前言：中文期刊網(wǎng)精心挑選了黃河的故事范文供你參考和學習，希望我們的參考范文能激發(fā)你的文章創(chuàng)作靈感，歡迎閱讀。

黃河的故事范文1

季靖舒

炎熱的夏天來了，崔老師帶著我們來到了黃河外灘游玩。

首先，我們進行了拍照和黃河簡介，然后又進行了野餐和燒烤活動。

開始野餐了，我們歡呼著拿出自己的東西，品味起來。我吃你一點，你吃我一口，吃得不亦樂乎！

野餐完成了就一起燒烤起來，我們把柴點著后，就用棍子把食物串起來。

一開始，我們都不敢靠近火堆，但是，我們還是三番五次地去嘗試，最后崔老師教我們怎么烤。我們把薯片、火腿腸都放進了灰里，不一會兒就可以吃了。我們品嘗著這天然的食品，可棒了！大家都發(fā)出一聲聲贊嘆：“真好吃！真好吃！”

然后，我們又去了黃河大橋……

我愛這次自然之旅，我愛那純天然的健康食品！

黃河的故事范文2

他兩歲多，坐在窗臺上。

爺爺在他兩個月大的時候從北京回來，見到這個長孫，當著全家人說，這孩子“近乎丑”！

不是隨便誰敢說這句話的。媽媽是本縣最高學府，女子小學校長，爸爸是男子小學校長。

晚上，媽媽把爺爺?shù)脑捀嬖V爸爸。“噯！無所謂。”爸爸說。

孩子腫眼泡，扁鼻子，嘴大，凸腦門，扇風耳，幸好長得胖，一胖遮百丑。

他坐在窗臺上。

前房九十五歲的瞎眼太婆（爸爸的祖母）坐在火爐膛邊的矮靠椅上：

“狗狗！”

沒有回答。

“狗狗！狗狗你在嗎？”

“在。”

“在，為哪樣不答應(yīng)我？”

“我怕跌，我下不來。”

“下不來，也好答應(yīng)嘛。”

“喔！”

“那你在做哪樣？”

“我沒做哪樣，我坐著。”

“噯！你乖，等響午炮爸媽就放學了――你想屙尿嗎？想就叫婆，婆在灶房。”

“我沒想屙尿。”

“那好！想講話嗎？想，就和我講……”

“講過了。”

太婆笑了。

一個太婆，一個婆，和狗狗。屋里就剩下他們?nèi)恕?/p>

太婆自己跟自己說：“都講過，喜喜和沅沅要來……”（喜喜是她大孫子的兒子，十二歲；沅沅是她嫁到面門上倪家藥鋪的孫女的第六個孩子，七歲。）“講來又不來，……唔，也該快了……”

狗狗有很多表姐表哥、堂姐堂哥，還有年輕的表叔堂叔，都輪著陪他玩。

他們不來，狗狗不能亂動。

窗臺木頭又厚又老，好多代孩子把它磨得滑溜滑溜了。一道雕花欄桿圍著，像個陽臺。三四個孩子在上頭也不擠。窗臺后面是張大寫字臺，兩頭各放著一張靠背椅。孩子玩膩了，便一層一層沿著下到地上。

寫字臺上有口放桃源石的玻璃缸子，一個小自鳴鐘，一個插雞毛撣子的瓷筒，婆的銅水煙袋。孩子頑得盡興，卻是從不碰倒擺設(shè)。

樓上樓下八間房帶前后堂屋，只有樓下四間房裝有欄桿供觀賞的大窗子。萬字、壽字格窗門內(nèi)開，糊著素凈的白“夾簾紙”。夏天冬天都顯得寧馨。

四扇窗子，以太婆的后房、婆房間的窗子最招孩子喜歡。大清早就有太陽。長到鼻子跟前的樹叢直漫到城墻那頭。過了城墻，綠草坡一層又一層，由綠漸漸變成的灰藍，跟云和天混在一起。

多少多少代的孩子都愛上這里來坐，像候鳥一樣。

狗狗坐在窗臺上。眼前的那些紅、綠、香味、聲音、雨點、太陽，只是母體內(nèi)子宮生活的延續(xù)。他什么也分辨不出。他吃飽了，他安全……他還需要一些時間才能“醒悟”，他沒想過要從窗臺上下來自己各處走走。即使想也不可能。要爬越后堂屋的門坎，繞過上樓大梯的梯腳，再翻更高的門檻才進入堂屋。堂屋兩邊各有四張?zhí)珟熞魏鸵粡埐鑾祝斨羞€有一個大方桌，底下藏著一張吃家常飯的小方桌。靠墻一口大神柜。處處埋伏的尖角很容易在腦門碰腫一個包。他小，他真的沒有想過。像出殼小鳥根本不曉得蛋殼對他曾經(jīng)有過什么貢獻和限制。

兩只雞娘在廚房后頭吵起來。雞娘特別像不高明的作家，稍微出兩本書就大喊大叫，弄得左鄰右舍心煩。不過雞蛋比那些大作要實際得多。

婆進房了。她和太婆都是小腳，地方熟，“定！定！定”走得一點也不困難。

“狗狗！快！婆抱你，撿蛋去！撿蛋給太看！”

“噢！”狗狗讓婆抱下地，再抱過兩重門坎，來到廚房。

雞窩是用幾個舊籮筐抹上黃泥谷糠做的，土磚砌的平臺，各挖一個洞，里頭墊上厚厚的稻草，夜間頂上一塊板子防黃鼠狼，樣子十分之大方，“豈止大方！簡直是莊嚴嘛！像個北京的天安門！”客人見了不免夸談。

這是孩子們的手筆。他們還計劃修一座長城咧！

“狗狗摸這里，啊！一個，是一個吧！狗狗別拿，熱！婆給你拿，熱蛋伢崽拿多了會臉紅――再摸這邊，進一點，啊！呸！呸！小手手一手雞屎，啊！不怕不怕！婆給狗狗洗――來來，過來這邊，哪！看看狗狗手手沒有雞屎了罷！還不行，還有臭臭，看婆給狗狗抹點皂角莢水，搓！搓！搓！搓！搓！搓！好，狗狗不動，等婆舀水來沖手手，狗狗搓手手啦！好，抹干凈手手，聞聞！不臭了！不是臭狗狗了！――歪尾巴雞娘不乖，屙屎不屙蛋，騙狗狗，等哪天婆宰了它，讓狗狗吃霸腿。”

婆婆捏著蛋，抱狗狗跨過兩道門坎進了堂屋。右手邊就是太婆的房門，還沒進房，太婆就說話了：

“狗狗告訴太，撿了幾個蛋？”

“蛋！太！太！蛋！”狗狗讓太婆拉近身邊。

婆把蛋遞給太婆：

“就一個，那只歪尾巴陪著吵，沒有蛋！”

“奧，臭，太，臭，臭！”狗狗叫著。

“晤！太哪里臭臭？太婆不臭臭！哦！妹崽，你把窗子關(guān)上算了，外頭花熏得我頭昏，你看，房里進來十只蜂子也不止，嗡里嗡嚨在耳邊鬧，莫叮著我狗狗。”

“等伢崽們來，你躲進帳子里，讓他們給撲了。”婆說。

“撲也莫撲，趕出去就是，做個蜂子也不容易，讓它們回窩吧！”

