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基因治療范文1
基因治療(GeneTherapy)是指將外源正常基因?qū)氚屑毎约m正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病，而達到治療目的。1991年美國實施了人類第一個對遺傳病進行體細胞基因治療的方案，科學(xué)家W.FrenchAnderson等將含有正常ADA（AdenosineDeaminase，腺苷脫氨酶）基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)入一個4歲患有ADA-SCID（SevereCombinedImmunodeficiency，嚴重復(fù)合免疫缺陷綜合征）的女孩的白細胞內(nèi)，并用白細胞介素Ⅱ(IL-2)刺激其增殖，經(jīng)10天左右再經(jīng)靜泳輸入到此患兒體內(nèi)。大約1－2月治療一次。8個月后，患兒體內(nèi)ADA水平達到正常值的25％，兩年后基本恢復(fù)正常，未見明顯副作用。此后又進行第2例治療并獲得類似的效果[1-2]。
這是基因治療史上的里程碑，迅速引起了全球基因治療的研究熱潮。然而，基因治療的發(fā)展并不是一帆風順的。1999年，美國一名年僅18歲的青年JesseGelsinger因患鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶不足癥（一種遺傳性疾病）在美國賓夕法尼亞大學(xué)人類基因治療中心接受基因治療時不幸死亡，這一事件震驚了當時的科技界。基因治療一度跌入低谷，各國對基因治療臨床試驗的資助大幅減少[3]。基因治療在爭議中不斷地前進，最近幾年已取得不俗進展，重新成為各國研究的熱點。RNAi（RNAinterference,RNA干擾）是基因治療的又一亮點，其在神經(jīng)性、遺傳性、病毒性等疾病中的治療研究已經(jīng)展開[4]。2009年，針對X-連鎖型腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良癥(X-linkedAdrenoleukodystrophy，X-ALD)的基因治療初見成效，并被《Science》評為年度十大科學(xué)發(fā)現(xiàn)之一[5]。正如《Science》評論指出：在飽受科學(xué)界質(zhì)疑以及制藥業(yè)遺忘多年后，近幾年基因治療在應(yīng)對嚴重遺傳性疾病方面取得了重大突破，再次優(yōu)雅的回歸[6-7]。在我國，基因治療也有一定發(fā)展。1991年，復(fù)旦大學(xué)薛京倫教授研究小組進行了國內(nèi)首例基因治療臨床試驗。
2003年，人類首例商業(yè)化基因治療產(chǎn)品“重組Ad-p53腺病毒注射液”在深圳誕生。目前，我國已在在遺傳病、腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及細胞因子基因治療的臨床前研究取得了一定成績[7]。基因治療按靶細胞類型分為生殖細胞(Germ-lineCell)基因治療和體細胞(SomaticCell)基因治療。廣義的生殖細胞基因治療以、卵子和早期胚胎細胞作為治療對象。由于生殖細胞基因治療涉及一系列倫理學(xué)問題，如人權(quán)問題、阻礙人類多樣性的問題以及基因歧視等，生殖細胞基因治療仍屬[8]。體細胞基因治療是當前基因治療研究的主流，但是仍處于臨床試驗階段，存在較高的風險性和不穩(wěn)定性。基因治療由于自身技術(shù)的高度復(fù)雜和難以控制，同時涉及一定的社會倫理學(xué)問題，應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)必然會引起相關(guān)的法律問題。
二、基因治療在臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的法律問題
（一）隱私權(quán)
基因(Gene)是指攜帶有遺傳信息的DNA序列，是控制性狀的基本遺傳單位。基因有兩個特點，一是能忠實地復(fù)制自己，以保持生物的基本特征；二是基因能夠“突變”，突變絕大多數(shù)會導(dǎo)致疾病，另外一小部分是非致病突變。非致病突變給自然選擇帶來了原始材料，使生物可以在自然選擇中被選擇出最適合自然的個體。基因與人類的健康密切相關(guān)。基因的特點決定了基因具有特殊的地位①，基因治療過程中必然涉及到患者基因的隱私權(quán)保護。一是基因隱私保密權(quán)。保護個人隱私的隱蔽性、不公開性是使個人隱私保持其受法律保護狀態(tài)的前提。基因信息不僅與個人密切相關(guān)，而且與個人的后代相關(guān)。因而,個人享有對其基因信息進行保密,不為他人所知的權(quán)利。[9]二是基因隱私的知曉權(quán)。獲取基因進行基因研究必須向基因的所有者進行告知，讓基因所有者知情，使其知道自己的基因作何用途。[10]三是基因隱私利用權(quán)。是指自然人依法對自己的基因信息進行積極利用,以滿足自己精神、物質(zhì)等方面需要的權(quán)利。[9]四是基因隱私支配權(quán)。這是基因隱私權(quán)的核心內(nèi)容。任何單位或個人未經(jīng)基因提供者本人的同意或授權(quán)，不得隨意公開、使用或處置基因提供者的基因信息。[10]如利用基因信息進行相關(guān)科研等活動時，必須征得提供者的同意。五是基因隱私維護權(quán)。是指自然人對于自己的基因隱私所享有的維護其不可侵犯性,在受到非法侵害時可以尋求司法救濟的權(quán)利。[9]例如，非經(jīng)基因提供者的同意，將其基因信息進行商業(yè)活動時，基因提供者有權(quán)依靠法律得到相關(guān)賠償。
（二）知情同意書的簽訂
