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基因重組范文1
1.實(shí)例
鐮刀型細(xì)胞貧血癥：正常人的紅細(xì)胞是圓餅狀，而鐮刀型細(xì)胞貧血癥患者的紅細(xì)胞卻是彎曲的鐮刀狀。這樣的紅細(xì)胞易破裂，使人患溶血性貧血癥，嚴(yán)重時(shí)還可能危及生命。鐮刀型細(xì)胞貧血癥是一種由于正常基因發(fā)生突變后形成致病基因而導(dǎo)致的遺傳病。正常人的血紅蛋白是由四條多肽鏈共574個(gè)氨基酸構(gòu)成的，檢查鐮刀型細(xì)胞貧血癥患者血紅蛋白的氨基酸組成發(fā)現(xiàn)，有一條多肽鏈上的某一位置應(yīng)是谷氨酸（正常人），而被纈氨酸代替了，這種改變最終導(dǎo)致了鐮刀型細(xì)胞貧血癥的發(fā)生。
2.概念
DNA分子中發(fā)生堿基對(duì)的替換、增添和缺失，而引起的基因結(jié)構(gòu)的改變，叫做基因突變（gene mutation）。基因突變的類型有四種：（1）堿基置換突變：即一對(duì)堿基置換造成的，如鐮刀型細(xì)胞貧血癥；（2）移碼突變：即某位點(diǎn)增添或缺失1—2對(duì)堿基造成的；（3）缺失突變：即基因內(nèi)部缺失某個(gè)DNA小片段造成的；（4）插入突變：即基因內(nèi)部增添了1—n個(gè)脫氧核苷酸對(duì)導(dǎo)致的。例如：在肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，無莢膜菌活化插入一小段有莢膜菌的DNA，突變形成了有莢膜菌。
例1 若生物體的DNA分子增加或減少一個(gè)堿基，這種變化是（ ）。
A.細(xì)菌轉(zhuǎn)化 B.基因的自由組合
C.基因突變 D.等位基因分離
解析
基因突變的方式至少有兩大類，一類是堿基的替換，一類是堿基對(duì)數(shù)目的改變。
答案 C
二、基因突變的結(jié)果與特點(diǎn)
1.突變結(jié)果
基因突變是染色體的某一個(gè)位點(diǎn)上基因的改變。基因突變使一個(gè)基因變成它的等位基因，由Aa，叫隱性突變，由aA，叫顯性突變，通常會(huì)引起性狀的改變。
2.基因突變的特點(diǎn)
（1）普遍存在，無論是低等生物還是高等生物都可能發(fā)生。
（2）隨機(jī)發(fā)生，它可以發(fā)生在生物個(gè)體發(fā)育的任何時(shí)期和生物體的任何細(xì)胞。
（3）突變頻率低。
（4）大多數(shù)基因突變對(duì)生物體是有害的。
（5）基因突變是不定向的，一個(gè)基因可以向多個(gè)方向發(fā)生突變，形成一個(gè)以上等位基因。
3.基因突變的意義
對(duì)生物來說，基因突變可能破壞生物體與現(xiàn)有環(huán)境的協(xié)調(diào)關(guān)系，而對(duì)生物有害，但有些基因突變，也可能使生物產(chǎn)生新的性狀，適應(yīng)改變的環(huán)境，獲得新的生存空間。還有些基因突變既無害也無益。基因突變盡管是隨機(jī)的、不定向的，在自然狀態(tài)下突變頻率很低，但卻是普遍存在的。基因突變是新基因產(chǎn)生的途徑，是生物變異的根本來源，是生物進(jìn)化的原始材料。
例2 某二倍體植物的抗逆特性由4個(gè)基因A、a1、a2、a3控制，且它們的抗逆作用A>a1>a2>a3，請(qǐng)據(jù)所學(xué)遺傳學(xué)知識(shí)回答下列問題：
（1）基因A、a1、a2、a3的根本來源是___，該現(xiàn)象說明變異具有___的特點(diǎn)。遺傳時(shí)A與a1、a2、a3之間遵循___定律。
（2）為探究基因之間的顯、隱性關(guān)系，某實(shí)驗(yàn)小組將兩純合子a1a1、a2a2雜交，子二代共有__種基因型。若表現(xiàn)型有__種，則表明這兩個(gè)基因之間有明顯的顯隱性關(guān)系；若表現(xiàn)型有__種，則表明這兩個(gè)基因之間無明顯的顯隱性關(guān)系。
（3）經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，A有顯性作用，a1、a2、a3之間沒有明顯的顯隱性關(guān)系，且基因的作用有累加效應(yīng)（如個(gè)體a1a2的抗逆性由兩個(gè)基因作用的累加共同決定），則該植物共有__種抗逆類型。
（4）研究得知該植物的抗逆性和細(xì)胞內(nèi)的水楊酸、多胺、脫落酸等物質(zhì)有關(guān)，請(qǐng)據(jù)所學(xué)知識(shí)推測(cè)基因控制該植物抗逆性的機(jī)理：_____。
解析 本題綜合考查遺傳知識(shí)和邏輯分析能力。等位基因的來源是基因突變，等位基因的多樣性體現(xiàn)了基因突變的不定向性（多方向性）。等位基因的遺傳遵循基因的分離定律。a1a1、a2a2雜交，子二代共有a1a1、ala2、a2a2i種基因型，若a1a2單獨(dú)表現(xiàn)一種性狀，說明兩基因之間沒有顯隱性關(guān)系，若a1a2表現(xiàn)型和a1a1或a2a2中的一種相同，則說明兩種基因之間有明顯的顯隱性關(guān)系；若a1、a2、a3之間沒有明顯的顯隱性關(guān)系，則該植物的抗逆類型有AA、Aax、a1a1、a2a2、a3a3、a1a2、ata3、a2a3；水楊酸、多胺和脫落酸都不是蛋白質(zhì)，不會(huì)由基因直接決定形成，根據(jù)基因?qū)π誀羁刂频膬煞N方式，可以推測(cè)基因通過控制酶的合成，間接控制這些物質(zhì)的生成，進(jìn)而控制抗逆性狀。
答案（1）基因突變 不定向性 分離 （2）3 2 3 （3）8 （4）基因通過控制有關(guān)酶的合成，間接控制這些物質(zhì)的產(chǎn)生，從而控制抗逆性狀。
三、基因重組的概念及意義
1.概念
基因重組是指生物體在進(jìn)行有性生殖的過程中，控制不同性狀的基因的重新組合。無性生殖不能產(chǎn)生基因重組。基因重組只是后代中生物個(gè)休的基因型改變，生物個(gè)體的基岡本身的結(jié)構(gòu)并沒有改變。基因的自由組合定律告訴我們，在生物體通過減數(shù)分裂形成配子時(shí)，隨著非同源染色體的自由組合，非等化基因也自由組合。這樣，由雌雄配子結(jié)合形成的受精卵，就可能具有與親代不同的基因型，從而使子代性狀發(fā)生改變。另一種類型的基因重組發(fā)生在減數(shù)分裂形成四分體時(shí)期，位于同源染色體上的等位基因有時(shí)會(huì)隨著非姐妹染色單體的交換而發(fā)生交換，導(dǎo)致染色單體上的基因重組。舉例來說，人的同卵雙胞胎，由于基因組成的相同，性狀十分相像。除此之外，沒有兩個(gè)同胞兄弟或同胞姐妹在遺傳上完全相同。
2.意義
通常的解釋是，有性生殖的基因重組有助于物種在一個(gè)無法預(yù)測(cè)將會(huì)發(fā)生什么變化的環(huán)境中生存。這是因?yàn)椋蛑亟M能夠產(chǎn)生多樣化的基因組合的子代，其中可能有一些子代會(huì)含有適應(yīng)某種變化的、生存所必需的基因組合。所以說，基因重組也是生物變異的來源之一，對(duì)生物的進(jìn)化也具有重要的意義。
四、基因突變和基因重組比較
兩個(gè)值得注意的問題：
（1）基因重組與基因突變的區(qū)別
基因重組是指在生物體進(jìn)行有性生殖過程中，控制不同性狀的基因的重新組合。它包括兩種類型：一是由基因的自由組合產(chǎn)生的基因重組，二是由基因的互換產(chǎn)生的基因重組。它們的共同特點(diǎn)是只能產(chǎn)生新的基因型，不能產(chǎn)生新的基因。而基因突變產(chǎn)生的是新基因。基因突變導(dǎo)致原來的基因變?yōu)樗牡任换颉；蛲蛔內(nèi)绻l(fā)生在生殖細(xì)胞，突變基因有可能通過受精作用而傳給下一代，如果發(fā)生在體細(xì)胞，則只影響當(dāng)代，不向下一代傳遞。
（2）基岡突變是生物變異的根本來源和生物進(jìn)化的重要因素
基因突變雖然是多數(shù)有害，少數(shù)有利，但由于它能產(chǎn)生新基因，從而產(chǎn)生了前所未有的新性狀，為自然選擇提供了大量的變異材料。它與基岡重組的不同之處在于，基因重組僅僅是基因型的改變，而基因突變是基因發(fā)生了改變，一個(gè)基因變成了新的等位基因，所以基因突變是生物變異的根本來源和進(jìn)化的重要因素。
例3 下列有關(guān)基因重組的敘述中。正確的是（ ）。
A.基因型為Aa的個(gè)體自交，因基因重組而導(dǎo)致子代性狀不同
B.基因A因替換、增添或缺失部分堿基而形成它的等位基因a屬于基因重組
C.同源染色體上非姐妹染色單體問的互換可能導(dǎo)致基因重組
D.造成同卵雙生姐妹間性狀上差異的主要原因是基因重組
解析Aa個(gè)體自交，后代的性狀分離是由于等位基因的分離和配子間自由組合而形成的；基因A因替換、增添或缺失部分堿基屬于基因突變；同卵雙生是由一個(gè)受精卵發(fā)育而來的，細(xì)胞核內(nèi)的遺傳物質(zhì)是一樣的，性狀差異主要是外界環(huán)境引起的。
答案 C
例4 下列不屬于人工誘變的實(shí)例的是（ ）。
A.一定劑量的γ射線引起變異得到新品種
B.用一定劑量X射線處理青霉素菌株獲得高產(chǎn)菌株
C.玉米單株自交后代中出現(xiàn)一定比例的白化苗
D.激光照射植物或動(dòng)物引起突變得到新品種
解析
本題主要考查對(duì)人工誘發(fā)基因突變的理解。人工誘變是指利用物理的或化學(xué)的因素來處理生物，使它發(fā)生基因突變的方法，而供選答案中的γ射線、X射線、激光都是人工誘變使用的手段之一，所以，A、B、D三項(xiàng)都是人工誘變的實(shí)例，只有C項(xiàng)屬于自然突變。
答案 C
練習(xí)
1.用紫外線照射紅色細(xì)菌的培養(yǎng)液，幾天后出現(xiàn)了一個(gè)白色菌落，把這個(gè)白色菌落轉(zhuǎn)移培養(yǎng)，長(zhǎng)出的菌落全部是白色的，這種性狀的改變屬于（ ）。
A.染色體變異 B.基因重組 C.自然突變 D.人工誘變
解析 細(xì)菌進(jìn)行無性生殖，在生殖過程不進(jìn)行減數(shù)分裂。因而細(xì)菌的變異不可能是由于基因重組而引起。染色體引起的生物變異，它可以改變生物個(gè)體的基岡含量、基因的相互關(guān)系，但不會(huì)產(chǎn)生新的基因，進(jìn)而不表現(xiàn)出全新的性狀，而且細(xì)菌是原核生物，無染色體。在紫外線的作用下，基因內(nèi)部的堿基種類、數(shù)量和排列次序發(fā)生改變，產(chǎn)生新的基因，控制合成新的蛋白質(zhì)，表現(xiàn)出新的性狀。
答案 D