婆是太婆娘家的侄女，所以都姓鄧。婆沒念過書，太婆書讀得多，記性又好，后來嫁到張家，太公是個“拔貢”，縣志的主編，出版過詩集，所以濡染了一些冷雋的氣質(zhì)，至老年守寡瞎了眼睛，性情脾氣就更是十分之通達。

婆不愛講話，爺爺回來也沒有幾句話好說。有了狗狗這個孫子，有了伴；孫子沒生的時候，雞公、雞娘、雞崽，泡菜壇、酸菜壇、霉豆腐壇，就是她的伴。有時跟人去“趕場”，上山摘做粑粑的蒿菜、做“社飯”的社菜、煮蛋的“地地菜”、涼拌的“薺菜”、炒來吃的蕨菜，腌臘八豆豉，曬菜干；過年的時候指揮殺豬，招呼幫忙打粑粑的苗族漢子喝米酒。留辮子做妹崽家的時候，正是“長毛”作亂，殺人放火搶東西。熱天的晚上，坐在院壩里，興致來了，給孩子們講“長毛”故事；她不喜歡民國。她說她小時，一個“通眼錢”可以下一碗牛肉面。她也不喜歡孩子們買書，買玩意兒，讓她見了，就會囁嚅地表示不滿：

“一點用也沒有，買個東西吃在肚里實在！”

她已經(jīng)六十多歲了，太婆還叫她“妹崽”，做了婆，還伸不起腰。

關(guān)窗時她伸頭看了一下院子：

“姑！今年花開得也實在放肆，連墻都貼上了。”

太婆沒笑，“都是鏡民做的好事，你看你那個鏡民！”鏡民是爺爺?shù)拿郑诺恼煞颉?/p>

爺爺年輕時候外出多年，偶然回家逢到春天興致好，便約了一幫朋友城外踏青。一路出東門，過大橋，下沙灣，左邊是“諸葛亮”，右邊是“回龍閣”，正對的“萬壽宮”，沿河吊腳樓前后左右、高低上下伸出許多花樹，忍不住見一棵愛一棵；加上大橋二十八間玲瓏剔透小屋子窗格里伸出的竹竿晾著五彩衣物，一齊影在太陽下，映在水面上，蕩漾出條條彩色亮光。

巖鷹在天上打團團嚶嚶叫，鐵匠弄得周圍同聲叮哨，賣“葉子粑粑”老太太的女中音，“霉――豆腐”和“鹽――豆腐――干咧！”的男低音，以及呼狗吃伢崽屎的高亢女高音，都引出遠游還鄉(xiāng)人的特殊情緒。便認為那樣好看。便學著人家一棵棵樹苗買回來栽在院子里。院子說大也大，七分地容得下三四十棵樹苗，桃、李、梨、杏、橘、抽一應(yīng)俱全，年年次第開花。爺爺開初按著李笠翁的經(jīng)驗這邊一剪刀，那邊一斧子，享受了三兩回田園之樂，后來人在北京做事，兒子們也北京、奉天、上海、杭州、武漢、長沙四處跑，剩下兩位老太婆媳倆，何況其中一個還是瞎子，李笠翁興趣變成龔定庵的“病梅館”，只好放手那些花木愛怎么長就怎么長了。院子已經(jīng)不成其為院子，樹混在一起也分不出樹名，當中一條碎石板鋪成二尺多寬通向大門的路之外，不見一尺空地。

滿院子十來種果子雜花交壘一起，加上千千萬萬蜜蜂轟成一團。親戚晚輩時不時來看太婆，太婆就會說：“男人不在家，看這些花好欺侮人。”

“妹崽！有人敲門！”太婆說。

黃河的故事范文3

敦煌文獻為歷史學提供了一大批內(nèi)容豐富的研究資料，隨著時間的推移和研究的不斷深入，人們對其史料價值的認識也在不斷深化。以今天的認識水平觀察，它至少在以下一些方面對歷史學具有獨特價值。

其一，它為我們?nèi)妗⑸钊搿⑾到y(tǒng)地考察中古時期的一個地區(qū)提供了相對充足的研究資料。與甲骨文和漢晉簡牘等其他出土文獻相比，敦煌文獻具有以下特點。首先，它涉及的學科和方面較多。僅對歷史學而言，就涉及政治、軍事、經(jīng)濟、宗教、文化等各個領(lǐng)域的諸多方面。其次，每件文獻所包含的內(nèi)容也相對比較豐富。再次，它涉及的時間較長，自5世紀初至11世紀初將近6個世紀。即使文獻年代比較集中的8 世紀中至11世紀初，亦達200多年。最后， 全部文獻都與敦煌地區(qū)有不同程度的關(guān)系或聯(lián)系。就世界范圍來看，具備以上條件的出土文獻似也為數(shù)不多。如果我們依據(jù)這些資料對中古時期敦煌社會的各個角度、各個層面作全方位的考察，其成果將為學術(shù)界認識中古社會的具體面貌提供一個模型或參照系。這當然有助于推進人們對中古時期社會的進一步認識。顯然，對歷史學而言，解剖敦煌這樣一個麻雀，其意義會超出敦煌地區(qū)。而敦煌文獻為解剖這個麻雀提供了必要條件。

本文的簡略回顧表明，數(shù)十年來，我國學者在這一方面已做了許多重要準備工作。如對歸義軍政治史的研究、對敦煌歷史地理的研究等都已經(jīng)相當深入，并有總結(jié)性論著問世。有的相關(guān)類別文書如碑銘贊類文書和契券文書的整理和研究也已達到較高水平。但仍有許多方面需要加強，不少方面有待展開。如歸義軍時期的經(jīng)濟史、佛教史、社會史和文化史等方面都值得投入更多的力量進行更加深入的研究。有些方面甚至需要較長時間的準備以后才能進行總結(jié)。如敦煌佛教史需要對相關(guān)文獻進行系統(tǒng)整理和研究，完成“敦煌佛寺志”、“敦煌的佛教與社會”等系列專題研究以后，才有可能在這方面進行總結(jié)性研究。敦煌社會史也要在完成“敦煌氏族志”等系列專題研究后才有可能進行總結(jié)性研究。至于敦煌文化史，我們以前做的工作就更有限，大量的工作有待展開。可見，在本世紀的最后幾年和下一個世紀，專題研究應(yīng)進一步加強。因為只有在深入的專題研究的基礎(chǔ)上，才有可能寫出有分量的專史，而各方面專史的完成又是全面綜合研究的必要準備工作。在從事專題研究過程中，需要完成大量艱苦的微觀考察。不少工作表面看來十分細碎甚至繁瑣，無關(guān)大局，如過去我們對歸義軍政治史許多小問題的探索就容易使人產(chǎn)生這樣的印象，但這些微觀探索又是我們?nèi)妗⑸钊搿⑾到y(tǒng)地考察敦煌地區(qū)必不可少的工作。當我們將這些具體的探討整合為對整個敦煌地區(qū)的微觀透視時，就會發(fā)現(xiàn)在敦煌文獻研究領(lǐng)域，微觀考察的意義不同一般。