任何醫(yī)療活動都會存在風險，為保護醫(yī)患雙方的權(quán)益，大部分臨床醫(yī)療活動均要簽訂相關(guān)知情同意書，并受法律保護。基因治療應(yīng)用到臨床醫(yī)學(xué)，簽訂知情同意書同樣至關(guān)重要。我國1994年頒布的《醫(yī)療機構(gòu)管理條例實施細則》第六十二條和八十八條以及2002年頒布的《醫(yī)療事故處理條例》第十一條規(guī)定，患者在醫(yī)療過程中對自己的病情、診斷、治療享有知情權(quán)。醫(yī)方施行手術(shù)、特殊檢查或特殊治療時，必須征得患者同意。概言之，患者知情同意權(quán)包括了解權(quán)、被告知權(quán)、選擇權(quán)、拒絕權(quán)和同意權(quán)，但不宜告知患者的（仍應(yīng)告知其家屬）除外。特殊檢查、治療系指該檢查、治療具有一定危險性，或因患者本質(zhì)特殊、病情危急可能產(chǎn)生不良后果，或系臨床試驗性，或收費較多。基因治療治療顯然屬于上述法律規(guī)定中的特殊檢查和治療范疇。基因治療不同于傳統(tǒng)的醫(yī)療活動，其高科技、高要求及高風險等特點必然決定此類知情同意書的特殊性。受試者有權(quán)利要求被告知基因治療實施單位及人員的資格以及經(jīng)驗、風險效益比、其他可替代的保守治療途徑、保密問題、受傷害時的賠償?shù)鹊取嵤﹩挝贿€必須有一份針對使用的基因產(chǎn)品的專業(yè)醫(yī)師的指示說明，包括依實驗所知的產(chǎn)品藥性、毒性和治療效果等。[11]考慮到基因治療的復(fù)雜和難以理解性，一般人不是很容易透徹理解，應(yīng)當成立相關(guān)部門，如基因治療專家咨詢委員會等，幫助患者及家屬真正了解基因治療及知情同意書的內(nèi)容，真正維護患者及其家屬的利益。
（三）治療方案的規(guī)范
基因治療現(xiàn)在還大多仍處于臨床試驗階段，還不是一種成熟和穩(wěn)定的治療技術(shù)，存在較多不宜克服的難題，其中最為突出的是：
1.效率問題
基因治療的時效比較短暫。基因治療成功的前提是導(dǎo)入治療性DNA的靶細胞能發(fā)揮功能，并且能夠在體內(nèi)長時間存活并且性能穩(wěn)定。然而，導(dǎo)入的外源性的DN段會導(dǎo)致許多細胞快速分化從而很大程度上可能基因治療的持續(xù)性。患者必須經(jīng)過多輪治療，如前所述的第一例成功的基因治療病例中，1-2月就要進行一次，每次費用大概兩萬多美元，代價相當昂貴。[1-2]此外，任何外物進入人體組織后，人體的免疫系統(tǒng)就會被激發(fā)產(chǎn)生免疫應(yīng)答以防御入侵者，而這種免疫應(yīng)答在某種程度上也會降低基因治療的效果。
2.安全性問題
病毒是大多數(shù)基因治療研究中選擇的載體，會對病人帶來許多潛在危險，比如其毒性、免疫和炎癥反應(yīng)以及基因控制和定位的問題。基因治療的安全性是目前基因治療爭論最為激烈的問題，比較著名的是前文提到的那位18歲美國病人死于基因治療。患者死亡的主要原因是基因治療對象選擇有誤及用藥劑量過大，盡管病毒載體進入細胞后是隨機整合至宿主細胞染色體的，但其仍具有潛在的插入突變可能性。[12]基因治療屬于高端的新醫(yī)療技術(shù)，存在相當高的風險。由于技術(shù)的限制性以及可能涉及相關(guān)的社會倫理問題，基因治療在實施時必須遵循一定規(guī)范，必須由相關(guān)部門進行管制和監(jiān)督。1993年，我國衛(wèi)生部頒布了《人的體細胞治療及基因治療臨床研究質(zhì)控要點》，將人的體細胞治療及基因治療的臨床研究納入《藥品管理法》的法制化管理。2003年，我國藥監(jiān)局又頒布了《人基因治療研究和制劑質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》，較為詳細地規(guī)定了基因治療研究的技術(shù)標準和操作規(guī)范。
三、我國臨床基因治療的立法思考
（一）國外基因治療的立法經(jīng)驗
1.美國
1976年，美國國立衛(wèi)生研究院(NationalInstitutesofHealth,NIH)成立了重組DNA咨詢委員會(RAC)并制定世界上第一個實驗室基因工程應(yīng)用法規(guī)《重組DNA分子實驗室準則》，首開了政府對生物技術(shù)發(fā)展進行控制的先例。隨后，在基因治療進入臨床研究前的1985年，美國NIH制訂了針對體細胞基因治療的指導(dǎo)準則《人類體細胞基因治療的設(shè)計和呈批考慮要點》，是這一領(lǐng)域里第一個系統(tǒng)的成文規(guī)章。[13]美國對基因治療臨床試驗的監(jiān)督由健康和人類服務(wù)部的食品與藥品管理局和人體研究保護辦公室兩個法定機構(gòu)負責。所有從事人體研究的研究者，無論是來自學(xué)術(shù)機構(gòu)還是工業(yè)界，都必須遵循上述機構(gòu)的監(jiān)督管理[14]。
2.英國
1989年，英國政府成立基因療法倫理委員會，作為臨床治療的審批和監(jiān)督機構(gòu)。1993年成立基因治療咨詢委員會，對基因治療臨床方案的可接受性進行審查和管理，協(xié)調(diào)與其他相關(guān)機構(gòu)的關(guān)系。[13]
3.奧地利
奧地利基因治療的管理要遵循基因技術(shù)法的有關(guān)規(guī)定。體細胞基因治療只能在被批準的醫(yī)院里由特定的醫(yī)療小組進行，并要得到相關(guān)政府機構(gòu)和倫理委員會的同意。[14]
4.德國
德國1984年由司法部和科研部召集醫(yī)生、生物學(xué)家、哲學(xué)家、法學(xué)家、宗教代表組成了一個基因分析和基因治療的研究小組，為政府的立法提供咨詢報告，并基于報告提出了一系列相關(guān)的法律法規(guī)。[13]德國1990年制定世界上第一部“基因技術(shù)法”，分七部分四十二節(jié)。[14]
（二）我國臨床基因治療的立法建議
基因治療對個體及人類生命的影響程度遠遠超過了傳統(tǒng)醫(yī)療技術(shù)，其風險也是目前的醫(yī)療經(jīng)驗知識無法掌控的。同時，基因治療還可能引發(fā)不少社會倫理問題。這些問題的解決離不開法律的支持。就本人觀點而言，我國臨床基因治療的立法至少應(yīng)包括以下內(nèi)容：
1.治療范疇的立法