2.在北京培育出的優(yōu)質(zhì)甘藍(lán)品種，葉球最大的只有3.5 kg，當(dāng)引種到拉薩后，由于晝夜溫差大，日照時(shí)間長(zhǎng)，葉球可重達(dá)7 kg左右，但再引種回北京后，葉球又只有3.5 kg，從甘藍(lán)引種過程可以看出（ ）。
A.甘藍(lán)具有遺傳性，而不具有變異性
B.僅由環(huán)境條件引起的變異不能遺傳
C.環(huán)境的改變可引起生物產(chǎn)生可遺傳的變異
D.甘藍(lán)在生殖過程中無基因重組發(fā)生
解析 由遺傳物質(zhì)變化引起的變異能夠遺傳，僅僅由環(huán)境的變化引起，沒有涉及遺傳物質(zhì)的變異不能遺傳。同一品種的甘藍(lán)含有相同的遺傳物質(zhì)，若在相同的環(huán)境條件下，其表現(xiàn)出來的性狀是一樣的。同一品種的甘藍(lán)在北京和拉薩兩地的低產(chǎn)和高產(chǎn)，是兩地環(huán)境因素不同造成的，而非遺傳物質(zhì)改變引起。而任何生物只要有遺傳性，它一定具有變異性，變異可發(fā)生在個(gè)體發(fā)育過程中，也可發(fā)生在有性生殖中。
答案 B
3.蕃茄中紅果（H）對(duì)黃果（h）顯性，將紅果蕃茄的花粉授到黃果蕃茄的雌蕊柱頭上，結(jié)了一個(gè)半邊紅色半邊黃色的果實(shí)。產(chǎn)生這一果實(shí)最可能的原因是（ ）。
A.最終發(fā)育成該果實(shí)的那個(gè)花芽中某些細(xì)胞發(fā)生基因突變
B.提供花粉的花藥組織中某個(gè)花粉母細(xì)胞發(fā)生基因突變
C.提供花粉的紅果蕃茄是雜合子（Hh）
D.接受花粉的黃果蕃茄是雜合子（Hh）
解析 本題考查的是基因突變的特點(diǎn)。根據(jù)題意可知該果實(shí)出現(xiàn)半邊紅色半邊黃色的現(xiàn)象，最可能的原因就是發(fā)生了基因突變。而發(fā)生基因突變的如果是黃果番茄的整個(gè)雌蕊或提供花粉的紅果番茄的花藥組織中某個(gè)花粉母細(xì)胞，那么就應(yīng)該是全部紅色或全部黃色。所以最可能是最終發(fā)育成果實(shí)的那個(gè)花芽中某些細(xì)胞發(fā)生基因突變。
答案 A
4.一株世代都是開紅花的植物，在一次突然性冰凍后，有一個(gè)枝條上出現(xiàn)了一朵白花，白花授粉后所結(jié)的種子種下去長(zhǎng)成的植株都開白花。試分析該白花是來自于___，其原因是____，使發(fā)育成該花芽的細(xì)胞在_____發(fā)生差錯(cuò)，從而使__的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。
基因重組范文2
這一重大發(fā)現(xiàn)被美國(guó)《科學(xué)》雜志列入2007年度十大科技突破之中，同時(shí)，英國(guó)《自然》雜志將其評(píng)為年度十大科技新聞之首。
這項(xiàng)研究對(duì)人類有何意義？為何科學(xué)界對(duì)“胚胎干細(xì)胞”不息溢美之辭？記者專訪了中科院上海生命科學(xué)院、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院健康科學(xué)研究所金穎研究員。
另辟蹊徑―――
誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞由來
人的胚胎干細(xì)胞素有“萬能細(xì)胞”的美譽(yù)，但胚胎干細(xì)胞研究面臨巨大的倫理壓力，導(dǎo)致研究之路困難重重。然而，科學(xué)界從2006年便開始另辟途徑，試圖尋找一種方法，將人體正常的體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化為具有胚胎干細(xì)胞功能的細(xì)胞，從而避開倫理之爭(zhēng)。
早在2006年8月，日本京都大學(xué)山中教授研究小組發(fā)現(xiàn)，只要用4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子過量表達(dá)就可以把老鼠成纖維細(xì)胞逆轉(zhuǎn)到細(xì)胞分化前的狀態(tài)，獲得功能與胚胎干細(xì)胞類似的準(zhǔn)“誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPS)”，從那時(shí)起，全球胚胎干細(xì)胞研究界就立刻跟進(jìn)。
人們通俗地用“皮膚干細(xì)胞”來稱呼“誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞”。這項(xiàng)研究簡(jiǎn)單說來，就是把原本不是多能的細(xì)胞(已經(jīng)分化的細(xì)胞)，通過誘導(dǎo)，使之成為多能的細(xì)胞(未分化的細(xì)胞)。所謂多能的細(xì)胞，就是具有變成多種細(xì)胞能力的細(xì)胞。
里程碑式的突破
2007年11月20日，日美科學(xué)家同天宣布利用基因重組技術(shù)，向皮膚細(xì)胞中植入4個(gè)基因，將人體皮膚細(xì)胞改造成幾乎可與胚胎干細(xì)胞相媲美的干細(xì)胞。從理論上看，這項(xiàng)研究首次證實(shí)了人類已分化的體細(xì)胞同樣可以被“重新編程”轉(zhuǎn)化為類胚胎干細(xì)胞，從而成功避開長(zhǎng)期以來爭(zhēng)論不休的倫理問題，有望大大推動(dòng)與干細(xì)胞有關(guān)的疾病療法研究。
科學(xué)界立即對(duì)這個(gè)結(jié)果給予高度評(píng)價(jià)，致力于人體胚胎克隆技術(shù)研究的美國(guó)細(xì)胞高級(jí)技術(shù)研究所首席科學(xué)家羅伯特?蘭扎甚至將這項(xiàng)研究稱為“了不起的科學(xué)里程碑。從生物學(xué)意義上講，相當(dāng)于萊特兄弟制造的第一架飛機(jī)”。
但是，日本和美國(guó)的發(fā)現(xiàn)都有局限。日本研究小組向皮膚細(xì)胞中植入的4個(gè)基因中，有一個(gè)是與癌癥相關(guān)的基因。美國(guó)研究小組雖然沒有使用這個(gè)基因，但是其研究中用于搬運(yùn)基因的“慢病毒”也會(huì)改寫染色體的遺傳信息。這些風(fēng)險(xiǎn)，使得兩個(gè)研究小組的成果離臨床應(yīng)用還有一段距離。
迅速發(fā)展―――
小步前進(jìn)，成果不斷
2007年12月6日，日本京都大學(xué)的研究小組改進(jìn)了研究方法，他們通過改變培養(yǎng)環(huán)境而摒棄了那個(gè)與癌癥有關(guān)的基因，提高了這種干細(xì)胞技術(shù)在臨床應(yīng)用中的安全性。
12月7日，美國(guó)懷特黑德生物醫(yī)學(xué)研究所的科學(xué)家在美國(guó)《科學(xué)》雜志上說，他們利用皮膚細(xì)胞改造而來的干細(xì)胞在治療老鼠的鐮刀狀細(xì)胞血癥獲得進(jìn)展。這是科學(xué)界利用誘導(dǎo)性多能細(xì)胞進(jìn)行醫(yī)療研究的首次嘗試。12月23日，哈佛大學(xué)研究小組在英國(guó)《自然》雜志上說，他們直接從志愿者身上提取皮膚細(xì)胞，并成功地改造成誘導(dǎo)性多能細(xì)胞。而11月20日發(fā)表的研究成果是利用實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)過的專用人體皮膚細(xì)胞進(jìn)行的。這個(gè)微小的差別，表明了從任何人身上提取皮膚細(xì)胞進(jìn)行該項(xiàng)研究都是可行的。
這些研究雖然都是“皮膚干細(xì)胞”研究的小步成果，但卻鼓舞人心。
重大意義―――
解決免疫排除反應(yīng)問題
誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，除了避開干細(xì)胞研究的倫理之爭(zhēng)外，將大大促進(jìn)干細(xì)胞在疾病治療方面的應(yīng)用。
首先，它解決了干細(xì)胞治療中的排斥問題。金穎研究員介紹說，人胚胎干細(xì)胞來源于人類早期胚胎，其分化的細(xì)胞應(yīng)用于病人時(shí)，由于是同種異體移植，植入的細(xì)胞會(huì)受到病人免疫系統(tǒng)細(xì)胞的排斥。為此，建立沒有免疫排斥的人胚胎干細(xì)胞系移植是干細(xì)胞研究人員的努力方向。體細(xì)胞核移植，也就是人們常說的治療性克隆，可以產(chǎn)生與病人基因型基本一致的胚胎干細(xì)胞。
事實(shí)上，核移植的低效率和人未受精卵母細(xì)胞來源的限制，人類在建立體細(xì)胞核移植來源的胚胎干細(xì)胞系方面尚無成功報(bào)道。即使成功，用于臨床疾病的治療也不現(xiàn)實(shí)。雖然科學(xué)家還在努力進(jìn)行著其他嘗試，但是尚無令人滿意的途徑。而“誘導(dǎo)性多能細(xì)胞”可以來源于任何人的體細(xì)胞，經(jīng)過體外的培養(yǎng)和誘導(dǎo)使這些體細(xì)胞成為具有多種分化潛能和大量擴(kuò)增能力的細(xì)胞。當(dāng)把此種細(xì)胞分化為病人所需要的細(xì)胞(如神經(jīng)細(xì)胞)再植入病人時(shí)，病人的免疫系統(tǒng)細(xì)胞不會(huì)對(duì)它們實(shí)行免疫排斥，從而解決了干細(xì)胞治療中的排斥問題。
用于人體尚需時(shí)日
雖然目前已成功建立了誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，但并不意味這些細(xì)胞可以立即應(yīng)用于臨床。“它的意義更多在于證明了一個(gè)原則，即已經(jīng)分化的細(xì)胞在幾種因子的誘導(dǎo)下，可以去分化成為多能的細(xì)胞。這是人們過去一直夢(mèng)想?yún)s未能實(shí)現(xiàn)的事情。但是，在應(yīng)用于臨床之前，還有許多問題需要解決。找到新的方法將新的基因?qū)敕只募?xì)胞，而不是用病毒載體，這本身就是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。”金穎說。
專家連線―――
記者：干細(xì)胞研究的重要性是不是還在于，它可以用于人類疾病的治療和新藥的研究？
金穎（中科院上海生命科學(xué)院、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院健康科學(xué)研究所研究員）:細(xì)胞移植是很多疾病的重要治療手段，如糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。但是，供體細(xì)胞的不足嚴(yán)重限制了細(xì)胞替代治療的進(jìn)行。干細(xì)胞能在體外大量擴(kuò)增，同時(shí)又具有分化為多種細(xì)胞的能力，可以為細(xì)胞移植提供來源。由于藥物篩選和安全性檢驗(yàn)不可以直接在人體進(jìn)行，但是可以利用體外培養(yǎng)的人的干細(xì)胞。所以，人的干細(xì)胞也成為大規(guī)模的新藥篩選和藥物研究的理想模型。
