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摘要:依托教師科研項(xiàng)目，以典型環(huán)境內(nèi)分泌干擾物雙酚A(BisphenolA，BPA)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，基于高效液相色譜技術(shù)設(shè)計(jì)并開展創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)，引導(dǎo)學(xué)生自主思考及實(shí)驗(yàn)探索，從分散液液微萃取前處理及高效液相色譜儀器分析兩大方面，摸索并優(yōu)化各項(xiàng)參數(shù)條件，建立高效、便捷的檢測(cè)方法用于定量分析水樣中BPA。創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)合了新穎的科研內(nèi)容，激發(fā)學(xué)生主動(dòng)探索的興趣，不僅強(qiáng)化了學(xué)生的基本實(shí)驗(yàn)技能，而且培養(yǎng)和提升了學(xué)生的科研思維及綜合運(yùn)用知識(shí)的能力。

關(guān)鍵詞:創(chuàng)新實(shí)驗(yàn);實(shí)驗(yàn)教學(xué);高效液相色譜

2016年召開的全國(guó)科技創(chuàng)新大會(huì)提出，我國(guó)要在2030年進(jìn)入創(chuàng)新型國(guó)家前列，2050年成為創(chuàng)新強(qiáng)國(guó)。實(shí)驗(yàn)室是高等學(xué)校實(shí)施素質(zhì)教育，培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新精神與實(shí)踐能力的重要基地［1］，但常規(guī)的學(xué)生實(shí)驗(yàn)教學(xué)往往不能充分培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新能力。在當(dāng)前國(guó)家大力推進(jìn)大眾創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)的背景下，開設(shè)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目是高校培養(yǎng)學(xué)生協(xié)作能力、科研能力、創(chuàng)新能力以及綜合素質(zhì)的重要環(huán)節(jié)［2］。同時(shí)，教學(xué)和科研相輔相成，基于科研過(guò)程和科研成果的創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)教學(xué)更有助于激發(fā)學(xué)生對(duì)知識(shí)的探索欲，加深學(xué)生對(duì)專業(yè)學(xué)科領(lǐng)域的認(rèn)識(shí)，強(qiáng)化學(xué)生的創(chuàng)新意識(shí)，提升學(xué)生的創(chuàng)新思維［3］。促進(jìn)科研與教學(xué)互動(dòng)，把科研成果轉(zhuǎn)化為實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容，使實(shí)驗(yàn)教學(xué)從傳統(tǒng)的“知識(shí)傳授”轉(zhuǎn)變?yōu)?ldquo;知識(shí)、能力、思維、素質(zhì)”綜合素質(zhì)培養(yǎng)，對(duì)推動(dòng)大學(xué)生參與科學(xué)研究、營(yíng)造良好的學(xué)術(shù)氛圍、培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新精神具有深遠(yuǎn)意義，具有廣闊的發(fā)展空間。