首先要確定臨床基因治療的范疇，何種基因治療可以在人體內(nèi)進行等基本問題。最為典型的是生殖細胞基因治療，它涉及平等問題和其他個人侵害問題，如優(yōu)生主義、基因歧視等，各國對其一般都持反對態(tài)度。[8]就我國目前而言，可以通過法律規(guī)定臨床醫(yī)學(xué)基因治療的基本范疇，同時規(guī)定設(shè)立相關(guān)倫理委員會進行協(xié)助管制。
2.治療方案審核的立法
除了涉及相應(yīng)的社會倫理問題，基因治療還存在高風險且費用昂貴，如何權(quán)衡“受益/風險”的比例也相當重要。我國可以指定或成立相關(guān)機構(gòu)或部門，進行臨床基因治療方案的嚴格審核。
3.規(guī)范化治療方面的立法
臨床基因治療，從方案的選擇、實施到最后的療效評估等，都應(yīng)嚴格按照一套規(guī)范化的程序進行。美國的基因治療臨床研究倫理審查已制度化。美國食品和藥物管理局(FoodandDrugAdministration,FDA)生物制品評估和研究中心(CBER)負責對基因治療、細胞治療的安全性和有效性的評價。美國國立衛(wèi)生研究院下設(shè)的生物技術(shù)活動辦公室(OBA)執(zhí)行對基因治療研究的監(jiān)管。人體研究保護辦公室側(cè)重于對受試者的保護，而所有涉及人類受試者的臨床試驗都要接受地方倫理委員會審查。英國參與基因治療監(jiān)管和審查相關(guān)的政府部門包括醫(yī)學(xué)和醫(yī)療產(chǎn)品管理局(MHPRA)、轉(zhuǎn)基因作物(GMOs)科學(xué)咨詢委員會、基因治療咨詢委員會(GTAC)、地方倫理委員會。[7]就我國而言，關(guān)于臨床基因治療規(guī)范化方面的立法，至少考慮以下幾方面內(nèi)容：首先，臨床基因治療資格的審查機制。基因治療資格的獲得必須通過嚴格審查，包括相關(guān)的治療設(shè)施及人員配備是否達到必需的標準。其次，獲得資格后的施行人必須嚴格按照標準的基因治療方案進行治療。現(xiàn)在可參照的是《人的體細胞治療及基因治療臨床研究質(zhì)控要點》以及《人基因治療研究和制劑質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》這兩份文件，之后可隨著基因治療的日趨成熟作相應(yīng)修改補充或?qū)ｉT立法規(guī)定。[15]再者，應(yīng)當成立或指定相關(guān)部門對臨床基因治療規(guī)范化的實施進行不間斷的監(jiān)督和管制，及時發(fā)現(xiàn)并處理基因治療過程中的問題。同時，還應(yīng)追蹤患者的治療效果，作相應(yīng)的評估分析。最后，應(yīng)當建立基因治療數(shù)據(jù)庫。數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)應(yīng)準確詳實，并配有相應(yīng)的對照、評估以及傳播信息的保護機制。[14]
4.侵權(quán)方面的立法
基因治療的技術(shù)高難度性以及涉及相關(guān)社會倫理學(xué)問題等特點使得它在臨床醫(yī)學(xué)操作過程中更易發(fā)生醫(yī)患矛盾。我國2010年7月開始施行的《侵權(quán)責任法》專設(shè)第七章規(guī)定醫(yī)療損害責任相關(guān)問題。基因治療應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)，同樣將涉及相關(guān)的侵權(quán)問題。一是隱私權(quán)。由于基因治療的特殊性，基因治療過程中患者的隱私權(quán)保護尤為重要。《侵權(quán)責任法》第六十二條是患者的隱私權(quán)保護相關(guān)規(guī)定，臨床基因治療在這方面的立法可參照此法并結(jié)合自身特點作相應(yīng)補充。二是知情同意書的簽訂。除了《侵權(quán)責任法》第五十五條關(guān)于患者知情權(quán)的相關(guān)規(guī)定外，基因治療作為一種特殊治療，其知情同意書中還應(yīng)詳細闡述基因治療實施單位和個人的資格及經(jīng)歷、基因治療的詳細過程及療效、可能產(chǎn)生的各種風險、治療費用等內(nèi)容。由于基因治療的復(fù)雜和難以理解性，還應(yīng)指定或成立相關(guān)部門，如基因治療專家咨詢委員會等，幫助患者及家屬真正了解基因治療和知情同意書的內(nèi)容再做出是否簽訂的決定，真正維護患者及其家屬的利益。臨床基因治療在這方面的法律規(guī)定應(yīng)該進行全面的考量。三是規(guī)范化治療。《侵權(quán)責任法》第五十八條第一款規(guī)定，違反法律、行政法規(guī)、規(guī)章以及其他有關(guān)診療規(guī)范的規(guī)定導(dǎo)致患者有損害，推定醫(yī)療機構(gòu)有過錯。基因治療作為一種高難度、高風險的治療方案，施行規(guī)范化的保守治療將更加安全，因此應(yīng)該制定相應(yīng)的法規(guī)進行管制。
5.對治療方法本身保護的立法
基因治療自身能否依法得到保護，尤其是能否通過被授予專利權(quán)得到保護，一直是全球爭論的焦點。基于人道主義的考慮以及疾病治療方法因人而異缺乏重復(fù)性的考慮，大多數(shù)國家對疾病治療方法不予以專利保護。基因治療屬于疾病治療的方法，所以目前大多數(shù)國家都同樣不予以專利保護。[16]《歐洲專利公約》(EuropeanPatentConvention,EPC)對授予專利的要求是新穎性、實用性以及創(chuàng)造性，其中第52(4)條指出，通過外科手術(shù)等治療和診斷人類或動物疾病的方法不符合其工業(yè)化實用性的要求，不應(yīng)被授予專利。基因治療作為一種疾病治療方法，在歐洲同樣不被授予專利保護。此外，其真正目的還在于保護公共利益，使公眾避免花費昂貴的醫(yī)療服務(wù)費用。然而，并不是所有基因治療相關(guān)的發(fā)明都被EPC排斥在專利保護范圍之外。EPC為用于基因治療方法的產(chǎn)品，特別是物質(zhì)或其化學(xué)成分提供專利權(quán)保護，這些產(chǎn)品的新穎性可參照EPC第54(5)條規(guī)定確定。