當然，要完成對敦煌地區(qū)的全方位考察，僅靠專題研究還遠遠不夠。必須同時積極開展綜合研究與宏觀研究。在第一、二階段，我國學者因受到資料的限制，往往只能就所見少量文書或一件文書進行闡發(fā)，研究是點式的，很難做專題或綜合研究。到第三階段，我們能見到的材料日益增多，對敦煌文獻做分類整理或?qū)ｎ}研究的學者也逐漸增多。但對各類文書、各個專題、各個學科進行的綜合研究還很薄弱，將敦煌地區(qū)作為一個整體進行研究的工作也有待展開。就目前而言，首先應(yīng)注意從整體上把握敦煌文獻。敦煌文獻雖然分屬各個學科，可以分為許多類別，但同時又是一個整體，各類文獻之間存在著密切的聯(lián)系。如人們利用有關(guān)10世紀的一大批文書研究這一時期的政治、經(jīng)濟、宗教和社會，已取得了很大成績，若在此基礎(chǔ)上將這一時期的各類文書打通，相信對這一時期整個社會的了解將更加全面，更加深入。其它如對歷史資料與文學史資料等各學科之間聯(lián)系的研究，漢文歷史文獻與藏文歷史文獻等各文種之間聯(lián)系的研究，也都是具有很大潛力的研究領(lǐng)域。在下一個世紀，當各個專題和綜合研究都達到較高水平的時候，我們就可以考慮撰寫貫通中古時期敦煌政治、經(jīng)濟、社會、宗教、文化等領(lǐng)域的《敦煌中古史》了。

其二，敦煌文獻為我們進一步研究9世紀中葉至11 世紀初西北地區(qū)的民族史提供了提供了大量原始資料。9世紀中葉至11世紀， 是我國西北地區(qū)民族發(fā)生大變動的時期。但傳世史籍有關(guān)這方面的記載較少，很難據(jù)之進行深入系統(tǒng)的考察。敦煌文獻中保存了一批反映這一時期民族情況的漢文、藏文、回鶻文、于闐文、粟特文公私文書，為我們探討西北地區(qū)民族變遷、各民族的政治經(jīng)濟文化狀況與相互間的交往提供了可能。本文的回顧表明，我國學者在利用這些資料方面已取得很大成績。特別是第三階段，我們不僅在利用敦煌漢文文獻研究西北地區(qū)民族問題方面取得了不少成果，在對少數(shù)民族文字歷史文獻的整理和研究方面也有較大進步。同時應(yīng)該承認，我們這方面的工作做得還很不夠，與國外同行相比還存在不少差距。在少數(shù)民族文字文獻研究方面，一些文種與國外的研究水平差距還比較大，取得的成果仍以第二次譯釋居多，能直接解讀少數(shù)民族文字文書的學者亦嫌太少。所以今后應(yīng)進一步加強對少數(shù)民族文字文書的整理和研究。特別是藏文文獻，數(shù)量很大，值得投入更多的力量進行全面的整理和研究。另一方面，在研究西北地區(qū)民族問題時，應(yīng)提倡在全面搜集各方面資料的基礎(chǔ)上將敦煌漢文文獻、各民族文種文獻與傳世文獻融會貫通。只有這樣，才有可能得出比較合乎實際的結(jié)論。以往有關(guān)這方面的研究所以分歧較多，一個重要原因就是一些研究者有時僅據(jù)部分材料就勿忙做出了結(jié)論。

其三，敦煌文獻還為解決中國古代史上的一些重大問題提供了材料。古代的敦煌是中國的一個地區(qū)。所以，敦煌文獻不僅對了解敦煌地區(qū)具有重要意義，其中的許多材料還反映了中原地區(qū)的一般情況。我國學者在利用這些材料方面也做了許多工作。如均田制即屬中國古代史的重大問題，但在敦煌文獻發(fā)現(xiàn)以前，對其實施情況的研究始終無法深入。我國學者主要依據(jù)對敦煌文獻中有關(guān)材料的具體探討，才為均田制實施與否的爭論畫上了圓滿的句號，并對均田制的實質(zhì)形成了新的認識。又如本文所述我國學者對敦煌法律文書的持續(xù)探索，不僅解決了許多有關(guān)唐律和唐代歷史的具體問題，還使學術(shù)界對久已亡佚的唐代令、格、式等法律文獻的形式、內(nèi)容、性質(zhì)有了具體而形象的了解，并為令、格、式的輯佚提供了樣式。再如本文所述我國學者對唐代勾官的研究，也是在具體探討敦煌、吐魯番文獻中有關(guān)勾官進行勾檢的記錄的過程中，逐漸形成了對唐代勾官和勾檢制度的整體認識。對敦煌文獻中反映中原地區(qū)一般情況的材料作微觀考察，容易使人產(chǎn)生細碎繁瑣的感覺，但從中獲得的知識不僅有助于認識同期中原地區(qū)的情況，有時對認識某一事物或社會現(xiàn)象在整個中國古代的發(fā)展脈絡(luò)亦有助益。如前述我國學者對中國古代社邑發(fā)展情況的探討和對中國古代書儀源流的考察，都在不同程度上借助了從相關(guān)敦煌文獻研究中獲得的認識。

我國學者在利用敦煌文獻解決中國古代史上的問題方面雖然做了不少工作，但在這方面仍有許多工作有待完成。如有關(guān)佛教史和社會史方面的資料就利用得很不夠。在今后的研究中應(yīng)提倡將敦煌文獻放到更大的背景下進行考察，在對敦煌文獻和傳世文獻、石刻文字中的相關(guān)資料作徹底調(diào)查的基礎(chǔ)上，將敦煌文獻中有關(guān)某一專題的資料放到唐宋時期甚至中古時期的歷史背景下進行考察。

其四，古代的敦煌是中國和世界接觸的窗口。所以，敦煌文獻中保存了不少反映中西經(jīng)濟文化交流的資料。我國學者利用這些資料探索中國與印度、中國與波斯等地的經(jīng)濟文化交流，探索絲綢之路的貿(mào)易等課題都取得了重要成果。但與敦煌文獻中保存的這方面材料相比，還有許多工作可做。特別是在唐代，敦煌匯聚了中國、希臘、印度、中亞、西亞等不同系統(tǒng)的文化，這些在敦煌文獻中都有不同程度的反映。站在中古時期世界文化交流的高度，全面系統(tǒng)地發(fā)掘敦煌文獻中有關(guān)這方面的信息，將是21世紀的一項重大課題。

以上分析表明，我國學者在20世紀雖然取得了令世人矚目的成績，但尚未解決的問題和有待開展的工作更多。所以我們有必要認真總結(jié)過去的經(jīng)驗，力爭在21世紀取得更大的成績。回顧20世紀我國學者利用敦煌文獻研究歷史的歷程，似有以下一些因素對研究的進展和研究水平的提高具有較大影響。