記者：能把皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)化為干細(xì)胞，是不是就可以對(duì)胚胎干細(xì)胞的研究不重視了呢？
金穎：應(yīng)該更加重視胚胎干細(xì)胞的研究。這4個(gè)基因的發(fā)現(xiàn)是源于科學(xué)家們20多年來對(duì)胚胎干細(xì)胞的研究。毫無疑問，沒有胚胎干細(xì)胞的研究就不會(huì)有誘導(dǎo)性多功能細(xì)胞的建立。科學(xué)家們長(zhǎng)期對(duì)胚胎干細(xì)胞增殖、分化、移植等的研究都是當(dāng)前和今后誘導(dǎo)性多能細(xì)胞研究所不可缺少的寶貴基礎(chǔ)。繼續(xù)深入研究胚胎干細(xì)胞將無疑大大促進(jìn)誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的研究進(jìn)程。因此，忽視對(duì)胚胎干細(xì)胞的研究是極不應(yīng)該的。
記者：現(xiàn)在很多科學(xué)家都在質(zhì)疑這種研究成果的安全性，您是怎么看的？
基因重組范文3
摘要： 目的 建立一種簡(jiǎn)便、快速基因分型方法，對(duì)廣西人類免疫缺陷病毒（HIV-1）重組毒株gag基因區(qū)進(jìn)行亞型鑒定。方法 從HIV陽性樣本中提取核酸，使用HIV-1 M組通用引物對(duì)gag區(qū)進(jìn)行第1輪擴(kuò)增，第2輪使用分別檢測(cè)C亞型和CRF01-AE重組型的二套特異性引物放入同一反應(yīng)管中進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)不同亞型擴(kuò)增的目的帶位置不同判斷亞型。另外設(shè)計(jì)了一套引物，專門用于檢測(cè)B'/C重組毒株。擴(kuò)增出的所有樣本均進(jìn)行基因測(cè)序和系統(tǒng)樹分析以驗(yàn)證結(jié)果。結(jié)果 54份樣本中，經(jīng)基因測(cè)序和系統(tǒng)樹分析證實(shí)CRF08-BC樣本4份（741%)， CRF01-AE樣本46份（8518%)， 4份（741）無法確定亞型。經(jīng)亞型特異性引物PCR法檢測(cè)出4份（100%) B'/C重組毒株，45份（9783%) CRF01-AE重組毒株，靈敏度為98%，特異性為100%。2種方法檢測(cè)結(jié)果經(jīng)差異性檢驗(yàn)顯示，P>005，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果一致性高達(dá)9815%。與基因分析結(jié)果吻合。重復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示，B'/C的平均重復(fù)性為100% (20/20)，CRF01-AE為983% (59/60)。結(jié)論 該方法具有簡(jiǎn)便、快速，高度靈敏度和特異性的特點(diǎn)，可直接對(duì)廣西HIV -1重組毒株CRFO 1-AE gag基因區(qū)進(jìn)行分型。
關(guān)鍵詞：人類免疫缺陷病毒1型；基因型；聚合酶鏈反應(yīng)
Rapid identification for gag region of circulating recombinant form of humanimmunodeficiency virus type 1
Abstract： Objective To develope a simple and rapid subtype-screening assay for the gag region of the circulating recombinant form (CRF) of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1）in Guangxi.Methods Proviral DNA from HIV-positive samples were extracted and subjected to the first round PCR with universal primers for the gag region that can detect HIV-1 M group isolates.In the second round PCR，two pairs of subtype-specific primers that were designed to detect subtype C and CRF01-AE respectively were added into one tube.The PCR products of different subtypes could be distinguished in agarose-gel electrophoresis.Another pair of subtype-specific primers exclusively detecting the the prevalent recombinantstrains CRF07-BC and CRF08-BC was designed and used.Additionally，all of these samples were sequenced and analyzed phylogenetically.Results DNA sequencing and phylogenetic analysis of the gag region of the 54 samples showed that 4 samples (7.41%) were infected with CRF08-BC，46 (85.18%) with CRF01-AE and 4 (7.41%) remained unclassifiable.Detection of the subtype-specific primer sets revealed that 4 were B'/C (100%)，and 45 were CRF01-AE (97.83%)，with an adequate sensitivity (98%) and a high specificity (100%).Non-specific bands occasionally appeared but did not interfere with interpretation of the results.The phylogenetic analysis was consistent with subtype-specific primer sets and the consistent rate was 98.15%.The average reproducibility was 100% for B'/C samples and 98.3% for CRF01-AE samples.Conclusion A simple，rapid and low cost assay is developed for subtype-screening of CRFO1-AE in Guangxi.For the B'/C strains in Guangxi，it needs to be verified further by increasing samples.
Key words： human immunodeficiency virus type 1(HIV-1）；genetic subtype；polymerase chain reaction (PCR)
人類免疫缺陷病毒-1（HIV-1）高度變異，不同亞型毒株其生物學(xué)特性及；分子流行病學(xué)特征均有所不同〔1〕，若能快速、準(zhǔn)確地對(duì)HIV進(jìn)行基因分型不僅有助于了解HIV-1轉(zhuǎn)播規(guī)律，而且可為闡明HIV基因型與生物表型關(guān)系、藥物耐藥性等研究提供資料。近年來，我國(guó)學(xué)者〔2〕建立了一種多重巢式PCR法對(duì)我國(guó)HIV-1主要流行株進(jìn)行鑒定亞型。然而，由于HIV-1的基因變異度極高，在傳播過程中可產(chǎn)生許多具有相對(duì)獨(dú)立的基因序列型別，使得不同地區(qū)各亞型間具有其自身的特異性。廣西壯族自治區(qū)為國(guó)內(nèi)HIV感染的高發(fā)區(qū)，大部分感染發(fā)生在經(jīng)濟(jì)尚不發(fā)達(dá)地區(qū)的人群中。因此，建立廣西HIV-1主要流行株快速基因分型方法十分必要。目前，廣西的優(yōu)勢(shì)流行株為CRF01-AE和CRF08-BC重組毒株〔3，4〕。為此，本研究針對(duì)這2種重組毒株gag基因區(qū)建立了一種亞型特異性引物PCR法的快速基因分型法。
1 材料與方法
11 樣本來源 從廣西HIV-I主要流行區(qū)采集54份樣本，經(jīng)ELISA初篩和免疫蛋白印跡（WB）確認(rèn)為HIV陽性樣本。
12 核酸提取 采用QIAamp Bloodes Mini Kit試劑盒（德國(guó)QiaGen公司）從每位感染者的抗凝全血中提取細(xì)胞DNA，并凍存于-80℃冰柜備用。
13 HIV-1亞型特異性引物的設(shè)計(jì) 亞型特異性引物的設(shè)計(jì)是整個(gè)方法建立的關(guān)鍵。設(shè)計(jì)的基本原則：設(shè)計(jì)的引物位點(diǎn)必須在各個(gè)亞型間高度特異，而在同一種亞型內(nèi)部高度保守。在Primer50軟件的幫助下設(shè)計(jì)出gag區(qū)的亞型特異性引物（表1)。