即使這些物質(zhì)或化學(xué)成分以前就被人知曉，但只要作為一種治療、手術(shù)或者診斷的方法第一次被發(fā)現(xiàn)，仍然可以被授予專利。[16]例如，在ADA-SCID基因治療中，導(dǎo)入含有缺陷基因正確拷貝數(shù)的病毒顆粒到體內(nèi)的治療方法并不能被授予專利，但治療過程中用的這種遺傳學(xué)已發(fā)生改變的病毒可以被授予專利，這個病毒將被授予治療ADA-SCID醫(yī)學(xué)使用的專利保護，即使它之前已被授予別的非醫(yī)學(xué)使用專利保護。專利法對于技術(shù)發(fā)展的推動作用不容小覷，生物技術(shù)也不例外。作為這個領(lǐng)域的領(lǐng)先者，美國和歐盟都不否認這個觀點。根據(jù)美國專利法的規(guī)定，疾病治療的方法包括基因治療，是可以被授予專利保護的。這樣勢必促進本土對基因治療的深入研究，最終在這一領(lǐng)域處于壟斷地位。關(guān)于這一點，對基因治療專利化保護限制的歐盟也已日益意識到來自美國的競爭壓力，并且意識到自身的法律規(guī)定已經(jīng)限制了本土在這一領(lǐng)域的發(fā)展，現(xiàn)已采取相關(guān)措施逐漸擴大對基因治療的保護范圍。我國專利法第二十五條明確規(guī)定，對“疾病的診斷和治療方法”不授予專利權(quán)。因此，我國對基因治療本身不應(yīng)給予專利保護。然而，用于基因治療的藥物或器械等產(chǎn)品，則應(yīng)該按照現(xiàn)行《專利法實施細則》等法律授予專利保護，以維護發(fā)明者的利益和刺激我國基因治療的研究，從而促進我國基因治療技術(shù)水平的發(fā)展。
基因治療范文2
關(guān)鍵詞：RNA干擾；小干擾RNA；基因沉默；腫瘤
中圖分類號：Q522文獻標識碼：A文章編號：1672-979X(2009)01-0054-04
RNA Interference and Tumor Gene Therapy
JU Ji-yu, LI Zai-lian
(Department of Immunology, Weifang Medical University; Key Laboratory of Immunology in Universities of Shandong, Weifang 261042, China)
Abstract：RNA interference is a mechanism for controlling normal gene expression, which has been employed as a potential technology for a wide range of disorders such as tumors, infectious diseases and metabolic disorders. This paper reviews the discovery, mechanism of RNA interference and its application in tumor diagnosis and prevention, as well as some challenges.
Key words：RNA interference; small interfering RNA; gene silencing; tumor
基因治療是一種特異性的治療方法，可用在疾病早期。基因治療一般是通過一定的技術(shù)把遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入細胞并永久改變細胞表型，例如通過替換變異的腫瘤抑制基因（如p53）、抑制基因轉(zhuǎn)錄、引入能編碼治療物質(zhì)（如scFv）的新基因或者使特定的靶基因沉默（如反義技術(shù)）等。RNA干擾（RNA interference，RNAi）是控制基因表達的特異有效方法。近年RNAi已成為研究根據(jù)基因功能合理設(shè)計藥物的重要工具。本文現(xiàn)簡要介紹RNAi的發(fā)展史和近來在腫瘤基因治療中的應(yīng)用。
1RNAi的發(fā)現(xiàn)及作用特點
1.1概述
RNAi是指小分子雙鏈RNA抑制同源序列基因的表達，是生物進化過程中保留下來的機制。像反義技術(shù)一樣，RNAi可以特異的抑制基因的表達。RNAi最早在秀麗新小桿線蟲（C. elegans）中發(fā)現(xiàn)可以抵御外來基因的入侵。此后陸續(xù)在昆蟲、植物、真菌和脊椎動物中也發(fā)現(xiàn)了該機制。
1.2干擾RNA的分類及作用特點
目前，已知具有功能作用的小分子干擾RNA主要包括小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）和Piwi-interacting RNA（piRNA）3類。
1.2.1siRNA的發(fā)現(xiàn)及作用機制1993年學(xué)者們發(fā)現(xiàn)秀麗新小桿線蟲中微小RNA和反義互補RNA抑制基因的表達。1995年Guo等[1]用反義RNA技術(shù)阻斷秀麗新小桿線蟲中par-1基因表達時發(fā)現(xiàn)，正義RNA和反義RNA均能阻抑基因功能表達，且兩者的作用是相互獨立的，機制也各不相同。1998年Fire等[2]首次發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA（dsRNA）能夠特異性地抑制秀麗新小桿線蟲的紋狀肌細胞unc-22基因表達，dsRNA引起的基因沉默效應(yīng)要比單用反義RNA或正義RNA強十幾倍。注入秀麗新小桿線蟲的性腺后，在其第一子代中也誘導(dǎo)出了同樣基因的抑制現(xiàn)象，表明RNAi有可遺傳性。此現(xiàn)象稱為RNAi。因為RNAi作用發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）。1999年Hamilton等[3]在植物基因沉默研究中首次發(fā)現(xiàn)，21~25 核苷酸（nt）的dsRNA出現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因?qū)е禄虺聊种匾瑫r指出RNAi作用是由部分純化的核酸酶中所含siRNA介導(dǎo)的。2000年首次在果蠅中發(fā)現(xiàn)，通過核糖核酸酶可將長的dsRNA處理為21～23 nt的短片段[4]。2001年，首次報道了哺乳動物細胞中也有RNAi。2002年證明了用短的發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA（shRNA）在哺乳動物細胞中可以誘導(dǎo)特異性的基因沉默[5]。2003年首次用RNAi技術(shù)對模型動物進行了治療研究[6]。
