC與獼猴血清的鹽水凝集反應進一步減弱，當mPEG的濃度大于2.0 mmol/L，凝集反應消失，提示雙修飾的pRBC與獼猴血清基本兼容。Doucet等［3］的研究結果表明，雙修飾對豬紅細胞的形態、結構、功能和變形性等均無明顯影響，我們前期的工作也得到了相同的結論。
據文獻報道，Eckermann等［2］曾用pRBC、AGL處理的pRBC、AGL處理的pRBC配合使用免疫抑制劑（CVF，補體抑制劑）及結合使用BSA-Gal分別輸給1只猩猩，試驗結果發現，pRBC相應的存活期分別為不到15分鐘、2小時、24小時和72小時。我們將雙修飾的pRBC對未處理獼猴進行少量輸血試驗，結果顯示 pRBC相應的存活期為12小時，比Eckermann報道的存活時間長5倍。我們的實驗還表明，使用CVF和地塞米松處理獼猴進行大量輸血試驗，輸血8小時后約有38％的pRBC存活，輸血40小時后仍可檢測到pRBC。結果說明mPEG可以遮蔽豬紅細胞表面的non-Gal抗原，使之與獼猴體內的天然抗體的反應能力減弱，降低遲發型排斥反應的程度；雙修飾的方法明顯優于AGL單處理法，能顯著降低異種輸血排斥反應的程度。
我們首次用雙修飾的pRBC配合使用免疫抑制劑治療失血性貧血獼猴，輸血后8小時內，受血獼猴的Hb和Hct恢復到和失血前水平，失血猴未出現面色蒼白等貧血癥狀，說明經酶解和mPEG包裹雙修飾的豬紅細胞可在一定時間內在獼猴體內發揮正常的攜氧功能，因此失血獼猴未出現貧血癥狀，尤其是在輸入修飾的pRBC后，血清中LDH水平升高幅度較貧血猴低，說明輸入的豬紅細胞能夠緩解動物的缺氧狀態。
在給獼猴輸入雙修飾的pRBC的異種輸血過程中，獼猴的呼吸、心率、血壓和血氧飽和度等指標均沒有明顯變化，這提示在異種輸血過程中受血獼猴的生命指標是平穩的，未出現劇烈的輸血反應。無免疫抑制劑試驗組獼猴的尿膽原，尿蛋白和尿紅細胞均出現強陽性，而使用免疫抑制劑試驗組和自身回輸對照組在尿中僅檢測到少量的紅細胞。我們推測，其機理是使用CVF抑制受試猴體內的補體系統，減弱了IgG介導的補體激活途徑，減輕了肝臟和腎臟損傷，因此免疫抑制劑試驗組的血生化和尿常規檢查指標均較無免疫抑制劑組正常。
試驗結果提示將經修飾的pRBC輸注給獼猴，即異種輸血是有可能的。本研究結果為實現將pRBC作為人紅細胞代用品，以及用pRBC搶救失血的珍稀動物，提供了有意義的參考。
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