14 HIV-1 gag基因區(qū)的擴(kuò)增 用nested-PCR對(duì)HIV-1 gag基因區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，第1輪使用引物GagF2/Gage2，模板15μl，反應(yīng)條件：94℃ 5min，52℃ 1min，72℃ 2min 30s，1個(gè)循環(huán)；94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 1min 30s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10min。第2輪模板5μl，使用分別檢測(cè)C亞型和CRF01-AE重組型的2套亞型特異性引物（Cag-c1/Cag-c2，Cag-ae1/Cag-ae2) ，爭(zhēng)套引物放入同一反應(yīng)管中，為減少非特異性反應(yīng)，使用熱啟動(dòng)和降落PCR (TD-PCR）技術(shù)〔5〕，94℃ 5min，52℃ 1min，72℃ 2min 30s，1個(gè)循環(huán)；94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 1min，3個(gè)循環(huán)；94℃ 30s，51℃ 30s，72℃ 1min，3個(gè)循環(huán)；94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 1min，3個(gè)循環(huán)；94℃ 30s，49℃ 30s，72℃ 1min，3個(gè)循環(huán)；94℃ 30s，48℃ 30s，72℃ 1min，25個(gè)循環(huán)，72℃ 10min。如果特異性引物PCR擴(kuò)增出的目的條帶判斷為C亞型，則用專門用于檢測(cè)B'/C重組毒株（包括CRF07-BC和CRF08-BC）的亞型特異性引物Cgag-c1/Cgag-bc為內(nèi)側(cè)引物再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以判斷是否為重組形式。反應(yīng)條件：94℃ 2min，48℃ 1min，72℃ 2min，1個(gè)循環(huán)；94℃ 30s，48℃ 30s，72℃ 1min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10min。同時(shí)使用引物306/Cn-gag擴(kuò)增所有樣本并進(jìn)行基因測(cè)序，用于系統(tǒng)樹分析及亞型鑒定以驗(yàn)證特異性引物分型結(jié)果是否正確。反應(yīng)條件：94℃ 2min，50℃ 50s，72℃ 1min，1個(gè)循環(huán)；94℃ 30s， 50℃ 30s， 72℃ 1min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10min。第1輪和第2輪PCR反應(yīng)體系均為50μl，dNT/P濃度為200μmol/L，Taq酶為25U，引物濃度為04μmol/L，MgCl2濃度為15mmol/L。表1 gag區(qū)PCR擴(kuò)增使用的引物 （略）內(nèi)側(cè)特異性引物注：R=A或G
15 PCR產(chǎn)物檢測(cè) 取5μl第2輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠中電泳，溴化乙錠（EB）染色檢測(cè)，紫外攝影拍照，根據(jù)Markers分子量大小來判定結(jié)果。C亞型片段190bp;CRF01-AE片段881bp;B' /C片段1079bp。
16 序列測(cè)定 對(duì)于全部經(jīng)引物306/Cn-gag擴(kuò)增的樣本，經(jīng)切膠，純化后，以306為測(cè)序引物，提純的PCR產(chǎn)物為模板，采用DNA測(cè)序試劑盒（美國(guó)ABI公司），在PTC-220型多通道PCR儀（美國(guó)MJ公司）上進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)提純后，采用310型全自動(dòng)毛細(xì)管DNA測(cè)序儀（美國(guó)ABI公司）進(jìn)行序列測(cè)定和分析。
17 序列分析 （美國(guó)Los Alamos國(guó)家實(shí)驗(yàn)室HIV核酸序列庫中提供）基因分型工具BLAST程序進(jìn)行基因型鑒定；用Clustal X進(jìn)行排序和MEGA version 21軟件進(jìn)行分析。亞型分析使用的各個(gè)亞型參考序列來自美國(guó)Los Alamos HIV基因數(shù)據(jù)庫。
18 檢測(cè)該方法的重復(fù)性 在CRF01-AE樣本中隨機(jī)選取12份，CRF08-BC 4份，共16份樣本使用上述方法重復(fù)5次。
2 結(jié)果
21 樣本基因測(cè)序和系統(tǒng)樹分析 54份陽性樣本中通過引物306/Cn-gag擴(kuò)增最終獲得50份樣本的基因序列，經(jīng)BLAST程序鑒定出4份樣本gxmu0402，gxmu0416、gxmu0418和gxmu0419為CRF08-BC重組毒株，余下46份為CRF01-AE重組毒株。將50份基因序列與國(guó)際各亞型標(biāo)準(zhǔn)株的基因序列進(jìn)行系統(tǒng)樹分析顯示。4份CRF08-BC樣本與CRF08-BC98CN006和CRF08-BC97CNGX7f靠得很近，而46份CRF01-AE中，有44份與CRF01-AE97CNGX2f聚成一簇，另外2份樣本gxmu0432和gxmu0439與CRF01-AE93JPNH 1和CRF01-AE93TH057十分接近。
22 亞型特異性引物PCR擴(kuò)增 部分樣本經(jīng)亞型特異性引物PCR擴(kuò)增后的電泳結(jié)果見圖1和圖2。根據(jù)不同亞型擴(kuò)增出的目的帶位點(diǎn)不同，判斷出亞型結(jié)果。54份樣本中，采用特異性引物共擴(kuò)增出49份樣本，其中C亞型4份，CRF01-AE重組毒株45份（9783%，45/46)。進(jìn)一步使用B'/C重組特異性引物擴(kuò)增C亞型特異性引物鑒定出來的4份樣本，發(fā)現(xiàn)這4分樣本均為B'/C重組毒株（100%，4/4)。以基因測(cè)序法為金標(biāo)準(zhǔn)，可知亞型特異性引物PCR法的靈敏度為98%，特異性為100%。
23 亞型特異性引物PCR法的重復(fù)性 重復(fù)實(shí)驗(yàn)采用4份CRF08-BC樣本和12份CRF01-AE隨機(jī)樣本進(jìn)行5次重復(fù)。結(jié)果顯示，CRF08-BC重組毒株平均重復(fù)性為100%（20/20），而CRF01-AE在5次重復(fù)中有1次出現(xiàn)1份樣本檢測(cè)不出，其平均重復(fù)性為983%（59/60）。M：DNA分子量；1：H2O；2：陰性對(duì)照；3：xmu0433;4:gxmu0440;5:gxmu0451;6:gxmu0462圖1 部分CRF01-AE樣本瓊脂糖電泳結(jié)果（略） M：DNA分子量；1：H2O；2：陰性對(duì)照；3:gxmu0418;4:gxmu0419 圖2 B'/C樣本瓊脂糖電泳結(jié)果
24 基因測(cè)序法與亞型特異性引物PCR法比較 54份己確認(rèn)的陽性樣本，基因測(cè)序法檢測(cè)并正確分型的樣本是50份，檢出率為9260%，特異性引物PCR法為49份，檢出率為9074%。2種方法檢測(cè)結(jié)果經(jīng)差異性檢驗(yàn)顯示，χ2=0，P>005，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果一致性高達(dá)9815%。
3 討論
本研究結(jié)果表明，亞型特異性引物PCR方法對(duì)于亞型的鑒定結(jié)果與基因測(cè)序、系統(tǒng)樹分析得到的結(jié)果是吻合的，該方法的特異性達(dá)100%。用亞型特異性引物擴(kuò)增樣本時(shí)，有時(shí)一會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。非特異性條帶位置一般不在特異性位置。為防止誤判，可以通過跑厚膠并且延長(zhǎng)電泳時(shí)間，使目的條帶與非特異性條帶充分分開。通常在紫外燈下，非特異性條帶要比目的條帶弱。出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶通常有如下的原因：(1)引物與模板錯(cuò)配擴(kuò)增產(chǎn)生，引物與模板亞型相符，不僅能在特異性位點(diǎn)上與模板結(jié)合，亦能在遠(yuǎn)離特異性位點(diǎn)的地方與模板結(jié)合，這種情況錯(cuò)配通常靠近引物5′端的位置，電泳時(shí)會(huì)出現(xiàn)兩條帶；(2)引物之間形成的引物二聚體，一般出現(xiàn)在80bp左右的位置，通過長(zhǎng)時(shí)間電泳可使此條帶消失；(3)某一亞型的特異性引物與另一亞型的模板錯(cuò)配擴(kuò)增產(chǎn)生，因2套引物放入同一反應(yīng)管中，所以可能出現(xiàn)此情況，為了避免此情況發(fā)生，因此，在設(shè)計(jì)引物時(shí)使引物在3′端與別亞型的模板至少有2個(gè)堿基產(chǎn)生錯(cuò)配。用本研究所建立起的方法對(duì)54份樣本的gag基因區(qū)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有些樣本在1200bp左右的位置會(huì)出現(xiàn)一條非特異性擴(kuò)增，因第1輪PCR擴(kuò)增的條帶位置在1242bp，因此懷疑此非特異性擴(kuò)增條帶為第1輪PCR擴(kuò)增出的目的帶，將第1輪PCR產(chǎn)物與用亞型特異性引物擴(kuò)增出的第2輪產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行電泳，證實(shí)了這一推測(cè)。為了減少此情況的發(fā)生，可減少第1輪反應(yīng)的模板量，同時(shí)在加入反應(yīng)體系、模板和酶后盡量減少室溫放置時(shí)間或在冰盒上操作。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，亞型特異性引物PCR法，靈敏度為98%，特異性為100%，結(jié)果顯示，其靈敏度和特異性均較好。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)顯示，B'/C亞型的平均重復(fù)性為100%，CRF01-AE重組毒株為983%，說明一該方法在實(shí)際中是可行的。但由于CRF08-BC樣本例數(shù)不多，因此，本研究所建立起的方法對(duì)于HIV-1 B'/C重組毒株分型的準(zhǔn)確性有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步證實(shí)。
參考文獻(xiàn)
〔1〕 杰伊A，利維.艾滋病病毒與艾滋病的發(fā)病機(jī)制［J］.2版.北京：科學(xué)出版社，2000：126-132.