哺乳動物體內(nèi)RNAi的作用機制與植物及果蠅等RNAi的機制相似，體外研究證實，RNAi是一個ATP依賴性的過程。首先，dsRNA通過細胞膜進入細胞，在胞質(zhì)內(nèi)的Dicer（一種序列特異性的核酸內(nèi)切酶，屬RNA酶家族III成員）的作用下，分解成21～22 nt；3’端帶有2～3個末端突出堿基的dsRNA分子，這種小的dsRNA分子稱為siRNA[7]。siRNA與Agonaute2等蛋白酶結(jié)合，形成由RNA介導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-induced silenceing complex，RISC）。RISC大約500 kb，在ATP供能的條件下，RISC可以把其攜帶的雙鏈siRNA分子變成單鏈siRNA。含單鏈siRNA的RISC有活性，可與目的mRNA結(jié)合，導(dǎo)致其斷裂、降解，從而導(dǎo)致目的基因沉默[8]。
1.2.2miRNA的發(fā)現(xiàn)和作用特點miRNA是一種內(nèi)源性的非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA），由大約2l～23 nt組成單鏈RNA分子。miRNAs廣泛存在于植物、線蟲和人類細胞中，可能是一類進化上保守的、在生命中起重要調(diào)控作用的分子[9]。它們能有效地抑制相關(guān)蛋白質(zhì)的合成，導(dǎo)致靶mRNA降解，或者以其他形式的調(diào)節(jié)機制抑制靶基因表達，產(chǎn)生基因沉默。Lin-4和Let-7是最早在秀麗新小桿線蟲中發(fā)現(xiàn)的能時序性地調(diào)控胚胎后期發(fā)育的基因，這些基因編碼一類長度約21 nt的小分子短暫RNA（small temporal RNA，stRNA）[10] 。后來，又相繼在線蟲、果蠅、HeLa細胞、擬南芥和水稻等許多真核模式生物和細胞中找到了幾百個相似的小分子RNA，將其統(tǒng)稱為miRNA，Lin-4和Let-7基因編碼的stRNA則認為是miRNA的代表[11]。
與siRNA一樣，miRNA也可以引發(fā)RNAi現(xiàn)象。在miRNA生成過程中，編碼miRNA的基因首先轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生幾百至幾千核苷酸的初級產(chǎn)物（pri-miRNA），在核內(nèi)被核酸內(nèi)切酶Drosha酶切割成約70 nt的發(fā)夾狀前體（pre-miRNA）。pre-miRNA在Ran-GTP和轉(zhuǎn)運蛋白Exportin-5的協(xié)同作用下轉(zhuǎn)運出細胞核，經(jīng)Dicer酶切割成約22 nt的成熟miRNA。成熟miRNA可通過兩種機制調(diào)控靶基因表達：一種是和siRNA一樣，與靶mRNA結(jié)合，促進其降解；另一種是結(jié)合到靶mRNA的3＇UTR部位抑制其翻譯。如果miRNA與靶序列互補配對高則可能切割mRNA，配對低的可能只是抑制[12]。
1.2.3piRNA的發(fā)現(xiàn)2006年由4個獨立的研究小組[13，14]在小鼠實驗中分離得到一種能與piwi蛋白相互作用的小分子RNA，稱為piRNA，由30 nt組成。piwi基因為Argonaute基因家族成員之一，科學(xué)家們推測，這類小分子RNA可能與動物體的發(fā)育和維持功能相關(guān)。實驗結(jié)果表明，每個精母細胞或完整的細胞中大約含有100萬個piRNA[13]。同時，經(jīng)過克隆也觀察到大量26～31 nt的小分子RNA。根據(jù)RNA的長度大小，piRNA可分為2種：第1種長29～31 nt，可以和MIWI蛋白連接；第2種長26～28 nt，可以率先與MILI蛋白結(jié)合。在成年小鼠體內(nèi)，第1種比第2種含量高。但由于某些piRNA探針可以檢測出30 nt和26 nt區(qū)帶，所以2種piRNA均可形成相同的分化過程。利用cDNA末端快速擴增技術(shù)確定它們的5’端相同，而3’端相差2 nt。這2種piRNA是否發(fā)揮不同的作用有待進一步研究。
2在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用
最初RNAi在腫瘤學(xué)的應(yīng)用主要是針對突變的腫瘤基因、增生、轉(zhuǎn)位和病毒基因，闡明其功能以及和其它基因之間的相互聯(lián)系。應(yīng)用RNAi技術(shù)探索各種基因的功能及相互作用為篩選新的藥物靶基因提供了便利。RNAi已用來加強現(xiàn)存藥物如伊馬替尼（imatinib）和雷帕霉素的作用，這是通過沉默抗性相關(guān)基因?qū)崿F(xiàn)的[15]。當用siRNA抑制Prkdc基因（與DNA修復(fù)有關(guān)的基因）后，人成纖維細胞對射線的敏感性明顯增強[16]。抗凋亡基因survivin被認為是診斷和治療腫瘤的一個很有價值的基因，是RNAi治療的候選基因[17]。融合癌基因BCR/ABL在人白血病細胞系中成功地被人工合成的siRNA抑制，不但減少了相應(yīng)基因蛋白的表達，而且誘導(dǎo)靶細胞發(fā)生凋亡[18]。用RNAi方法抑制融合基因ALM1/MTG8可增強細胞因子驅(qū)動的淋巴母細胞在骨髓中分化。有趣的是，癌基因轉(zhuǎn)錄被抑制可以長達5 d。相似的情況是，用RNAi方法抑制培養(yǎng)的EWS/Fil肉瘤細胞癌基因表達可以使細胞生長減慢長達3周[19]。現(xiàn)在已有多種基因用于RNAi治療腫瘤的研究，如bcl-2、fas、k-ras、myc、p53等。這一方法的前景依賴于siRNA或shRNA能否使癌基因轉(zhuǎn)錄沉默并帶來相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[20]。