1創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)背景及意義

合適的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目是創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)開展的重要基礎(chǔ)，創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)合新穎的科研內(nèi)容，教學(xué)內(nèi)容尚未涉及，具有一定的前瞻性，能引起學(xué)生主動(dòng)探索未知的興趣，并有利于培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新能力和綜合素質(zhì)，實(shí)現(xiàn)學(xué)生“高分高能”的培養(yǎng)目標(biāo)［4］。BPA在工業(yè)上常被用來(lái)合成環(huán)氧樹脂和聚碳酸醋等材料，從塑料袋、塑料飯盒、礦泉水瓶等日常用品，到醫(yī)療器械、食品包裝的內(nèi)襯等，生活中到處都有BPA的身影。BPA的大量生產(chǎn)和使用使它不斷轉(zhuǎn)移至環(huán)境，且大量研究已證明即便在極低劑量(ng/L)的存在下，BPA也能干擾人體及動(dòng)物正常的內(nèi)分泌系統(tǒng)，從而影響生殖功能，導(dǎo)致惡性腫瘤的產(chǎn)生等一系列嚴(yán)重?fù)p害，甚至具有遺傳效應(yīng)［5］。然而，在對(duì)環(huán)境樣品中痕量的BPA進(jìn)行分析的過(guò)程中，往往由于BPA的濃度較低甚至是微量、基質(zhì)組成復(fù)雜而被干擾，常規(guī)檢測(cè)方法達(dá)不到檢測(cè)要求。因此，高效、靈敏、便捷的檢測(cè)方法是開展BPA環(huán)境行為研究的基礎(chǔ)和保障，同時(shí)，環(huán)境樣品中BPA有效分離和富集的前處理至關(guān)重要。分散液液微萃取(Dispersiveliquid-liquidmicroextraction，DLLME)技術(shù)作為一種新型的樣品前處理手段，自Rezaee等人于2006年首次提出以來(lái)迅速成為研究熱點(diǎn)［6］。Leong等在此基礎(chǔ)上建立了上浮溶劑固化分散液液微萃取技術(shù)(DLLME-SFO)，采取低密度有機(jī)萃取劑，并在萃取離心后結(jié)合冷凍固化使萃取相凝固以方便移取。DLLME-SFO進(jìn)一步簡(jiǎn)化了操作，具有樣品需求量小、有機(jī)溶劑用量少、操作簡(jiǎn)便、萃取時(shí)間短、環(huán)境友好等突出［7］。本創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)結(jié)合分散液液微萃取上浮溶劑固化(DLLME-SFO)的樣品前處理方法和高效液相色譜法(HPLC)定量分析技術(shù)的聯(lián)用，指導(dǎo)學(xué)生全程參與實(shí)驗(yàn)的各個(gè)環(huán)節(jié)，設(shè)計(jì)并優(yōu)化樣品前處理及HPLC儀器分析的各項(xiàng)參數(shù)，建立快捷高效的水樣BPA檢測(cè)方法。教師全程指導(dǎo)，學(xué)生全程參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及開展，全方位培養(yǎng)學(xué)生的“知識(shí)、能力、思維、素質(zhì)”。同時(shí)，注重培養(yǎng)學(xué)生掌握文獻(xiàn)查閱和Word、Excel等文本編輯方法，以及SPSS、ORIGIN等數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件的使用，學(xué)習(xí)科研論文的基本組成和撰寫。

2實(shí)驗(yàn)原理及核心內(nèi)容

本創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)的核心內(nèi)容是從兩個(gè)方面進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化確定:其一是BPA定量分析的HPLC儀器檢測(cè)條件;另一方面是樣品的DLLME-SFO前處理?xiàng)l件。基于環(huán)境介質(zhì)的復(fù)雜性以及環(huán)境樣品中BPA濃度通常較低的特點(diǎn)，通過(guò)樣品前處理需要達(dá)到分離和富集的目的，將BPA從樣品中分離出來(lái)并去除基體干擾，同時(shí)還要達(dá)到一定程度的富集效果以滿足后續(xù)定量檢測(cè)方法的檢出濃度。在進(jìn)行樣品中BPA檢測(cè)的DLLME-SFO前處理?xiàng)l件優(yōu)化時(shí)，主要通過(guò)富集倍數(shù)(ExtractionFactor，EF)和萃取回收率(ExtractionRecovery，ER)兩項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行萃取效果的考察和比較［8］，進(jìn)而確定優(yōu)化的萃取條件。EF為上浮萃取相中BPA的濃度與水樣中BPA濃度的比值，Cfloated為萃取所得上浮相中BPA的濃度，C0為水樣中BPA的濃度。萃取回收率ER(%)為萃取相中BPA的量占水樣中BPA量的百分比例，Mfloated為上浮萃取相中BPA的質(zhì)量，M0為水樣中BPA的質(zhì)量。Vfloated和V0分別為萃取相的體積和水樣體積。樣品經(jīng)過(guò)DLLME-SFO前處理，其中的BPA分離富集至萃取相，并經(jīng)由離心冷凍后取出，所得到的萃取相融化后即可進(jìn)一步結(jié)合檢測(cè)儀器進(jìn)行定量分析。與氣相色譜(GC)和氣相色譜/質(zhì)譜(GC/MS)等相比，高效液相色譜(HPLC)具有操作方便、測(cè)定時(shí)間短等優(yōu)勢(shì)。在確定BPA檢測(cè)的HPLC色譜條件時(shí)，需重點(diǎn)考察并確定流動(dòng)相的種類及流量、檢測(cè)波長(zhǎng)、柱溫、進(jìn)樣量等參數(shù);并建立優(yōu)化條件下BPA測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于BPA的定量分析。最后，還需對(duì)實(shí)驗(yàn)所建立的DLLME-SFO-HPLC檢測(cè)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。采用逐步稀釋法結(jié)合高效液相色譜工作站，確定方法的檢出限和定量限。結(jié)合加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，分析加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。從方法的線性范圍、檢出限、實(shí)際樣品加標(biāo)回收率等方面進(jìn)行所建檢測(cè)方法的綜合評(píng)價(jià)。