第一是資料的限制。對我國一般史學工作者而言，在前兩個階段能見到的敦煌文獻數(shù)量有限。雖然在第二階段我國已有英藏敦煌文獻主體部分的縮微膠卷，由于種種原因，能直接利用的人很少。多數(shù)史學工作者了解、利用敦煌文獻仍主要依靠少量很不完善的敦煌文獻錄校本。到第三階段，我國學者終于可在國內(nèi)看到英、法和北圖所藏敦煌文獻的主體部分。但有關(guān)敦煌文獻的縮微膠卷和影印圖集實際上只有少數(shù)高校和科研單位有條件購置，對多數(shù)史學工作者來說，查閱敦煌文獻仍有諸多不便。另一方面，由于敦煌文獻多為寫本，其中保存了大量的唐宋時期的俗體字和異體字，還有不少寫本使用河西方音。這就要求閱讀某件文書的學者不僅要掌握該文書有關(guān)學科的專門知識，還應(yīng)當對敦煌的歷史、敦煌俗字及河西方音等整理敦煌文獻所需的專門知識有比較深入的了解。否則，即使有條件直接查閱敦煌文獻，在閱讀過程中也會遇到重重困難。正是由于這一原因，使得擁有縮微膠卷和圖集的單位，其資料使用率并不高，查閱者多為專門或主要研究敦煌文獻的學者。一般史學工作者了解、利用敦煌文獻仍主要依靠錄校本。可見，資料方面的限制，一直是影響我國史學工作者了解、利用敦煌文獻的重要原因。解決這方面的問題應(yīng)是21世紀的首要任務(wù)。因采用先進技術(shù)重排、精印敦煌文獻圖版是正確釋錄文字的前提，所以應(yīng)在現(xiàn)有基礎(chǔ)上加快敦煌文獻圖版的編輯、出版步伐，力爭在下一世紀初葉完成這項工作。同時加快對敦煌文獻的整理、錄校工作，這既包括分類對敦煌文獻進行錄校，也包括按號對敦煌文獻作全面錄校。目前，分類錄校正在有計劃地進行，全面錄校的工程也已啟動。這項工作是將敦煌文獻推向?qū)W術(shù)界的基礎(chǔ)工程，是為史學工作者解除資料方面限制的關(guān)鍵步驟，希望能得到各方面的重視和支持，爭取在下一世紀的前20年完成此項工作。當然，錄校工作一定要保證質(zhì)量。近年出版的一些錄校本即因質(zhì)量不佳受到學術(shù)界批評。

第二是史學觀念的影響。在第一階段前一時期，用傳統(tǒng)方法治學的羅振玉等人對歷史典籍和有關(guān)政治史的資料比較感興趣。后一時期陶希圣利用《食貨》出版《唐戶籍簿叢輯》，顯然是其社會史史觀使然。第二階段我國學者對社會經(jīng)濟資料關(guān)注較多，也明顯受到用史觀研究社會經(jīng)濟史風氣的影響。在第三階段，隨著各種新的史學觀念和新方法的流行，利用敦煌文獻研究歷史各方面問題得以全面展開，其中尤以社會史觀念的重新流行影響最為顯著。數(shù)十年的敦煌文獻研究史表明，新的史學觀念和新的研究方法有利于多角度、多層次、全方位地發(fā)掘敦煌文獻的史料信息，應(yīng)該大力提倡。

第三是對利用敦煌文獻意義的認識。1930年，陳寅恪先生在《敦煌劫余錄》序中指出，“一時代之學術(shù)，必有其新材料與新問題。取用此材料以研究問題，則為此時代學術(shù)之新潮流。治學之士得預(yù)于此潮流者，謂之預(yù)流（借用佛教初果之名）。其未得預(yù)者，謂之未入流。此古今學術(shù)之通義，非彼閉門造車之徒所能同喻者也。敦煌學者，今日世界學術(shù)之新潮流也”。在這里，陳先生從學術(shù)發(fā)展史的高度闡述了參與研究敦煌文獻的重要意義。數(shù)十年來，陳先生的論述激勵幾代學人積極投身整理、研究、利用敦煌文獻的行列。今天，出土近百年的敦煌文獻似已無資格被稱為新材料了，但與敦煌文獻所蘊藏的豐富史料信息相比，史學界對它了解和利用仍很不夠。如在歷史典籍方面，建國后出版的標點本史籍不只一種未能吸收敦煌學界整理和研究相關(guān)敦煌寫本的成果。再以唐史研究而言，不少學者在搜集資料時可以遍讀與唐代有關(guān)的文獻，卻很少有人將敦煌文獻列入自己的閱讀范圍。結(jié)果是其它方面的有關(guān)材料幾乎被網(wǎng)羅殆盡，惟獨遺漏了敦煌文獻中的相關(guān)材料。這是有的非常優(yōu)秀的著作存在美中不足的原因之一。就目前的條件而言，一般史學工作者了解、利用敦煌文獻雖說還存在不少困難，但與前兩個階段相比，這些困難還是可以克服的。如果說在前兩個階段阻礙史學工作者了解、利用敦煌文獻的主要是客觀條件的話，現(xiàn)在則是主觀因素起的作用愈來愈大了。所以我們應(yīng)進一步增強利用敦煌文獻的意識。對一般歷史工作者來說，至少應(yīng)注意了解敦煌文獻的研究情況，及時吸收相關(guān)的研究成果。對唐五代史學工作者而言，似應(yīng)將敦煌文獻列為必讀史料。因為敦煌文獻的大部分成于唐五代宋初期間，對其進行系統(tǒng)閱讀不僅可搜集到與自己研究課題相關(guān)的資料，還可加深對這一階段社會的了解和理解。轉(zhuǎn)貼于

黃河的故事范文4

 一、工程設(shè)計概況

    黃河下游放淤固堤工程設(shè)計水平年為2000年，防洪標準為防御花園口洪峰流量22000m3／s，相應(yīng)高村、孫口站的設(shè)防流量分別為20000m3／s、17500m3／s。

    根據(jù)大堤概化斷面，淤區(qū)頂部高程為堤背側(cè)浸潤線出逸點高程加1．5m，浸潤線坡度為：險工段1∶10，平工段1∶8。2001年以來，凡新設(shè)計的放淤固堤工程，不論平工段、險工段，淤區(qū)頂部高程全部改為與2000年設(shè)防水位齊平。

    淤區(qū)寬度按大堤概化斷面推算為100m，邊坡1∶3，村莊相對密集的堤段，根據(jù)實際情況按100m、80m、60m設(shè)計。

    淤區(qū)沿堤線布置在背河側(cè)，淤區(qū)周圍布置圍堤，圍堤外側(cè)布設(shè)截滲溝及退水渠，淤沙完成后，進行包邊蓋頂，在頂部沿外側(cè)修筑縱向圍堤，淤區(qū)內(nèi)每隔100m修筑格堤一道，在淤區(qū)頂面與堤坡交匯處沿淤區(qū)縱向布設(shè)排水溝1條，淤區(qū)邊坡每隔100m設(shè)1條橫向排水溝。

    二、工程設(shè)計及施工中存在的問題

    1．滲水嚴重

    淤區(qū)土質(zhì)主要是粉質(zhì)細沙，顆粒較粗，滲水嚴重，一般浸潤范圍30～50m，滲水引起附近土地鹽堿化，影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，為阻止浸滲，雖然在淤區(qū)外挖了截滲溝，并與退水渠連通，但由于堤根地勢低洼，截滲溝內(nèi)常年積水，滲水浸滲問題仍沒有得到徹底解決，有些工程淤沙完成后，較長一段時間仍然有滲水排出。

    2．圍格堤修筑困難

    設(shè)計中圍格堤分兩期修筑，一期圍堤采用推土機從淤區(qū)內(nèi)推土填筑，二期圍堤采用淤區(qū)沙土用推土機修筑，工程量根據(jù)淤區(qū)頂寬分別為淤沙土方量10％～15％，但是凡大堤背河大多地勢低洼，地下水位高，利用淤區(qū)內(nèi)的土修筑圍堤極為困難，二期圍堤采用淤區(qū)沙土修筑，滲水將更加嚴重。