3RNAi所面臨的問題
RNAi用于臨床腫瘤治療要解決兩個問題，首先如何把有效的干擾RNA帶到腫瘤細胞內(nèi)，對特異性靶基因產(chǎn)生特異性的抑制作用；其次，如何避免RNAi帶來的副作用。
3.1載體問題
以前的研究表明，血流中的siRNA或DNA很難通過細胞膜屏障和逃避內(nèi)體溶酶體的降解作用[21]。為了提高siRNA的運載效率，學(xué)者們發(fā)展了很多病毒和非病毒運載體系，大大提高了運載siRNA的效率。如基于逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒的運載系統(tǒng)在體內(nèi)外均實現(xiàn)了RNAi介導(dǎo)的基因沉默[22]。腺病毒由于基因在細胞內(nèi)表達短暫，應(yīng)用受到很大限制。逆轉(zhuǎn)錄病毒由于其復(fù)制過程中要經(jīng)過DNA中間體過程，能把前病毒整合到宿主細胞基因組上，從而實現(xiàn)穩(wěn)定表達。用表達siRNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒加上一些調(diào)控元件可實現(xiàn)組織特異性基因沉默[23]。然而，逆轉(zhuǎn)錄病毒基因治療的主要問題是插入變異的問題。腺相關(guān)病毒載體可以實現(xiàn)外源基因宿主基因組的定點整合，也可以實現(xiàn)外源基因的穩(wěn)定表達，但純化仍然是需要突破的一道障礙[24]。除了病毒載體以外，非病毒載體也用于腫瘤的基因治療。如陽離子脂質(zhì)體或聚乙醇胺均用作siRNA運載體。這些載體均已用作體內(nèi)siRNA實驗并在靜脈給藥或鼻內(nèi)給藥后實現(xiàn)了目的基因沉默。但是，這些載體在體內(nèi)均表現(xiàn)出毒性和激發(fā)機體免疫應(yīng)答的能力[25]。因此，需要改進這些載體和進一步尋找更加安全的載體。另外一種值得注意的載體是殼聚糖。殼聚糖是一種陽離子多糖，已廣泛用于藥物的運載，特別是DNA介導(dǎo)的基因治療藥物的運載。殼聚糖的胺帶有正電荷，可與核酸上的磷酸形成聚合電解質(zhì)絡(luò)合物。而且，這種質(zhì)子化的胺還有利于復(fù)合物與細胞膜結(jié)合并被內(nèi)吞入細胞。現(xiàn)已證明，殼聚糖/siRNA微粒可在體內(nèi)外介導(dǎo)基因沉默。而且，已證明殼聚糖是生物相容的、非致炎、非毒、可降解的材料。因此，殼聚糖/siRNA運載系統(tǒng)可能具有良好的發(fā)展前景[22]。
3.2脫靶效應(yīng)
如果考慮將siRNA作為治療藥物，須考慮它的序列特異性和評估它的脫靶效應(yīng)的危險性。例如，必需保證只有目的基因mRNA被降解而其它必需基因不受影響。siRNA產(chǎn)生脫靶效應(yīng)主要基于以下3個方面：（1）由于shRNA和siRNA均含有dsRNA序列，因此它們可能會誘發(fā)機體的天然免疫應(yīng)答，如干擾素應(yīng)答。（2）轉(zhuǎn)染或表達的siRNA可能會產(chǎn)生一些非特異性效應(yīng)。（3）盡管設(shè)計的siRNA與目的基因互補，但也可能和非靶基因mRNA互補[26]。
研究表明，dsRNA的長度大于30 bp可以導(dǎo)致非特異性抑制基因表達，大部分是由于激活了dsRNA依賴性的蛋白激酶PRK和隨后的磷酸化以及滅活eIF2a 所引起。RNA的長度（siRNA或shRNA）與此有關(guān)，即使11 bp的siRN段也可誘導(dǎo)微弱的干擾素應(yīng)答。有些措施可以減輕干擾素應(yīng)答，如減少轉(zhuǎn)染siRNA的量，也可通過檢測干擾素應(yīng)答基因如寡腺苷合酶-1的方式預(yù)防干擾素應(yīng)答發(fā)生[27]。除了干擾素應(yīng)答外，另一個脫靶效應(yīng)就是由于外源siRNA的導(dǎo)入使細胞內(nèi)RNAi機制飽和，從而抑制內(nèi)源性RNAi（miRNA）發(fā)揮作用，產(chǎn)生非特異性的毒性反應(yīng)。這就要求在進行外源siRNA轉(zhuǎn)染時盡可能減少外源siRNA的用量[27]。最近用基因芯片進行的研究表明，用RNAi方法抑制慢性髓性白血病細胞中BCR-ABL融合蛋白表達可啟動細胞內(nèi)其它沉默的癌基因、抗凋亡基因和細胞因子的表達[28]。因此，RNAi技術(shù)在真正應(yīng)用到臨床之前，需要更加嚴格的評估。
4展望
把RNAi技術(shù)從研究工具轉(zhuǎn)變?yōu)橹委熓侄嗡龅降闹饕獑栴}是載體系統(tǒng)。我們需要更加特異、有效的運載系統(tǒng)，如可以特異性腫瘤靶向的載體或者帶有腫瘤細胞特異性啟動子的載體系統(tǒng)。由于RNAi主要與細胞胞漿成分作用，這是優(yōu)于其它基因治療方法之處。盡管攝取效率和穩(wěn)定性是建立RNAi治療方法所遇到的主要問題，但這一領(lǐng)域的飛速發(fā)展表明，也許在幾年之后，我們就能找到較好的解決辦法。
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基因治療范文3
論文關(guān)鍵詞：基因治療,移植靜脈,再狹窄
隨著醫(yī)療水平的發(fā)展，像靜脈移植等手術(shù)方法治療包括冠狀動脈在內(nèi)的血管狹窄等疾病給病人生活帶來新的希望，但術(shù)后通暢率逐年下降又給病人帶來新的憂慮。目前對預(yù)防移植靜脈再狹窄主要手段有放射、藥物、物理治療，雖然有一定成效，但效果還是不佳，隨著生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們將希望寄托于基因治療。下面將對基因治療中目的基因和載體的選擇進展進行綜述。