3創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)的整體設(shè)計(jì)

在教師的引導(dǎo)下，學(xué)生需全程參與文獻(xiàn)查閱、實(shí)驗(yàn)詳細(xì)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)開展及實(shí)驗(yàn)總結(jié)匯報(bào)的各個(gè)環(huán)節(jié)，整體設(shè)計(jì)見下圖，將復(fù)雜的綜合性實(shí)驗(yàn)分解為幾個(gè)步驟逐步開展。教師主要指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的整體思路及技術(shù)要點(diǎn)，并及時(shí)解答學(xué)生的疑問(wèn)，詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案及操作由學(xué)生具體開展。創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)框架圖首先查閱相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)BPA、DLLME-SFO、HPLC等背景信息進(jìn)行梳理。進(jìn)一步細(xì)化實(shí)驗(yàn)方案，對(duì)BPA的HPLC檢測(cè)條件進(jìn)行確定，從流動(dòng)相、檢測(cè)波長(zhǎng)、柱溫、進(jìn)樣量等因素進(jìn)行條件優(yōu)化，并基于優(yōu)化的儀器條件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。在HPLC檢測(cè)條件確定的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開展DLLME-SFO樣品前處理方法的條件優(yōu)化。結(jié)合實(shí)驗(yàn)，對(duì)萃取劑和分散劑的類型及萃取時(shí)間進(jìn)行初步篩選，利用全因子實(shí)驗(yàn)以萃取回收率和富集倍數(shù)為指標(biāo)對(duì)DLLME-SFO過(guò)程的萃取劑用量和分散劑用量進(jìn)一步確定，再結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)考察pH值、鹽離子強(qiáng)度、超聲輔助條件的優(yōu)化確定。采取上一步實(shí)驗(yàn)所確定的HPLC條件，定量檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)所得萃取相中的BPA，并結(jié)合萃取回收率ER和富集倍數(shù)EF進(jìn)行萃取效果的評(píng)價(jià)和優(yōu)化萃取條件確定。最后根據(jù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程及實(shí)驗(yàn)記錄，形成實(shí)驗(yàn)報(bào)告，并針對(duì)其中的要點(diǎn)和亮點(diǎn)以PPT形式進(jìn)行匯報(bào)及交流。

4創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)的開展

本創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目采取學(xué)生組建團(tuán)隊(duì)的模式申請(qǐng)參加，按“項(xiàng)目背景調(diào)研—問(wèn)題分析—文獻(xiàn)查閱—實(shí)驗(yàn)方案細(xì)化—實(shí)驗(yàn)開展—數(shù)據(jù)分析—匯報(bào)總結(jié)”的順序開展，并以科研論文的規(guī)范要求提交實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

4．1實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

教師下達(dá)“實(shí)驗(yàn)任務(wù)書”，簡(jiǎn)要介紹本創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)的研究背景，實(shí)驗(yàn)的整體思路，實(shí)驗(yàn)過(guò)程需重點(diǎn)關(guān)注的因素。要求學(xué)生充分開展資料查閱和交流討論，了解BPA及其研究現(xiàn)狀，理解DLLME-SFO前處理的基本原理，掌握高效液相色譜法的基本原理和HPLC儀器的基本操作。在此基礎(chǔ)上，由學(xué)生自行擬訂詳細(xì)實(shí)驗(yàn)方案，內(nèi)容包括方法綜述、理論依據(jù)、研究?jī)?nèi)容、實(shí)驗(yàn)步驟、操作方案、可行性分析、注意事項(xiàng)及參考文獻(xiàn)等，并經(jīng)教師審閱。