    3．因滲水、退水引起的各項費用嚴重不足

    工程設(shè)計中，只考慮了截滲溝、退水渠開挖土方和退水渠占地補償，但是實際施工中，工程滲水影響達30～50m寬，滲水在工程完成后較長一段時間內(nèi)仍然存在，退水渠兩側(cè)也存在滲水問題，加之因遷占問題造成工期延長較為普遍，造成退水渠占地補償費增加，另外施工期間還需對截滲溝和退水渠進行清淤，工程完成后進行回填平整。

    4．清基費用偏低

    設(shè)計中清基費按工程長度計算為1萬元／km，按照施工規(guī)范要求進行清基施工，該費用遠遠不夠，特別是有房屋搬遷的段落，淤區(qū)內(nèi)建筑垃圾及雜物較多，此時費用更高。

    5．堤身裂縫問題普遍存在

    凡是放淤固堤工程施工的堤段，背河堤身均出現(xiàn)不同程度的縱向裂縫，造成裂縫的原因，筆者認為堤身經(jīng)過長期浸泡，加之隨著淤沙土方的加載，造成背河地面沉陷，引起堤身裂縫，處理裂縫的費用設(shè)計中沒有考慮，管理單位的工程歲修費非常緊張，因此處理裂縫的經(jīng)費沒有著落。

    三、幾點建議

    1．圍堤的設(shè)計與施工

    設(shè)計應(yīng)為施工創(chuàng)造條件，圍堤是工程施工的關(guān)鍵工序，其質(zhì)量好壞直接影響施工安全和施工進度，因圍堤質(zhì)量不好而造成決口的事故時有發(fā)生，筆者認為圍堤的設(shè)計標準及施工方式不能搞一刀切，應(yīng)根據(jù)工程實際情況進行設(shè)計和施工，應(yīng)考慮以下幾個方面：

    （1）符合防滲要求，圍堤土質(zhì)應(yīng)為壤土并分層碾壓，干密度應(yīng)在1．5t／m3以上，堤身斷面符合穩(wěn)定要求。一期圍堤盡量在淤區(qū)內(nèi)取土，因淤區(qū)內(nèi)地勢低洼不能取土的，應(yīng)考慮遠調(diào)土，二期及三期圍堤不宜采用淤區(qū)內(nèi)的沙土，實踐證明，淤區(qū)滲水和坍塌最嚴重的部位就是在用沙土修做的二期或三期圍堤上，因此二、三期圍堤應(yīng)全部使用遠調(diào)土，并層層碾壓，干密度在1．5t／m3以上。

    （2）淤沙施工前，在圍堤內(nèi)坡輔設(shè)防滲塑料薄膜，根據(jù)施工進度向上搭接，經(jīng)實踐證明，該方法的防滲效果較好。

    （3）圍堤修建費用應(yīng)根據(jù)工程實際確定，工程量、運距及工程單價應(yīng)根據(jù)具體情況分別計算、分析，確定工程費用。

    2．截滲溝設(shè)計與施工

    目前，截滲溝修建在柳蔭地內(nèi)，因地勢低洼常年積水，造成附近30～50m內(nèi)的農(nóng)田減產(chǎn)，有居民的段落，房屋和庭院內(nèi)長期潮濕，引起當?shù)厝罕姷牟粷M，進而阻撓施工、影響進度。解決上述問題的途徑有兩個：一是在截滲溝外側(cè)輔設(shè)防滲塑料薄膜，并壓土防曬；二是給受損群眾一定的補償費，按30～50m寬計算，每年每畝補償兩季青苗費，兩者可選其一；另外還要定期對截滲溝進行清淤，保證出水暢通。

    3．退水渠設(shè)計與施工

    施工退水也是放淤固堤工程的重要工序之一，直接影響施工進度，從近幾年的設(shè)計和施工情況來看，設(shè)計部門對退水排放設(shè)計重視不夠，只列入少量退水渠占地補償和開挖土方，與實際施工情況不符。下游堤防普遍存在堤根地勢低洼，因此退水較為困難，設(shè)計時應(yīng)考慮以下幾點：選好排水口，進行實地測量，根據(jù)實際地形繪制斷面圖，進行退水渠工程量計算，確定施工方法，根據(jù)實際計算工程費用。應(yīng)考慮防滲費用，具體辦法同截滲溝。解決好因退水渠開挖引起的生產(chǎn)、交通等問題。

    4．背河生產(chǎn)輔道設(shè)計

    黃河下游堤防近堤村莊和生產(chǎn)輔道密集，放淤固堤工程的施工，對近堤群眾的生產(chǎn)、生活影響較大，對這一問題設(shè)計中考慮較少。因工程施工打亂了當?shù)厝罕娚a(chǎn)交通體系，應(yīng)根據(jù)實際情況，適度增加生產(chǎn)輔道，對原有的生產(chǎn)輔道，須考慮遠調(diào)土加高、幫寬、延長，同時考慮因幫寬、延長引起的地面附著物拆遷。

    5．設(shè)計施工應(yīng)為工程管理和土地開發(fā)創(chuàng)造條件

    考慮到今后工程管理和土地開發(fā)，設(shè)計中列入了包邊蓋頂和排水溝及植草、植樹，為更好地進行土地開發(fā)，筆者認為還應(yīng)增列以下項目：（1）淤區(qū)水利配套，包括水利設(shè)施、機械、電力等。（2）管理房屋、上堤道路（需硬化）等管理設(shè)施。

    6．裂縫處理

黃河的故事范文5

關(guān)鍵詞：霜脲氰；喹啉銅；黃瓜；殘留；風險評估

中圖分類號：TQ450.2+63文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）05-0122-05

霜脲氰（cymoxanil），化學名稱2-氰基-N-[（乙酰基）羧基]-2-（甲氧基亞胺基）乙酰胺，是20 世紀70 年代美國杜邦公司研制的一種殺菌劑，主要用于防治黃瓜、葡萄、馬鈴薯等的霜霉病[1～5]。喹啉銅（oxine-copper）是一種廣譜、高效、低殘留的內(nèi)吸性鉗合態(tài)有機螯合銅殺菌劑，對真菌、細菌性病毒具有良好的預(yù)防和治療作用[6，7]。它與霜脲氰結(jié)合使用可以有效防治黃瓜霜霉病，降低霜霉病帶來的經(jīng)濟損失，具有很好的市場潛力和廣泛的應(yīng)用前景，但長期、大量使用該農(nóng)藥會對食品和環(huán)境帶來潛在的危害。

劉明洋等[14]建立了利用高效液相色譜測定葡萄及其土壤中霜脲氰殘留量的分析方法；郭利豐等[11]采用氣相色譜法對33.5%喹啉銅懸浮劑進行了分析研究；李國平等[13]采用高效液相色譜法測定了混劑中的喹啉銅；周夢春等[7]建立了喹啉銅在番茄中的殘留分析方法。雖然關(guān)于霜脲氰和喹啉銅在農(nóng)作物中的殘留已有報道[8～14]，但全面系統(tǒng)的研究報道少見，而有關(guān)同時測定霜脲氰和喹啉銅在黃瓜中的殘留情況尚未見報道。本試驗采用高效液相色譜法對40%霜脲氰?喹啉銅懸浮劑在黃瓜及土壤中的殘留動態(tài)和最終殘留展開研究，以探明其在黃瓜上的殘留規(guī)律，并為其合理使用提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

Waters 2695高效液相色譜儀，紫外檢測器（Waters公司）；超聲波清洗儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；水浴振蕩器（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；電子天平（METTLER）。