1.目的基因的種類靜脈橋再狹窄主要機制就是內(nèi)皮細胞的損傷；血栓形成；平滑肌細胞的遷移和增殖。這為我們目的基因的選擇提供依據(jù)。
1.1促進內(nèi)皮細胞修復(fù)的基因。
1.1.1內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)一氧化氮（NO）是體內(nèi)重要的生物信使分子和效應(yīng)分子，它具有抑制vsmc增殖、遷移，抑制血小板聚集等功能。而eNOS是NO合成的關(guān)鍵酶，通過將eNOS基因局部轉(zhuǎn)移，是防止移植血管狹窄的有效手段。王曉明等通過給靜脈橋轉(zhuǎn)染帶有eNOS基因的復(fù)制缺陷型重組腺病毒，再旁路移植到動脈后得出其加速內(nèi)皮細胞再生、抑制血栓形成，進而抑制內(nèi)膜增生。
1.1.2血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)VEGF能高效的刺激內(nèi)皮細胞的增殖，使損傷的內(nèi)皮盡快得到修復(fù)，也可以間接抑制血管平滑肌細胞遷移和增殖。VEGF165是最主要的異構(gòu)體，是其生物學(xué)作用的主要形式，也是目前的基因治療中主要選用的異構(gòu)體。有研究表明通過腺病毒介導(dǎo)的VEGF過度表達可以使球囊損傷的動脈內(nèi)皮細胞再生，抑制血管內(nèi)膜增殖。
1.1.3肝細胞生長因子(HGF):HGF是一種間質(zhì)細胞衍生的多功能細胞因子，能刺激血管內(nèi)皮細胞分裂和增殖,促進血管內(nèi)皮細胞損傷的修復(fù)，但不引起VSMC的增殖。有研究表明轉(zhuǎn)染HGF基因可增強球囊損傷后血管內(nèi)皮組細胞的功能，有效抑制損傷血管的狹窄。
1.2抗血栓形成的基因。
1.2.1組織因子途徑抑制物(TFPI)TFPI是相對穩(wěn)定的糖蛋白，是廣譜的Kunitz類型絲氨酸蛋白酶抑制物，其具有很強的抗凝作用。有研究表明通過腺病毒介導(dǎo)TFPI基因局部轉(zhuǎn)染可以顯著抑制PICA術(shù)后血栓形成和內(nèi)膜增厚，主要是通過促進血管平滑肌細胞（VSMC）凋亡而抑制血管的狹窄的。
1.2.2組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)t-PA纖溶酶原激活劑主要物質(zhì)之一，主要有血管內(nèi)皮細胞合成。其主要功能就是裂解纖溶酶原肽鍵，形成具有活性的纖溶酶。Ross報道t-PA減少能使經(jīng)皮冠狀動脈成形術(shù)(PTcA)后血管狹窄,可見t-PA在預(yù)防血管狹窄中起到比較重要的作用。t-PA不僅能預(yù)防血管狹窄，有項研究也表明tPA基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體直接注入介入手術(shù)后再狹窄動物模型的血管壁可以減輕狹窄面積，甚至能達到30%。
1.3抑制VSMC增殖遷移的基因。
自體移植靜脈再狹窄的主要病理特征為內(nèi)膜顯著增厚。增厚內(nèi)膜主要是由血管平滑肌細胞增殖、遷移等因素形成，其中有很多調(diào)節(jié)步驟參與當中。這為我們抑制VSMC增殖、遷移提供許多候選基因。單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）是一種能使無活性的核昔類似物輕甲基無環(huán)鳥苷轉(zhuǎn)化為磷酸化的細胞毒性形式，誘導(dǎo)DNA鏈合成中止引起細胞死亡。實驗研究表明HSV-tk基因能抑制新生內(nèi)膜形成、降低內(nèi)膜面積與中膜面積的比值(I：M)。FAS是一種凋亡受體，在VSMC中表達較多，當FAS配體在血管壁上表達也可以降低新生內(nèi)膜的形成。抗細胞遷移金屬基質(zhì)蛋白酶(MMPs)基因在VSMC的遷移中有十分重要的作用,組織型金屬蛋白酶抑制劑1(TIMP1)及其同家族成員都有顯著減低I:M比例.
1.4聯(lián)合基因治療
由于預(yù)防移植靜脈狹窄干預(yù)靶點太多,而誰是關(guān)鍵基因尚未確定,又加上單一靶點效果并不理想,于是有人聯(lián)合多個基因進行干預(yù),證明比單一基因干預(yù)更有效。Gunn等用C-myb的反義核酸得出能抑制豬經(jīng)皮冠狀動脈成形術(shù)后的內(nèi)膜增生.VanBelle等在兔股動脈上給予VEGF165質(zhì)粒可以加速內(nèi)皮化,減少附壁血栓和新生內(nèi)膜形成。張鐵民等實驗顯示,反義寡核苷酸與VEGF聯(lián)合應(yīng)用較兩者單用更能顯著預(yù)防再狹窄。
2.載體的種類為了獲得一個好的臨床治療效果，載體的選擇是重要的一步。載體就是將目的基因?qū)胩厥獠课坏墓ぞ撸ǔ７譃椴《据d體和非病毒載體，它們各有自己的優(yōu)缺點。
2.1病毒載體的種類
2.1.1腺病毒載體腺病毒是無包膜的線性雙鏈DNA病毒，目前的腺病毒載體大多以5型（Ad5）、2型（Ad2）為基礎(chǔ)。腺病毒主要優(yōu)點有轉(zhuǎn)染細胞廣泛、攜帶的DNA量大、感染效率高、重組病毒滴度高、不整合到宿主細胞、理化性質(zhì)穩(wěn)定等。以腺病毒介導(dǎo)的基因治療預(yù)防血管狹窄的研究層出不窮。體內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達時間短暫、病毒基因表達的產(chǎn)物引起的毒性反應(yīng)限制腺病毒這個載體的應(yīng)用。正因如此，對腺病毒載體的改進正在進行，如經(jīng)RGD-4C整合素靶向多肽改良后的腺病毒在靜脈橋中有更好的轉(zhuǎn)染能力
2.1.2腺相關(guān)病毒載體（rAAV）rAAV源于非致病的野生型腺相關(guān)病毒，由于其安全性好、宿主細胞范圍廣、免疫源性低，在體內(nèi)表達外源基因時間長等特點，被視為最有前途的基因轉(zhuǎn)移載體之一。
通用的AAV載體都是基于血清型2，即AAV2。因為rAAV感染效率低、制備成本高且只能包裝小于4.7kb的基因序列而在基因治療中受到限制。