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基因重組范文4
[關(guān)鍵詞]血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；預(yù)構(gòu)皮瓣；基因治療；腺病毒
[中圖分類號(hào)]R622 Q813 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2009）03-0332-04
Improve survival of prefabricated flap with adenovirus vectors encoding for VEGF in rats
DING Zhi,ZHENG Jiang-hong,DENG Zhi-ming,YANG Song-lin
(Department of Plastic Surgery, the Sixth People′s Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University,
200233,Shanghai,China)
Abstract: Objective This study investigated the feasibility of local administration of adenovirus vectors encoding for VEGF to induce regional angiogenesis and improve the survival of prefabricated flap in rat prefabricated flap model, so as to provide experimental evidence for a new method with which we can accelerate maturation of prefabricated flap in clinics. Methods 40 prefabricated flaps were created on the left and right abdominal walls in 20 SD rats. Two prefabricated flaps in each rat were randomly allocated to experiment group or control group, and each group contains 20 flaps. In all animals, two 3cm×2cm rectangular skin flaps were designed obliquely on the abdominal wall so that the short side would lie parallel to inguinal ligament. Longitudinal incisions were made on both hind limbs starting from the midpoint of the short side down to the ankle. 2cm long femoral artery, vein were dissected as a bundle and ligated distally. A tunnel was created in the subcutaneous tissue between dermis and panniculus carnosus at the central axis of each planned skin flap. The subcutaneous tissue around the tunnel was injected with adenovirus vectors encoding for VEGF(Ad-VEGF) in experiment group, and with saline in equal amounts in control group. The prepared femoral vessel bundle was then turned over and passed through correspond tunnel. Two weeks later, abdominal island flap based solely on the implanted vessel was elevated. Select one flap from each group to observe the expression of VEGF. Other flaps were resutured into position. Flap viability and neovascularisation were evaluated on postoperative day 7 after the second surgical intervention. Results There was a significant increase in mean survival rate of prefabricated flaps in the Ad-VEGF group compared to the control group: Ad-VEGF, (90.48±1.89)%vs. saline, (69.75±2.36)(P
Key words: vascular endothelial growth factor; prefabricated flap; gene therapy; adenovirus
預(yù)構(gòu)皮瓣應(yīng)用中要解決的重要問題是知名血管植入預(yù)構(gòu)區(qū)域后，建立新的血供系統(tǒng)所需時(shí)間較長(zhǎng)。近年來，有報(bào)導(dǎo)一些多肽類生長(zhǎng)因子如VEGF（Vascular endothelial growth factor, 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子）、bFGF、TGF-β等[1-2]通過直接或間接刺激血管生成作用被用于促進(jìn)預(yù)構(gòu)皮瓣的再血管化進(jìn)程，特別是VEGF能特異性地促血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖、增加血管通透性,為血管內(nèi)皮的遷移及基質(zhì)形成創(chuàng)造條件，故備受研究者青睞。但生長(zhǎng)因子蛋白半衰期短、療效不穩(wěn)定、需反復(fù)應(yīng)用、副作用多，本研究應(yīng)用基因治療技術(shù)，將人VEGFcDNA 通過腺病毒載體，一次性注射于大鼠腹部預(yù)構(gòu)皮瓣血管束周圍軟組織內(nèi)，通過觀察VEGF 的表達(dá)情況及對(duì)預(yù)構(gòu)皮瓣再血管化進(jìn)程和成活的影響，探討腺病毒-VEGF基因重組體促進(jìn)血管化和皮瓣成活的可能性。
1材料和方法
1.1 腺病毒-VEGF基因重組體的制備：重組復(fù)制缺陷型腺病毒pcDNA3/hVEGF165由中科院細(xì)胞所構(gòu)建。將hVEGF165插入pcDNA3的EcoRI和HindIII多克隆位點(diǎn),并轉(zhuǎn)化DH5進(jìn)行擴(kuò)增，凝膠電泳證實(shí)hVEGF165已插入pcDNA3多克隆位點(diǎn)，測(cè)序證實(shí)hVEGF165無突變。以標(biāo)準(zhǔn)的磷酸鈣共沉淀法(Promega, Inc.Kit)轉(zhuǎn)染20ug pcDNA3/hVEGF165到PA317細(xì)胞，通過G418的集落篩選，擴(kuò)大培養(yǎng)，測(cè)定包裝細(xì)胞上清中病毒的滴度，計(jì)算3個(gè)梯度中的cfu（clone forming unit），取最高cfu的包裝細(xì)胞系集落，在32℃的條件下培養(yǎng)48h。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示hVEGF16經(jīng)過EcoI和HindIII雙酶切后產(chǎn)生2個(gè)分別約5.4kb和560bp的hVEGF165片段，經(jīng)測(cè)序證實(shí)無突變，說明腺病毒-VEGF基因重組體構(gòu)建成功。
1.2 動(dòng)物模型的建立：雄性SD大鼠20只，每只體重0.3～0.4kg，每只腹部?jī)蓚?cè)各構(gòu)建一個(gè)預(yù)構(gòu)皮瓣，共構(gòu)建40個(gè)皮瓣，每只大鼠兩側(cè)皮瓣按隨機(jī)原則進(jìn)行不同的處理，分別歸于實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M，每組各20個(gè)皮瓣。1%的氯胺酮腹腔內(nèi)注射麻醉(1ml/100mg)、硫化鋇液脫毛及仰臥位固定后，于大鼠腹部?jī)蓚?cè)各標(biāo)記3cm×2cm矩形預(yù)構(gòu)區(qū),短邊平行于腹股溝韌帶，自尾側(cè)短邊中點(diǎn)向后縱向切開后肢皮膚，在顯微鏡下仔細(xì)剝離出長(zhǎng)約2cm的股動(dòng)靜血管束，遠(yuǎn)端結(jié)扎切斷。在兩側(cè)預(yù)構(gòu)區(qū)域的中軸線上，用18G注射器針頭于真皮與肉膜層間各制作一長(zhǎng)2cm、寬0.3cm的皮下隧道，使用1ml注射器向?qū)嶒?yàn)組的隧道壁皮下組織內(nèi)注射攜帶有VEGF基因的腺病毒，分4個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)注射0.1ml濃度為4×109cfu/L的pcDNA3/hVEGF165，同法向所有對(duì)照組的隧道壁軟組織內(nèi)注射等量生理鹽水。將已剝離好的血管束向顱側(cè)翻轉(zhuǎn)置入相應(yīng)預(yù)構(gòu)區(qū)的皮下隧道內(nèi)，血管束末端用縫線固定于附近皮膚以防回縮，6-0絲線縫合切口（圖1），動(dòng)物返回籠中。所有預(yù)構(gòu)區(qū)域2周后均沿前述腹部預(yù)構(gòu)區(qū)標(biāo)記線切開皮膚，于肉膜層下方剝離形成以植入股血管束為蒂的島狀皮瓣，從兩組中各選一個(gè)皮瓣進(jìn)行免疫組化染色，觀察有無VEGF生成，其余島狀皮瓣均縫回原處（圖2）。
1.3 檢測(cè)指標(biāo)
1.3.1 免疫組化檢測(cè)：血管束植入預(yù)構(gòu)區(qū)域后2周，分別切取Ad-VEGF基因治療組和生理鹽水對(duì)照組中的一個(gè)預(yù)構(gòu)皮瓣進(jìn)行免疫組化檢測(cè)：組織切片經(jīng)脫蠟、浸水處理后用H2O2處理（室溫，10min），應(yīng)用羊血清封閉（37℃，30min）,直接滴加濃度為1∶100的抗人VEGF一抗（小鼠來源單克隆抗體，Santa Cruz公司，美國(guó)），4℃孵浴12h，PBS清洗，滴加二抗（生物素標(biāo)記為山羊抗鼠，DAKO公司，丹麥），DAB（DAKO公司，丹麥）染色，光鏡下放大100倍觀察有無棕黃色顆粒表達(dá)從而確定有無VEGF蛋白生成。
1.3.2 皮瓣存活率：形成島狀皮瓣后第七天，按前述方法麻醉動(dòng)物，相同物距下數(shù)碼相機(jī)拍照后，將圖像輸入KS400 圖像分析系統(tǒng)，經(jīng)圖像增強(qiáng)、分割、待測(cè)面積的二值化處理，精確測(cè)量皮瓣存活部分及壞死部分面積，根據(jù)公式：皮瓣存活率 = 皮瓣存活表面積/皮瓣總表面積×100%，算出兩組各19個(gè)皮瓣的存活率，再計(jì)算各組皮瓣存活率的均數(shù)。
1.3.3 放射顯影：島狀皮瓣拍照后，從兩組中各選取一個(gè)皮瓣，手術(shù)顯微鏡下解剖出蒂部股血管束，分別向兩側(cè)股動(dòng)脈內(nèi)灌注60%泛影葡胺約3ml，結(jié)扎蒂部的股動(dòng)靜脈并切下皮瓣，放射科拍攝鉬靶X光片，獲得植入血管及新生血管的放射顯影圖。
1.3.4 組織學(xué)觀察：島狀皮瓣拍照后，從兩組中各選取一個(gè)皮瓣，切下其存活部分后立即浸入10%甲醛溶液中固定48h，經(jīng)酒精梯度脫水二甲苯透明后石蠟包埋，萊卡切片機(jī)切成4μm薄片,蘇木精-伊紅染色封片，光鏡下放大100倍觀察植入的血管束周圍新生的小血管情況。
1.4 統(tǒng)計(jì)分析：數(shù)據(jù)表示為x±s,用SPSS 11.0 版統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，兩兩之間的比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2結(jié)果
2.1大體觀察及皮瓣存活率：制成島狀皮瓣后，多數(shù)皮瓣邊緣出現(xiàn)程度不等的青紫腫脹，繼而顏色發(fā)黑干性壞死，有的破潰形成形狀各異的創(chuàng)面，一般5～7天后壞死范圍穩(wěn)定，成活與壞死界限分明，皮瓣成活區(qū)質(zhì)地均柔軟（圖3），兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組皮瓣局部可見皮下小血腫。VEGF基因治療組與生理鹽水對(duì)照組皮瓣平均存活率分別為(90.48±1.89)%、(69.75±2.36)%，兩組存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表1）。
2.2血管新生情況：血管放射顯影顯示，實(shí)驗(yàn)組植入血管周圍見廣泛白色顯影，尤以血管兩端明顯，而對(duì)照組新生血管顯影僅局限于植入血管周圍(圖4)；HE染色組織學(xué)切片顯示實(shí)驗(yàn)組植入血管周圍新生血管豐富，以毛細(xì)血管為主，并見肉芽成份，對(duì)照組新生血管相對(duì)較少，兩組間新生小血管管腔大小則無明顯差異(圖5)。
2.3免疫組織化學(xué)檢查：光鏡下放大100倍觀察來自兩組的免疫組化染色切片，VEGF基因治療組見到大量棕黃色顆粒表達(dá),彌漫分布于新生小血管周圍，對(duì)照組切片上未看到棕黃色顆粒（圖6）。
3討論