40%霜脲氰?喹啉銅懸浮劑（霜脲氰10%，喹啉銅30%，青島東生藥業(yè)有限公司提供）；霜脲氰、喹啉銅標準品（純度分別為99.0%、98.5%，由青島東生藥業(yè)有限公司提供）；乙腈、甲醇為色譜純；氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸均為分析純。

供試作物：津選優(yōu)1號、津春4號黃瓜。

1.2田間試驗方法

參照農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所制定的《農(nóng)藥殘留試驗準則》[15]和《農(nóng)藥登記殘留田間試驗標準操作規(guī)程》[16]，于2012～2013年分別在山東、河北、安徽三地進行了消解動態(tài)試驗及最終殘留試驗。

1.2.1消解動態(tài)試驗在黃瓜幼果期施藥，施藥時應(yīng)保證用于動態(tài)試驗的黃瓜均勻著藥。施藥劑量為40%霜脲氰?喹啉銅懸浮劑540 g a.i./hm2，施藥后2 h、1、3、5、7、14、21、30、45 d采集黃瓜樣品。在試驗小區(qū)內(nèi)隨機取樣，每個小區(qū)不同方向及上下不同部位采集6條以上（不少于2 kg）生長正常、無病害、成熟的黃瓜，用不銹鋼刀切成1 cm大小的碎塊，在不銹鋼盆中充分混勻，用四分法切分樣品，分取兩份150 g的樣品，分別裝入封口樣品容器中并進行標記，于-20℃冰柜中保存。

1.2.2最終殘留量試驗設(shè)兩個施藥劑量：低劑量為360 g a.i./hm2，高劑量為540 g a.i./hm2。各設(shè)3、4次施藥，施藥間隔期7 d，每處理設(shè)3次重復(fù)。最后一次施藥后1、2、3、5 d采集黃瓜樣品及土壤樣品。另設(shè)空白對照，處理間設(shè)保護隔離帶。黃瓜樣本的采集方法同動態(tài)試驗。

1.3分析方法

1.3.1樣品提取、凈化將切碎的黃瓜樣品混勻，稱取10.0 g于勻漿機中，加入40 mL乙腈，高速勻漿 2 min，過濾至裝有7 g氯化鈉的具塞量筒中，劇烈振蕩2 min，靜置20 min，取20 mL上層有機相于平底燒瓶中，減壓濃縮至近干，用甲醇定容至5 mL，待測。

1.3.2儀器條件檢測器： Waters 2695高效液相色譜儀，紫外檢測器；檢測波長：250 nm；色譜柱：VP-ODS C18柱，250 mm×4.6 mm；流動相：甲醇-水（V∶V=40∶60）；流速：0.8 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫：30℃。

1.3.3結(jié)果計算采用外標法峰面積定量。一定范圍內(nèi)峰面積響應(yīng)值（Y）和進樣量（X）有良好線性關(guān)系。用霜脲氰標準品配制0.05、0.1、0.5、1.0、10.0 μg/mL標準溶液，在上述儀器條件下檢測，霜脲氰進樣量在1×10-9～2×10-7 g之間有良好的線性關(guān)系，直線回歸式為：Y=3444.5X-1459.2，R2=1.0000。用喹啉銅標準品配制0.05、0.1、0.5、1.0、5.0 μg/mL標準溶液，在上述儀器條件下檢測，喹啉銅進樣量在10-9～10-7 g之間有良好的線性關(guān)系，直線回歸式為：Y=3949X-5120.5，R2=0.9993。

1.3.4方法靈敏度、準確度及精密度在上述色譜條件下，霜脲氰、喹啉銅的最低檢出量為10-9 g。霜脲氰和喹啉銅在黃瓜中的最低檢出濃度均為0.05 mg/kg。用未施藥的黃瓜空白樣品進行3個濃度的添加回收試驗，霜脲氰添加量分別為0.05、0.5、1.0 mg/kg，喹啉銅添加量分別為0.05、1.0、2.0 mg/kg，每個添加濃度進行5次平行測定，設(shè)空白對照。霜脲氰和喹啉銅在黃瓜中的添加回收率分別為95.8%～110.9%和108.3%～110.9%，相對標準偏差分別為3.6%～4.5%和3.9%～5.1%。本方法有較好的準確度及精密度，符合農(nóng)藥殘留檢測要求（色譜圖見圖1）。

1.4膳食暴露和風險評估

霜脲氰和喹啉銅在黃瓜中的長期膳食風險評估分別由公式（1）、（2）計算得出。

國家估算每日攝入量（NEDI）[17，18]：

式中：Fi為我國一般人群對某一農(nóng)產(chǎn)品或食品的日攝入量，kg/d；STMRi為規(guī)范殘留試驗中值，本文中采用黃瓜殘留試驗數(shù)據(jù)的平均值；Ei和Pi分別為食品的可食部分因子和食品加工因子，本文中不考慮區(qū)別，均設(shè)為1；ADI為每日允許攝入量，mg/kg bw；bw為體重，kg，我國人均體重一般按63 kg計。當RQ>1時，表示存在不可接受的風險，數(shù)值越大，風險越大；RQ

2結(jié)果與分析

2.1霜脲氰和喹啉銅在黃瓜中的殘留消解動態(tài)

2012～2013年在山東、河北、安徽進行了40%霜脲氰?喹啉銅懸浮劑在黃瓜中的殘留消解規(guī)律試驗研究，其消解規(guī)律均符合一級動力學方程式Ct=C0e-kt。式中：Ct為施藥后7 d的殘留農(nóng)藥濃度，C0為施藥后的原始沉積量，k為消解速率常數(shù)，t為施藥后的天數(shù)。從試驗結(jié)果看出（表1、表2），霜脲氰在黃瓜中的半衰期為1.8～2.5 d，藥后7 d殘留量未檢出（

2.2霜脲氰和喹啉銅在黃瓜中的最終殘留量

40%霜脲氰?喹啉銅懸浮劑360 g a.i./hm2 3次藥后1、2 d黃瓜中霜脲氰殘留量為0.0551～0.127 mg/kg，藥后3、5 d未檢出；4次藥后1、2 d殘留量為0.0682～0.167 mg/kg，藥后3、5 d未檢表1霜脲氰在黃瓜中

出。40%霜脲氰?喹啉銅懸浮劑540 g a.i./hm2 3次施用后1、2、3 d黃瓜中霜脲氰殘留量為0.0578～0.222 mg/kg，藥后5 d未檢出；4次藥后1、2、3 d殘留量為0.0761～0.256 mg/kg，藥后5 d未檢出。所有檢出樣品殘留量均低于最大殘留限量0.5 mg/kg。對照區(qū)樣品霜脲氰殘留量均未檢出（表3）。

由表4可以看出，40%霜脲氰?喹啉銅懸浮劑360 g a.i./hm2，3次藥后1、2、3、5 d黃瓜中喹啉銅殘留量為0.0539～0.316 mg/kg；4次藥后1、2、3、5 d殘留量為0.0604～0.437 mg/kg。40%霜脲氰?喹啉銅懸浮劑540 g a.i./hm2，3次藥后1、2、3、5 d黃瓜中喹啉銅殘留量為0.0598～0.528 mg/kg；4次藥后1、2、3、5 d殘留量為0.0969～0.563 mg/kg。所有檢出樣品殘留量均低于最大殘留限量2.0 mg/kg。對照區(qū)黃瓜樣品中均未檢出喹啉銅殘留（