4．2實(shí)驗(yàn)過(guò)程

采用“引導(dǎo)—設(shè)計(jì)—探索—交流—引導(dǎo)”的模式，指導(dǎo)學(xué)生逐步細(xì)化實(shí)驗(yàn)方案并分步推進(jìn)。先后依次開展BPA的HPLC檢測(cè)條件確定及標(biāo)準(zhǔn)曲線建立，DLLME萃取劑、分散劑的選用及用量確定，萃取條件的參數(shù)優(yōu)化確定，所建立DLLME-HPLC方法的評(píng)價(jià)及水樣中BPA的測(cè)定。每部分實(shí)驗(yàn)分別由小組的一名同學(xué)主要負(fù)責(zé)，并做到全員參與。實(shí)驗(yàn)過(guò)程充分調(diào)動(dòng)學(xué)生的主動(dòng)性，充分發(fā)揮學(xué)生的自主思考能力，盡量按照自己的思路開展實(shí)驗(yàn)。教師僅提供技術(shù)指導(dǎo)和整體進(jìn)度把控，且指導(dǎo)方式多樣化。比如，本實(shí)驗(yàn)的開展過(guò)程需大量使用高效液相色譜儀，教師制作了“HPLC的操作及應(yīng)用”等教學(xué)微視頻，輔助指導(dǎo)學(xué)生進(jìn)行儀器操作，取得了較好的效果。又如，在HPLC流動(dòng)相的選擇和確定方面，由學(xué)生自行查閱資料提出幾種備選方案，與教師討論交流后，篩選出幾種最可行的方案，再由學(xué)生展開實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化確定。同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中特別強(qiáng)調(diào)認(rèn)真進(jìn)行實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)的記錄，以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)問(wèn)題解決問(wèn)題，并及時(shí)與指導(dǎo)教師匯報(bào)交流。

4．3實(shí)驗(yàn)總結(jié)

學(xué)生在實(shí)驗(yàn)后進(jìn)一步梳理實(shí)驗(yàn)過(guò)程與結(jié)果，對(duì)異常現(xiàn)象進(jìn)行討論或提出創(chuàng)造性建議，將實(shí)驗(yàn)過(guò)程中遇到的問(wèn)題及實(shí)驗(yàn)結(jié)論的得出過(guò)程進(jìn)行詳細(xì)分析。在此基礎(chǔ)上，以論文的形式對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果歸納、總結(jié)與討論，最后以PPT形式匯報(bào)交流。

5結(jié)語(yǔ)

創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)相較常規(guī)實(shí)驗(yàn)教學(xué)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，但參與該實(shí)驗(yàn)的學(xué)生由被動(dòng)參與者轉(zhuǎn)變?yōu)閷?shí)驗(yàn)路線的設(shè)計(jì)者和實(shí)驗(yàn)方案的制訂者，學(xué)生積極思考、主動(dòng)參與、相互探討。實(shí)驗(yàn)過(guò)程有效激發(fā)學(xué)生的研究興趣，充分發(fā)揮了學(xué)生的主動(dòng)性和創(chuàng)造性。創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)的開展，使學(xué)生對(duì)相關(guān)專業(yè)知識(shí)有了更深刻的理解，操作技能及合作精神得以強(qiáng)化，信息獲得及利用的能力有所提高，創(chuàng)新思維及表達(dá)能力得到鍛煉，視野進(jìn)一步開闊，學(xué)習(xí)動(dòng)力及學(xué)習(xí)方向更加明晰，為后續(xù)的學(xué)習(xí)及工作奠定了較好的基礎(chǔ)。

作者：胡鶯 孫姣霞 劉雪蓮 潘瑾 單位：重慶交通大學(xué)河海學(xué)院環(huán)境科學(xué)與工程系