植入血管與皮膚、皮下組織間建立起新的血液循環(huán)是預(yù)構(gòu)皮瓣成功的關(guān)鍵，新血管系統(tǒng)形成的速度、數(shù)量和范圍直接決定著預(yù)構(gòu)皮瓣的成熟時(shí)間和成活范圍，因此如何促進(jìn)植入血管束多形成新生小血管并與皮瓣的小血管之間建立有效的吻合成為當(dāng)前預(yù)構(gòu)皮瓣的研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，一些多肽類生長(zhǎng)因子能通過促進(jìn)血管新生，從而促進(jìn)缺血皮瓣的成活，1993年Iwasawa M[3]用TGF-β、 2000年Li QF[4]用VEGF來促進(jìn)預(yù)構(gòu)皮瓣的成熟，也取得了預(yù)期效果。研究顯示，VEGF是迄今發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的血管形成因子，能特異性地與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，通過啟動(dòng)有絲分裂原活化蛋白激酶來誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖[5]，其家族中VEGF165在體內(nèi)分布最廣，表達(dá)水平最高。由于VEGF在體內(nèi)的半衰期很短，一般不超過6min，必須反復(fù)使用才能發(fā)揮其血管生成作用，極為不便，不但增加感染機(jī)會(huì)，而且蛋白價(jià)格昂貴，這些情況限制了臨床應(yīng)用前景。后來有人曾利用凝膠態(tài)的聚乙烯乙醇作為緩釋劑，試圖延長(zhǎng)VEGF作用時(shí)間，發(fā)現(xiàn)并未提高VEGF的療效[6]。近年來，日漸成熟的基因重組和轉(zhuǎn)染等生物技術(shù)為VEGF保持其在局部的持續(xù)存在和作用提供了新穎的途徑：將VEGF基因插入到某種載體形成基因重組體，再轉(zhuǎn)染作用部位細(xì)胞，將VEGF基因帶入轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，使得轉(zhuǎn)染細(xì)胞成為 VEGF 的“緩釋庫”，較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)不斷產(chǎn)生VEGF蛋白，充分發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。目前該基因治療技術(shù)已被報(bào)道用來改善缺血皮瓣的血供[7]以及提高自體顆粒脂肪移植成活率[8]，也有學(xué)者用于治療臨床上一些缺血性疾病[9]，取得了一定的療效。我們?cè)诖嘶A(chǔ)上設(shè)想應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)促進(jìn)預(yù)構(gòu)皮瓣再血管化和增加皮瓣成活率，以便縮短預(yù)構(gòu)成熟時(shí)間。研究結(jié)果顯示，注射基因重組體后兩周時(shí)的實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本切片免疫組化染色可見大量棕黃色顆粒，證實(shí)pcDNA3/hVEGF165已進(jìn)入血管束周圍細(xì)胞內(nèi)并持久表達(dá)了VEGF蛋白，證明基因治療技術(shù)同樣能保持VEGF在預(yù)構(gòu)皮瓣中的持久存在。在HE染色組織切片及血管放射顯影的光鏡檢查中，實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本的新生小血管較對(duì)照組的豐富，說明Ad-VEGF基因治療組在局部VEGF的持續(xù)刺激下，誘導(dǎo)形成了大量的新生小血管，有利于預(yù)構(gòu)皮瓣的存活，表現(xiàn)為治療組島狀皮瓣存活率高于對(duì)照組，這些結(jié)果說明應(yīng)用基因治療技術(shù)產(chǎn)生VEGF促進(jìn)預(yù)構(gòu)皮瓣成熟是可行的。
本研究采用腺病毒作為VEGF基因的載體，是因?yàn)槠滢D(zhuǎn)導(dǎo)效率高，而且腺病毒一般不與轉(zhuǎn)染細(xì)胞的染色體整合，故比較安全[10]。在HE染色組織切片上，治療組見到明顯炎性肉芽成份，這與以前的有關(guān)研究報(bào)導(dǎo)相符合，可能與腺病毒導(dǎo)致的宿主免疫反應(yīng)[11]有關(guān)。研究中發(fā)現(xiàn)治療組一些皮瓣內(nèi)出現(xiàn)小血腫，可能是VEGF增加了局部血管通透性所致，所以尋找合宜的劑量和用藥濃度以最大程度的發(fā)揮其促血管生成作用而盡量避免副作用是今后研究的問題之一。
建立合理的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪茄芯款A(yù)構(gòu)皮瓣再血管化的前提，以往的預(yù)構(gòu)皮瓣實(shí)驗(yàn)研究中，多是先掀起隨意型皮瓣，然后將血管載體固定于皮瓣肉面，其缺點(diǎn)是手術(shù)創(chuàng)傷大，易引起嚴(yán)重纖維化影響預(yù)構(gòu)皮瓣的質(zhì)地；此外，掀起皮瓣還會(huì)因手術(shù)創(chuàng)傷觸發(fā)內(nèi)源性血管生長(zhǎng)因子產(chǎn)生[12]，干擾對(duì)外源性VEGF發(fā)揮促進(jìn)血管新生作用的觀察。本研究在一期手術(shù)中，并未掀起皮瓣，只是在預(yù)構(gòu)區(qū)域形成一包容血管束的皮下隧道，這無疑最大程度地減少了內(nèi)源性VEGF的產(chǎn)生，而且手術(shù)創(chuàng)傷小，保證了皮瓣質(zhì)地柔軟，操作也簡(jiǎn)便，有臨床推廣價(jià)值。以往有研究認(rèn)為，VEGF在非缺血組織中生物活性低[13]，本研究預(yù)構(gòu)區(qū)血液循環(huán)良好，VEGF同樣顯示了良好的促進(jìn)血管新生作用，這也許和腺病毒誘發(fā)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。在剝離股血管束時(shí)，我們保留了少許管周組織，以防止損傷血管束內(nèi)動(dòng)、靜脈之間的微細(xì)血管通道[14]，保證移位的血管束早期不致栓塞，但如果管周組織保留過多，一部分管周組織會(huì)因?yàn)樵缙谌毖l(fā)生纖維化，從而妨礙血管束新生小血管。血管束植入動(dòng)物肉膜層與真皮層之間，是因?yàn)槿饽觾?nèi)小血管網(wǎng)及真皮下血管網(wǎng)均較豐富，便于新生血管與其吻接溝通，同時(shí)制作島狀皮瓣時(shí)也提供了解剖標(biāo)志。
總之，本研究證明基因治療方法能夠保持VEGF在預(yù)構(gòu)皮瓣中的持久存在，從而促進(jìn)預(yù)構(gòu)皮瓣血管新生和皮瓣成活，未見明顯并發(fā)癥，為臨床上加速預(yù)構(gòu)皮瓣成熟提供了新的途徑。但腺病毒作為目的基因載體，是否會(huì)使人體基因發(fā)生突變，是否會(huì)導(dǎo)致病毒感染，以及如何提高基因轉(zhuǎn)染效率，尋找恰當(dāng)?shù)慕o藥途徑、用藥劑量與濃度等問題尚需要繼續(xù)研究。
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基因重組范文5
【關(guān)鍵詞】 NT4ApoptinHA2TAT 重組腺相關(guān)病毒 腫瘤 融合基因
近年來不損傷正常細(xì)胞的蛋白質(zhì)和相關(guān)肽的發(fā)現(xiàn)為腫瘤的基因治療帶來了轉(zhuǎn)機(jī)， 利用重組腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)這類基因， 注射實(shí)體瘤之后， 可以在一個(gè)較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)持續(xù)表達(dá)殺傷腫瘤的蛋白［1］。體外合成或基因工程表達(dá)的CAVVP3蛋白Apoptin能特異地誘導(dǎo)多種人源性惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡， 但對(duì)正常二倍體體細(xì)胞無作用［2］。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上擬構(gòu)建神經(jīng)生長(zhǎng)因子4(NT4)信號(hào)肽引導(dǎo)的可分泌表達(dá)ApoptinHA2TAT的重組腺相關(guān)病毒高效表達(dá)載體， 為下一步進(jìn)行Apoptin應(yīng)用于基因治療奠定基礎(chǔ)。
1 材料和方法
1.1 材料 克隆載體pGEMT/Apoptin質(zhì)粒有本課題組構(gòu)建［3］; 限制性內(nèi)切酶NaeⅠ、 XhoⅠ、 EcoRⅠ、 SalⅠ購自寶泰克生物公司; Taq DNA聚合酶、 T4 DNA連接酶購自華美生物公司; pUC19/NT4質(zhì)粒、 pGEMT/HA2TAT、 腺病毒穿梭質(zhì)粒pSSCMV及輔助質(zhì)粒pAAV/Ad、 腺病毒質(zhì)粒pFG140， 大腸桿菌DH5α及293細(xì)胞系、 小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3、 HepG2人肝癌細(xì)胞系均由西安華廣生物工程公司提供。
1.2 方法
1.2.1 pUC19/NT4ApoptinHA2TAT載體構(gòu)建 堿裂解法大量制備重組質(zhì)粒pGEMT/Apoptin、 pGEMT/HA2TAT， 分別用限制性內(nèi)切酶NaeⅠ、 KpnⅠ、 XhoⅠ消化， 切取Apoptin、 HA2TAT用T4 DNA連接酶連入帶有相同末端的已線性化pUC19/NT4載體。用連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化制備好的感受態(tài)細(xì)菌E.coli DH5α菌株， 隨機(jī)挑選單個(gè)菌落， 接種于含有氨芐西林的LB培養(yǎng)基內(nèi)， 37℃增殖培養(yǎng)， 堿裂解法小量提取質(zhì)粒， 用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切， 篩選出含有約710 bp左右的重組質(zhì)粒pUC19/NT4ApoptinHA2TAT。
1.2.2 腺病毒穿梭質(zhì)粒pSSCMV/NT4ApoptinHA2TAT的構(gòu)建 EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切腺病毒穿梭質(zhì)粒pSSCMV和EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切pUC19/NT4ApoptinHA2TAT， 低熔點(diǎn)凝膠回收NT4ApoptinHA2TAT和線性化的pSSCMV， T4 DNA連接酶連接， 轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)菌， 挑選轉(zhuǎn)化的菌落， 提取質(zhì)粒， EcoR Ⅰ 和Hind Ⅲ 雙酶切篩選并鑒定陽性克隆。
1.2.3 重組腺相關(guān)病毒的包裝與鑒定及滴度測(cè)定 采用磷酸鈣沉淀法三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞獲取重組腺相關(guān)病毒。轉(zhuǎn)染3 d后， 質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)同源重組構(gòu)建出重組腺相關(guān)病毒， 毒斑出現(xiàn)， 反復(fù)凍融含病毒栓子的培養(yǎng)基， 提取病毒， 收集含病毒的上清液感染80%成片的HEK293細(xì)胞。Dot blot法測(cè)定重組病毒滴度。
1.2.4 重組腺相關(guān)病毒對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響 將HepG2細(xì)胞以每孔10 000個(gè)細(xì)胞的量接種于96孔培養(yǎng)板中， 每孔體積200 μL， 培養(yǎng)24 h后分實(shí)驗(yàn)組、 正常細(xì)胞小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3組和空病毒組， 各加入10MOI的空病毒或重組病毒， 病毒作用2 h后更換新鮮正常培養(yǎng)液， 在病毒作用后的24、 48、 72 h分別終止培養(yǎng)(以上每組各設(shè)3個(gè)復(fù)孔)， 加入MTT試劑(5 g/L)20 μL， 37℃孵育4 h， 將含MTT的培養(yǎng)液移去， 加入二甲基亞砜150 μL， 搖勻15 min， 使反應(yīng)產(chǎn)物充分溶解。在測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm的酶標(biāo)儀上測(cè)定光密度A值。
2 結(jié)果
2.1 重組質(zhì)粒pUC19/NT4ApoptinHA2TAT的構(gòu)建 Apoptin和HA2TAT被酶切后插入pUC19/NT4載體， 轉(zhuǎn)化E.coli， 挑選克隆， 用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切， 篩選出含有約710 bp左右的重組質(zhì)粒pUC19/NT4ApoptinHA2TAT（圖1）。
2.2 重組腺相關(guān)病毒穿梭質(zhì)粒pSSCMV/NT4ApoptinHA2TAT的構(gòu)建與鑒定 NT4ApoptinHA2TAT插入pSSCMV載體， 轉(zhuǎn)化E.coli， 挑選克隆， 進(jìn)行酶切鑒定。重組質(zhì)粒pSSCMV/NT4ApoptinHA2TAT的大小為5 860 bp。用EcoR I 和Hind Ⅲ雙酶切獲得5 100 bp和760 bp兩個(gè)片段（圖2）。
圖1 pUC19/NT4ApoptinHA2TAT重組質(zhì)粒基因酶切鑒定（略）
Fig 1 The result of pUC19/NT4ApoptinHA2TAT digested with restriction enzyme
1: λDNA/Hind Ⅲ marker; 2: 100 bp DNA marker; 3: Digested with EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ; 4: Digested with EcoR
Ⅰ; 5: pUC19/NT4ApoptinHA2TAT.