根據(jù)我國國家相關(guān)標準的規(guī)定，霜脲氰和喹啉銅人體每千克體重每日允許攝入量（ADI）為0.013 mg和0.02 mg，根據(jù)《中國居民膳食指南》（2011年修訂），我國人均膳食結(jié)構(gòu)中黃瓜（深色蔬菜）每日攝入量一般為0.0915 kg。基于規(guī)范殘留試驗數(shù)據(jù)進行的國家估算每日攝入量（NEDI）評估結(jié)果見表5。由此計算得出，霜脲氰暴露攝入量不超過其ADI的0.62%，喹啉銅暴露攝入量不超過其ADI的0.40%，處于極低的水平，無明顯膳食風險。

3結(jié)論與討論

建立了同時測定霜脲氰和喹啉銅在黃瓜中殘留的分析方法。其前處理操作簡便、省時，便于掌握，進樣量在10-9～10-7 g之間有良好的線性關(guān)系，霜脲氰、喹啉銅的最低檢出量均為10-9 g。

本試驗結(jié)果表明，霜脲氰在黃瓜中的半衰期為1.8～2.5 d，藥后7 d殘留量未檢出；喹啉銅在黃瓜中的半衰期為2.6～4.1 d，藥后14 d消解90%以上或未檢出。霜脲氰、喹啉銅在黃瓜中的半衰期短，消解速度較快。根據(jù)殘留情況推薦40%霜脲氰?喹啉銅懸浮劑用于防治黃瓜霜霉病，最高用藥量360 g a.i./hm2，最多施藥3次，在黃瓜上的安全間隔期為1 d。

參考文獻：

[1]王運浩. 食品農(nóng)藥殘留與分析控制技術(shù)展望[J]. 現(xiàn)代科學儀器，2003（1）：8-12.

[2]亦 冰. 新穎殺菌劑霜脲氰/唑菌酮的開發(fā)及作用特性[J]. 世界農(nóng)藥，2001（5）：32-34.

[3]王維國，常華，張程，等. 氣相色譜法測定霜脲氰原藥含量[J]. 農(nóng)藥，1997，36（3）：19-20.

[4]李二虎，胡敏. 高效液相色譜法測定黃瓜中霜脲氰和吡蟲啉農(nóng)藥殘留[J]. 現(xiàn)代農(nóng)藥，2008（4）：42-44.

[5]吳世文，何明遠，朱春暉. 18%百菌清?霜脲氰懸浮劑防治黃瓜霜霉病田間藥效試驗[J]. 農(nóng)藥研究與應(yīng)用，2009，13（3）：35-36.

[6]陳廣艷. 40%喹啉銅?霜脲氰懸浮劑防治黃瓜霜霉病藥效試驗[J]. 吉林農(nóng)業(yè)科學，2011，36（3）：39-40.

[7]周夢春，周華倫，阿加爾古麗. 番茄中8- 羥基喹啉銅殘留量的液相色譜測定[J]. 干旱環(huán)境監(jiān)測，2010，24（4）：205-208.

[8]Grogan H M，Jukes A A. Persistence of the fungicides thiabendazole，carbendazim and Prochloraz-Mn in mushroom casing soil[J]. Pest Manag. Sci.，2003，59（11）：1225-1231.

[9]Chen J，Pawliszyn J B. Solid-phase microextraction coupled to high-performance liquid chromatography [J]. And chem.，1995，67（15）：2530-2533.

[10]Kobayashi H， Matano O， Goto S. Determination of oxine- copper in orange by gas chromatography [J]. Journal of Chromatography， 1989， 474（2）： 381- 387.

[11]郭利豐，肖鳴，黃雅俊. 33.5%喹啉銅懸浮劑的氣相色譜分析研究[J]. 現(xiàn)代農(nóng)藥，2011，10（5）：38-39.

[12]周夢春，王穎，蔡磊明，等. 反相高效液相色譜法測定黃瓜和土壤中的喹啉銅殘留量[J]. 新疆農(nóng)業(yè)大學學報，2008，31（4）：47-49.

[13]李國平，單煒力，王國聯(lián). 高效液相色譜法測定混劑中喹啉銅和噻菌靈[J]. 農(nóng)藥科學與管理，2005，26（9）：4-6.

[14]劉明洋，龔道新，任竟，等. 葡萄和土壤中霜脲氰的殘留分析方法[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學學報，2009，35（2）：195-199.

[15]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部. NY/T788-2004農(nóng)藥殘留試驗準則[S]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 2004.

[16]王運浩， 季穎， 龔勇， 等. 農(nóng)藥登記殘留田間試驗標準操作規(guī)程[M]. 北京：中國標準出版社， 2007.

[17]FAO.Submission and evaluation of pesticide residues data for the estimation of maximum residue levels in food and feed[M]. Rome： FAO， 2009： 123-133.

[18]錢傳范. 農(nóng)藥殘留分析原理與方法[M]. 北京：化學工業(yè)出版社，2011： 435-437.

[19]中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所. 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估： 原理、方法和應(yīng)用[M].北京：中國標準出版社，2007.

黃河的故事范文6

[關(guān)鍵詞] 骨髓間充質(zhì)干細胞 視網(wǎng)膜色素上皮細胞 全反視黃酸 共培養(yǎng) 誘導(dǎo)分化

BMSCs是來源于骨髓的非造血干細胞，具有多潛能分化特性。與存在倫理學爭議的胚胎干細胞及增殖能力有限的視網(wǎng)膜祖細胞相比，BMSCs以其具有自體同源性、易分離和操作簡單等顯著優(yōu)勢，成為視網(wǎng)膜細胞移植治療的理想供體。已有研究表明，視網(wǎng)膜細胞培養(yǎng)上清液能夠體外誘導(dǎo)胚胎干細胞向神經(jīng)細胞分化[1]。本研究旨在探討B(tài)MSCs誘導(dǎo)分化的條件培養(yǎng)基。

1 材料和方法

1.1 主要儀器

THERMO FORMA 3111 CO2培養(yǎng)箱（美國）；AIR-TECH BCM-1000A型生物潔凈工作臺（蘇州）；OLYMPUS 1×70熒光倒置式相差顯微鏡（日本）；OLYMPUS PMCB20攝影器材（日本）；OLYMPUS BH-2型光學顯微鏡（日本）。

1.2 試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25％胰蛋白酶（均為Gibco公司）、PBS粉（Sigma）、實驗用體重為80g清潔級sD大鼠。培養(yǎng)基（DMEM、DMEM／F12）、胎牛血清（FBS）購自Gibco公司；抗體為鼠抗人角蛋白-18單克隆抗體（北京中杉公司），小鼠抗大鼠神經(jīng)元特異性標志烯醇化酶（NSE），星形膠質(zhì)細胞特異性標志小鼠抗大鼠單克隆抗體神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(GFAP)，光感受器特異性標志小鼠抗大鼠單克隆抗體視紫質(zhì)(Rhodopsin)，(均為Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 hRPE細胞的取材、原代、傳代培養(yǎng)及鑒定

采用眼杯消化法[2]，沿角鞏緣后3.5mm環(huán)形剖開眼球，棄除眼前節(jié)、玻璃體及神經(jīng)視網(wǎng)膜獲得眼杯，用0.25%胰酶消化獲取HRPE細胞、15％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，細胞接近融合狀態(tài)時進行傳代培養(yǎng)。將第二代hRPE細胞置入六孔板中，孔板中放入18×18蓋玻片，利用免疫細胞化學EnVision法檢測角蛋白表達。

1.3.2 BMSCs的分離培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)及鑒定

清潔級SD大鼠，無菌條件下取出雙側(cè)股骨，從股骨干和脛骨干中間剪斷，用10mLDMEM/F12培養(yǎng)液+20%FBS+肝素反復(fù)沖洗骨髓腔，沖洗液經(jīng)200目不銹鋼標準篩過濾掉大的團塊后充分吹打混勻獲取細胞懸液，接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。3d后首次換液，換液時倒除舊的培養(yǎng)液，加入含0.04%EDTA的PBS 4mL，37℃孵育10min，倒除PBS，加入新的完全培養(yǎng)液。當?shù)?代MMSC細胞融合達80%~90%時，利用流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD34、CD44和CD90表達對細胞純度進行鑒定[3]。

1.4 實驗分組

1.4.1 hRPE培養(yǎng)上清液+BMSCs+RA組：取二代hRPE細胞懸浮液含2000個細胞接種在transwell六孔雙層培養(yǎng)板的上層，將BMSCs接種于下層培養(yǎng)板中，接種密度2.0×103個細胞/孔，在雙層六孔板的每孔中加入終濃度為1μmol/L的RA，同時在下層放入18mm×18mm蓋玻片進行細胞爬片，隔天換液。（還是每日半定量換液）倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.4.2 hRPE培養(yǎng)上清液+BMSCs組：取二代HRPE細胞懸浮液含2000個細胞接種在六孔transwell六孔雙層培養(yǎng)板的上層，將MSC接種于下層培養(yǎng)板中，接種密度2000個細胞/孔，同時在下層放入18 mm×18mm蓋玻片進行細胞爬片，隔天換液。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.4.3 單獨BMSc置于六孔板中爬片

2周后取出蓋玻片進行GFAP，NSE， Rhodopsin，細胞化學染色。

1.5 免疫細胞化學染色

將雙層六孔板中爬有HRPE和誘導(dǎo)前、后的BMSCs的玻片取出。

PBS潤洗3min×3次；

4％多聚甲醛室溫下固定20min，PBS沖洗3min ×3次；

0.1％TritonX.100室溫下處理l0min，PBS沖洗3min ×3次；

3%H2O2去離子水孵育10min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶PBS沖洗3min ×3次；

羊血清孵育20min，封閉非特異性結(jié)合，勿洗；

適當稀釋度的一抗（角蛋白 1:300），GFAP 1:100，NSE 1:10，Rhodopsin 1:25，4℃孵育過夜，PBS沖洗3min ×3次；陰性對照片為用PBS 代替一抗；

二抗（生物素標記的羊抗鼠IgG抗體）37℃ 濕盒孵育30min，PBS沖洗；

DAB顯色6min；

蘇木素復(fù)染；

中性樹膠封片。

1.6 統(tǒng)計學分析

將三種培養(yǎng)條件下所表達的陽性細胞進行定量分析。利用HPIAS-2000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)對GFAP、NSE、Rhodopsin表達進行定量分析，每個標本隨機選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），測定每個視野下陽性反應(yīng)的平均光密度，以每個5個視野的平均光密度的平均值作為該例的測量值；同時選取至少10個隨機視野，每個視野在200倍物鏡下統(tǒng)計陽性細胞數(shù)和整個視野細胞總數(shù)，計算陽性細胞率，測量值均以 表示，統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理。組間差異采用ANOVA分析。以P

2 結(jié)果

2.1 hRPE以及BMSCs的取材和原代、傳代培養(yǎng)參照文獻[2]、[3]報告的方法

2.2 誘導(dǎo)分化的細胞形態(tài)學觀察及鑒定

hRPE培養(yǎng)上清液+BMSCs+RA組共培養(yǎng)3d后原來梭行的BMSCs 胞體已發(fā)生收縮，呈錐形，細胞邊緣變得不規(guī)整，有零星的細的突起（圖1A）。在誘導(dǎo)后14d后，BMSCs 呈漸進性的向神經(jīng)元樣細胞轉(zhuǎn)化，有較多的長突起，有些長突起末端形成生長錐樣的膨大及絲性偽足呈典型的核周體形態(tài)，多極狀（圖1B）； 同時BMSC在誘導(dǎo)7D后，部分細胞發(fā)生遷移并相互之間建立突觸聯(lián)系(圖1C)。與hRPE培養(yǎng)上清液+BMSCs+RA組相比，不加RA則分化細胞明顯減少，也少有建立突觸聯(lián)系的細胞（圖1D）。

A：3d×400；B:14d×400；C:7d×400；單獨BMSCs:D:×400；

GFAP免疫細胞化學染色 E：×400; NSE免疫細胞化學染色F:×400；Rhodopsin免疫細胞化學染色G:×400；BMSCs+RA共培養(yǎng):H:7d×400。

圖1 RPE培養(yǎng)上清液+BMSCs+RA共培養(yǎng)

2.3 統(tǒng)計學結(jié)果分析

利用HPIAS-2000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)分別對兩種誘導(dǎo)條件下GFAP、NSE、Rhodopsin表達進行定量分析。

3 討論

BMSCs是目前備受關(guān)注的一群具有多向分化潛能的成體干細胞。具有高度可塑性，在一定誘導(dǎo)條件下具有向成骨細胞、成軟骨細胞、肌腱細胞、脂肪細胞以及基質(zhì)細胞等中胚層細胞分化的能力。近年來，BMSCs 向神經(jīng)細胞的分化研究受到了極大的關(guān)注。本試驗所用到的RA是一種維生素A的代謝產(chǎn)物，它可以影響脊椎動物的發(fā)育和許多類型細胞的分化。RA常被用來進行誘導(dǎo)多潛能干細胞向神經(jīng)細胞分化的研究，但機制尚不明確。RPE 細胞可分泌多種細胞因子這些細胞因子, 包括PEDF、FGF、 TGF2β、IL21 等。其中PEDF是一種多效的神經(jīng)營養(yǎng)因子。對中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)的許多部位的神經(jīng)元具有神經(jīng)營養(yǎng)、神經(jīng)保護和神經(jīng)分化作用；bFGF能誘導(dǎo)體內(nèi)視網(wǎng)膜的重建，刺激所有源自中胚層的細胞以及許多源自神經(jīng)外胚層和內(nèi)胚層細胞的增生；bFGF可介導(dǎo)神經(jīng)元的分化、對光感受器具有重要的保護作用；TGF2β可在正常RPE 細胞中表達。可調(diào)控細胞生長、分化、細胞外基質(zhì)合成。本試驗將三者共培養(yǎng)兩周，結(jié)果顯示：BMSCs可以高表達神經(jīng)膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元細胞特異性標志GFAP和NSE，同時我們還驚喜地發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)分化后的BMSCs表達光感受器細胞特異性標志Rhodopsin。這進一步證明了，BMSCs不僅可以向非間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，還可以跨胚層由起始的中胚層向外胚層發(fā)育，這為臨床上進一步治療視網(wǎng)膜和視神經(jīng)疾病奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1] Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, et al. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons[J]. Journal of Neuroscience Research, 2000, 61( 4 ): 364 370.