圖2 pSSCMV/NT4ApoptinHA2TAT質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果（略）
Fig 2 The result of pSSCMV/NT4ApoptinHA2TAT digested with restriction enzyme
1: pSSCMV/NT4ApoptinHA2TAT; 2: Digested with EcoR Ⅰ/Hind Ⅲ; 3: λDNA/Hind Ⅲ marker; 4: 100 bp DNA marker.
2.3 NT4ApoptinHA2TAT重組腺相關(guān)病毒包裝與滴度測(cè)定 將構(gòu)建好的pSSCMV/NT4ApoptinHA2TAT質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒pAAV/Ad、 腺病毒質(zhì)粒pFG140， 應(yīng)用磷酸鈣DNA共沉法共轉(zhuǎn)染80%融合的293細(xì)胞， 包裝得到NT4ApoptinHA2TAT重組腺相關(guān)病毒。用收獲的毒種感染293細(xì)胞， 至MOI為10時(shí)， 加PBS液細(xì)胞冰融， 離心取上清-20℃保存?zhèn)溆谩⑺@得的病毒液對(duì)數(shù)比稀釋后， 利用Dot blot法測(cè)定滴度為3.14×1015 pfu/L。
2.4 MTT比色法測(cè)定重組腺相關(guān)病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用 AAVmock和NT4ApoptinHA2TAT重組腺相關(guān)病毒分別感染HepG2細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)， NT4ApoptinHA2TAT重組腺病毒組比AAVmock組的HepG2細(xì)胞的存活率明顯降低， 而對(duì)NIH3T3組無影響， 說明NT4ApoptinHA2TAT重組腺相關(guān)病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞有選擇性誘導(dǎo)凋亡作用（圖3）。
3 討論
目的基因或載體對(duì)正常組織的毒性和腫瘤細(xì)胞對(duì)治療的耐受等是限制腫瘤基因治療臨床應(yīng)用的瓶頸， 而Apoptin的發(fā)現(xiàn)給抗腫瘤的基因治療帶來了轉(zhuǎn)機(jī)。體外合成或基因工程表達(dá)的Apoptin能特異的引起多種人源性惡性腫瘤細(xì)胞凋亡， 對(duì)正常二倍體體細(xì)胞無作用; 而且這種選擇性凋亡作用既不依賴于p53的介導(dǎo)， 也不被Bcl2過表達(dá)所抑制， 而大部分腫瘤的耐藥產(chǎn)生都是由p53的缺失（突變）或Bcl2的過表達(dá)引起。對(duì)惡性細(xì)胞的選擇性凋亡且對(duì)抗耐藥的特點(diǎn)使Apoptin成為基因治療的理想目的基因（蛋白）。近來的大量研究表明， 無論是和免疫制劑［4］還是和化療藥物［5］聯(lián)用都能增強(qiáng)治療效果， 顯示出了凋亡素的巨大應(yīng)用前景。
圖3 AAV/NT4apoptinHA2TAT對(duì)HepG2細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞存活率的影響（略）
Fig 3 The effect of AAV/NT4ApoptinHA2TAT on HepG2 cells and NIH3T3 cells
A: The effect on NIH3T3 cells; B: The effect on HepG2 cells. bP
但是， 現(xiàn)行的Apoptin腫瘤基因治療中， 多數(shù)以腫瘤細(xì)胞為靶細(xì)胞， 在這種治療模式下， 雖然降低毒副作用， 但治療效應(yīng)往往隨腫瘤細(xì)胞的凋亡而終止， 增加了治療的難度和費(fèi)用。基于此， 本研究在Apoptin基因的兩端融合進(jìn)3個(gè)基因片段: NT4為信號(hào)肽， 可以引導(dǎo)NT4ApoptinHA2TAT通過膜性結(jié)構(gòu)并在經(jīng)過脂質(zhì)膜時(shí)通過信號(hào)肽酶切位點(diǎn)切下信號(hào)肽（NT4）， 從而使成熟肽分泌（ApoptinHA2TAT）到細(xì)胞外; TAT［6］為HIV中的穿膜肽， 可介導(dǎo)分泌之胞外的ApoptinHA2TAT以巨胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞; HA2［7］為流感病血毒凝素2亞單位的NH2的結(jié)構(gòu)域， 為pH依賴性融合胎， 在低pH環(huán)境中可增強(qiáng)ApoptinHA2TAT從巨胞飲體中逃逸。
如果應(yīng)用含有NT4ApoptinHA2TAT的重組腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染間質(zhì)干細(xì)胞或其他相關(guān)細(xì)胞會(huì)輸體內(nèi)， 將大大提高治療基因的表達(dá)效率和延長(zhǎng)分泌時(shí)間， 同時(shí)依賴于Apoptin的特異性殺傷和對(duì)抗耐藥的特性， 則解決了基因治療的有效性和安全性的關(guān)鍵問題。
應(yīng)用MTT法檢測(cè)感染重組病毒的人肝癌HepG2細(xì)胞和小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3活性， 結(jié)果顯示分泌表達(dá)目的基因的重組AAV對(duì)HepG2細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用， 而對(duì)正常細(xì)胞無作用， 說明融合蛋白沒有改變Apoptin的腫瘤特異性殺傷特性， 且融合蛋白能夠被分泌表達(dá)且發(fā)揮了生物活性。其對(duì)表達(dá)效率和分泌時(shí)間的正影響及轉(zhuǎn)染間質(zhì)干細(xì)胞的在體效應(yīng)， 則有待于進(jìn)一步研究。
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基因重組范文6
【摘要】
目的研究南山茶子拮抗孕激素作用。方法用系統(tǒng)溶劑分離法將南山茶子醇提物分成極性不同的組分，利用重組人孕激素受體基因酵母生物檢測(cè)法篩選南山茶子拮抗孕激素活性部位。結(jié)果5個(gè)組分都表現(xiàn)出拮抗孕激素的效應(yīng)，活性強(qiáng)弱依次為醋酸乙酯層>正丁醇層>石油醚層>水層>醇提物。結(jié)論醋酸乙酯部位可能為南山茶子拮抗孕激素的活性部位。
【關(guān)鍵詞】 南山茶 重組人基因酵母 孕激素受體 拮抗作用
Abstract：ObjectiveTo study the antiprogestin active parts of the seeds of Camellia serrdserrate Chi.MethodsThe seeds of Camellia serrdserrate Chi. extract was separated into four fractions according to polarity， its antiprogestin active parts was investigated by a recombinant yeast screening assay. ResultsThe five fractions showed antiprogestin activity， and the order of the estrogenic activity of these fractions was ethyl acetate> normal butyl alcohol> petroleum ether > water extract > alcohol extraction.ConclusionThe ethyl acetate is the antiprogestin active parts of the seeds of Camellia serrdserrate Chi..
Key words：Camellia serrdserrate Chi.; Recombinant yeast; Progesterone receptor; Antagonistic effect
正常人骨代謝的平衡是離不開體內(nèi)一種特殊物質(zhì)調(diào)節(jié)的，這種特殊物質(zhì)就是激素。激素是由內(nèi)分泌器官所分泌的一種高效能有機(jī)化合物，人體內(nèi)很多種激素，其中目前已經(jīng)明確與骨質(zhì)疏松有關(guān)聯(lián)的8種：雌激素、甲狀腺激素（PTH）、降鈣素、活性維生素D、甲狀腺激素、雄激素、皮質(zhì)類固醇激素、生長(zhǎng)激素。其中前4種更為重要。這些激素或通過影響破骨細(xì)胞的數(shù)量及活性來調(diào)節(jié)骨吸收過程，或通過影響成骨細(xì)胞的活性來調(diào)節(jié)骨形成過程，從而調(diào)節(jié)骨代謝。當(dāng)這些激素在人體內(nèi)達(dá)到某一濃度時(shí)能夠維持骨吸收與骨形成的平衡，但當(dāng)它們?cè)隗w內(nèi)的含量發(fā)生異常變化時(shí)，便會(huì)使骨代謝失去平衡，導(dǎo)致骨量的減少，從而引起骨質(zhì)疏松。已有大量的文獻(xiàn)報(bào)道［1，2］：孕激素受體能夠降低雌激素受體(ER)的轉(zhuǎn)錄活性，也就是說對(duì)孕激素受體活性的抑制能夠增強(qiáng)體內(nèi)雌激素受體活性的表達(dá)。
南山茶Camellia serrdserrate Chi.屬于山茶科山茶屬植物，廣泛分布于我國(guó)的西南部和東南部，集中分布于我國(guó)長(zhǎng)江以南的亞熱帶地區(qū)，資源非常豐富［3］，其化學(xué)成分主要有黃酮，皂苷和多酚這三大類［4］，我們?cè)趯?duì)山茶屬植物藥用價(jià)值的研究過程中發(fā)現(xiàn)，南山茶種子乙醇提取物對(duì)維甲酸所致骨質(zhì)疏松的大鼠有很強(qiáng)的抗骨質(zhì)疏松活性，并且明顯高于陽性對(duì)照藥。為了具體確定南山茶子抗骨質(zhì)疏松的有效部位，我們首先用95%乙醇提取南山茶子得到醇提物，對(duì)其中三類化學(xué)成分的含量進(jìn)行了測(cè)定，總黃酮4.07%，總皂苷12.15%，總酚4.30%［5］，并分別依次用石油醚、醋酸乙酯、水飽和正丁醇進(jìn)行萃取，濃縮至干，再用轉(zhuǎn)基因酵母的生物檢測(cè)方法對(duì)它們是否有拮抗孕激素受體的作用進(jìn)行研究，從而從另一角度來闡明南山茶子抗骨質(zhì)疏松的作用機(jī)理。
1 儀器與試藥
Laborata 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Heidolph，Germany）；酶標(biāo)儀（Spectra Fluor plus，TECAN，Austria）；分光光度計(jì)（WFZ UV-2000，上海）；恒溫振蕩搖床（HZQ-F，哈東聯(lián)）；恒溫平板搖床（Titramax 1000，Heidolph，Germany）；百級(jí)超凈工作臺(tái)（DL-CJ-1F，哈東聯(lián)），旋渦混合器（MS2，廣州IKA Works），96孔培養(yǎng)板，96孔酶標(biāo)板（比利時(shí) Orange）。ONPG（Sigma，USA），二甲基亞砜（99.9%，Sigma，USA），酵母氮堿（Difco，USA）。
南山茶種子（2006年3月采集于廣西省平南縣六陳鎮(zhèn)，經(jīng)昆明植物民裴盛基教授鑒定）；重組人孕激素受體（hPR）基因酵母（Gaido贈(zèng)送）；SC培養(yǎng)基；孕酮（PG）（MP. Bio medical公司）；酶反應(yīng)底物鄰硝基苯基β－D－半乳糖苷（Sigma）；二甲基亞楓(Sigma)，所用試劑均為分析純，溶于超純水（Milli-Q，USA）。
2 方法
2.1 試劑的配制
2.1.1 SC培養(yǎng)液稱取36 mg賴氨酸，12 mg組氨酸，6.7 g無氨基酵母氮源，20 g葡萄糖溶于1 000 ml超純水中，用0.22 μm濾膜過濾除菌后于4℃下冷藏保存。
2.1.2 基礎(chǔ)緩沖液稱取21.5 g Na2HPO4·12 H2O，6.22 g NaH2PO4·2H2O，0.75 g KCl，0.25 g MgSO4·7H2O溶于1 000 ml超純水中，于4℃下冷藏保存。
2.1.3 鄰硝基苯基β－D－半乳糖苷溶液（ONPG）溶液（13.3 mmol·L-1）稱取0.4 g ONPG溶于100 ml基礎(chǔ)緩沖液中即可（現(xiàn)配現(xiàn)用）。
2.1.4 Na2CO3溶液（1 mol·L-1）稱取10.6 g無水Na2CO3溶于100 ml超純水中，于4℃下冷藏保存。
2.1.5 CuSO4溶液（50 μmol·L-1）稱取1.196 g CuSO4·5H2O溶于100 ml超純水中，于4℃下冷藏保存。
2.2 酵母接種的培養(yǎng)重組人孕激素受體基因酵母由Gaido贈(zèng)送，培養(yǎng)基為增加硫酸銅（50 μmol·L-1）、腺嘌啉、賴氨酸、色氨酸的SC培養(yǎng)基，室溫避光保存［6］。
將1 ml新鮮凍融的酵母菌株接種到9 ml SC培養(yǎng)液中加10 μl CuSO4，置于轉(zhuǎn)速130 r·min-1，溫度為37℃的空氣浴搖床中培養(yǎng)過夜，用分光光度計(jì)測(cè)定10倍稀釋的酵母菌株培養(yǎng)液在600 nm波長(zhǎng)處的吸光度（以培養(yǎng)基為空白），要求吸光度值在0.15～0.5，用培養(yǎng)液將酵母菌液稀釋到A600=0.75作為工作液［7］。
2.3 南山茶的抗孕激素活性測(cè)定分別稱取南山茶子醇提物，石油醚層浸膏，醋酸乙酯層浸膏，正丁醇層浸膏以及水層浸膏各50 mg，用1 ml DMSO溶解，得濃度為50 mg·ml-1的溶液。取990 μl工作菌液至對(duì)應(yīng)的EP管中，分別加入5 μl DMSO（空白），5 μl用DMSO溶解的孕酮（PG，陽性對(duì)照，1×10-7mol·L-1）和5 μl用DMSO溶解的樣品渦旋混勻。在加入5 μl樣品的EP管中再加入5 μl PG（濃度為1×10-7mol·L-1）渦旋混勻，將以上溶液各200 μl依次轉(zhuǎn)移至96孔板中，然后于恒溫平板搖床800 r·min-1，37℃振蕩培養(yǎng)2 h。酶標(biāo)儀測(cè)定A595后，吸取150 μl溶液棄去，加入120 μl測(cè)試緩沖液和20 μl氯仿，在30℃的恒溫?fù)u床上預(yù)培養(yǎng)10 min。加入40 μl ONPG（4 mg·L-1）反應(yīng)液將酶反應(yīng)啟動(dòng)至出現(xiàn)明顯的黃色后加入100 μl 1 mol·L-1Na2CO3溶液終止反應(yīng)，吸取200 μl上清液轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)板中測(cè)定A420的值［7］。
2.4 β-半乳糖苷酶活性以及孕激素抑制活性的計(jì)算
U=［(A420-A′420)/T×V×A595］×D
式中U代表酶活力，A420代表樣品在420 nm處的吸光度，A′420為空白溶液（即DMSO）在420 nm處的吸光度，A595為樣品在595 nm處的吸光度，T代表反應(yīng)時(shí)間，V為反應(yīng)菌液的稀釋倍率，D為稀釋因子。
抑制率(%)=1-U樣U陽×100%
U樣為加入樣品后標(biāo)準(zhǔn)品所表現(xiàn)出的酶活性，U陽為對(duì)照品PG的酶活性。
3 結(jié)果
實(shí)驗(yàn)最后的總體積為200 μl，樣品的反應(yīng)時(shí)間都為60 min，樣品稀釋倍率為0.2，將我們所測(cè)得A420和A595值帶入上面的公式，就可以計(jì)算出相應(yīng)的β-乳糖苷酶的活力值和抑制率。結(jié)果見表1和圖1。表1 加入南山茶各樣品后孕酮的酶活值/U和抑制率（略）
由表1和圖1可以看出，樣品南山茶子的醋酸乙酯部位抗孕激素活性最強(qiáng)，抑制率達(dá)到50%，其他各個(gè)組分基本相當(dāng)，因此通過以上的數(shù)據(jù)分析我們可以判斷南山茶子醇提物的醋酸乙酯部位為其拮抗孕激素的活性部位。
4 討論
重組孕激素受體基因酵母是一種快速、有效的檢測(cè)化合物是否有孕激素活性或抗孕激素活性的方法。它是將人孕激素受體基因（hPR）和孕激素受體響應(yīng)元件（PRE）相連的β-半乳糖苷酶（LacZ）報(bào)告基因這兩個(gè)基因片段引入到酵母中，當(dāng)被測(cè)物質(zhì)加入培養(yǎng)基中誘導(dǎo)或抑制PR時(shí)，都會(huì)啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生和分泌β-半乳糖苷酶。通過測(cè)定A420的吸光度值來反應(yīng)β-半乳糖苷酶的活性，從而可以得出被測(cè)物質(zhì)對(duì)孕激素受體的作用。
植物雌激素與雌激素受體結(jié)合，在體內(nèi)具有雙向調(diào)節(jié)作用。當(dāng)體內(nèi)雌激素水平較低時(shí)，它就表現(xiàn)出雌激素樣活性，當(dāng)體內(nèi)雌激素超過正常水平時(shí)，它就發(fā)揮出抗雌激素的作用［8］。重組雌激素受體基因酵母篩選南山茶子抗骨質(zhì)疏松有效部位的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示醋酸乙酯部位對(duì)雌激素受體表現(xiàn)出雙向調(diào)節(jié)的作用，具有較明顯的雌激素活性同時(shí)又有較強(qiáng)的抗雌激素活性，因此推斷雌激素樣作用可能是南山茶子發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用的主要機(jī)理之一，但是， 醋酸乙酯部位具有抑制孕激素受體的作用，同樣能夠?qū)е律矬w產(chǎn)生類雌激素樣的結(jié)果。因此，同時(shí)應(yīng)用重組雌激素和孕激素受體基因酵母，可以更加準(zhǔn)確篩選出南山茶子抗骨質(zhì)疏松的活性部位。
致謝：本實(shí)驗(yàn)是在中科院生態(tài)研究中心水生態(tài)毒理研究組完成，在此特別向王子健研究員給予本實(shí)驗(yàn)的幫助和支持表示最誠(chéng)摯的謝意，感謝本實(shí)驗(yàn)室所有的老師和同學(xué)。
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