2.1.3慢病毒載體慢病毒載體（LVs）是在HIV-1病毒基礎(chǔ)上改造而成的病毒載體系統(tǒng)，它能高效的將目的基因?qū)雱游锖腿说脑毎蚣毎怠Vs具有免疫原性低、整合到細胞上長期表達、可感染非分裂期與分裂期細胞等優(yōu)點.已有研究表明慢病毒載體應(yīng)用于球囊損傷致血管狹窄研究的可行性。但慢病毒仍具有潛在的產(chǎn)生復(fù)制型慢病毒（RCL）和致癌的風險，相關(guān)的研究還是有待加強。
2.2非病毒載體非病毒載體是通過哺乳細胞攝取和細胞間轉(zhuǎn)運大分子物質(zhì)的機制來把目的基因轉(zhuǎn)入靶器官。雖然非病毒載體具有安全、易得、無免疫源性等優(yōu)點，但是他們基本上轉(zhuǎn)染效率不高，因此早期在基因治療研究中沒有太高的地位。隨著技術(shù)的進步，非病毒載體在基因治療載體選擇上占有一定份額，尤其表現(xiàn)在納米粒子、超聲微泡載體上。
2.2.1超聲微泡載體：它的作用原理是通過超聲的物理效應(yīng)使細胞膜上產(chǎn)生可逆的小孔，借助此孔外源性物質(zhì)進入細胞內(nèi)。Taniyama等通過超聲微泡載體將p53的cDNA轉(zhuǎn)入球囊損傷大鼠頸動脈，得出血管內(nèi)膜和中膜面積的比值顯著降低。雖然超聲微泡靶向釋放技術(shù)的靶向性及無創(chuàng)性的優(yōu)點已達到大部分實驗的認可，但其轉(zhuǎn)染效率不高仍是需要大力研究的。
2.2.2納米粒子：它是現(xiàn)在研究比較熱門一種非病毒載體，主要是可以使被包裹的目的基因免受水解酶的降解，將目的基因運載到血管平滑肌上，達到治療疾病的目的。胡新華等通過納米粒子介導(dǎo)的反義雷帕霉素靶蛋白(mTOR)基因抑制移植靜脈內(nèi)膜增生得出納米粒子在血管狹窄治療中是可行的。現(xiàn)在用的納米粒子主要是PLGA，它有很好的組織相容性，產(chǎn)物沒有任何毒性。
3.總結(jié)和展望
這些年來盡管科研及醫(yī)務(wù)工作者在移植靜脈獲取技術(shù)、藥物防治、應(yīng)用血管外支架和放射治療等方面做了大量的工作并在預(yù)防移植靜脈再狹窄上取得一定成效，但是總體效果還是不理想。移植后的靜脈因為內(nèi)皮細胞損傷、炎性細胞浸潤、平滑肌細胞遷移增殖、細胞外基質(zhì)增加等一系列病理改變導(dǎo)致移植靜脈再狹窄。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，安全、高效的載體出現(xiàn)、多基因聯(lián)合等綜合治療必將能有效預(yù)防血管再狹窄。
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基因治療范文4
用于傳遞藥物的磁性納米粒子直徑通常為5-20nm，這些晶體一般是鐵的，最常見的是磁鐵或磁赤鐵。有幾種方法合成這些晶體，最常用的是共沉淀Fe（III）和Fe（II）。磁性納米粒子與被傳遞的基因和藥物混合封裝以促進細胞吸收。用于磁性納米技術(shù)的有聚合物、病毒和非病毒，此外，還有形成這些復(fù)合物的輸水相互作用和靜電作用。由于要靶向體內(nèi)，被處理的納米復(fù)合物通過靜脈注射、動脈注射或腹腔內(nèi)注射，用一個外部磁場（通常用一個小的稀土磁體）附近的目標區(qū)域以創(chuàng)造一個局部磁場。隨著藥物在血液中流動，磁場對帶藥的磁性納米粒子產(chǎn)生作用，驅(qū)動它們分布到目標組織中。與其它傳遞方法相比，磁性納米粒子對藥物的傳遞有許多優(yōu)勢，它顯示出了外部磁場的反應(yīng)，相對安全，用途更廣。磁性納米粒子被批準應(yīng)用于臨床作為磁共振成像的造影劑已有十多年了，因此，是一種能根據(jù)病人安全性來被更好理解的納米技術(shù)。此外，磁性納米粒子與現(xiàn)有藥物具有廣泛的兼容性，能被用于有效傳遞各種各樣的治療藥物。
2使用磁性納米粒子的體內(nèi)基因靶向傳遞
磁性靶向傳遞技術(shù)是1978年被首次提出來的,這種方法類似于藥物傳遞，對治療基因的傳遞有著巨大的潛力，盡管該技術(shù)的應(yīng)用必須適應(yīng)核酸分子的大小和電荷數(shù)。有趣的是，磁性傳遞為解決當前基因治療中的有效傳遞問題提供了很大的可能性。例如，將磁性納米粒子與基因載體混合，治療基因通過外部磁場被選擇性地輸送到腫瘤部位，增加了治療基因的濃度，同時也減少了治療基因在身體其它部位的停留。
2.1局部給藥系統(tǒng)臨床試驗中腫瘤靶向給藥一直是在腫瘤內(nèi)或腫瘤附近注射給藥，磁轉(zhuǎn)染在腫瘤局部給藥中有兩個可能的優(yōu)勢：第一、它能增加注射部位細胞對藥物的吸收和滯留；Bhattarai等人通過直接在空腸和氣管內(nèi)注射的方法向體內(nèi)傳遞經(jīng)過修飾的腺病毒載體表達結(jié)合了磁性納米粒子的LacZ基因，發(fā)現(xiàn)在磁性組中的肺部和空腸內(nèi)β-半乳糖苷酶的活性明顯高于對照組。這表明在外部磁場下基因的滯留和表達都有所增強。雖然這種方法可能不適用于非侵入性腫瘤的治療，但也顯示了磁轉(zhuǎn)染有提高注射基因在腫瘤內(nèi)的滯留效果的可能。在局部傳遞中磁轉(zhuǎn)染的另一個優(yōu)勢就是對腫瘤的穿透性。目前的傳遞方法不能有效的將治療基因傳遞到腫瘤塊的所有區(qū)域，尤其是低氧中心，部分是由于許多腫瘤內(nèi)部有復(fù)雜的脈管系統(tǒng)。另外，這被認為是一個進步，考慮到耐藥性的問題。已證明磁轉(zhuǎn)染粒子的局部傳遞能增加靶組織內(nèi)的基因積累和基因?qū)δ[瘤內(nèi)較小動脈的穿透力。Krotz等人采用靶向提睪肌的股動脈注射帶有熒光標記的寡聚脫氧核苷酸后發(fā)現(xiàn)磁性組的熒光強度增加，此外，在較小動脈內(nèi)有很強的熒光。較小動脈內(nèi)的熒光增強顯示磁靶向能增加基因和藥物的組織滲透性，說明了這種方法可能會增加經(jīng)血液傳遞給腫瘤組織的基因和藥物的滲透力。
2.2全身給藥系統(tǒng)全身給藥系統(tǒng)是研發(fā)新的傳遞技術(shù)的最終目標，因為它能被廣泛的應(yīng)用于各種臨床適應(yīng)癥，也方便治療。此外，小鼠的人類腫瘤移植模型提供了一種在活體內(nèi)測試靶向給藥以及在外部控制磁轉(zhuǎn)染的簡單方法。盡管人類移植腫瘤能提供寶貴的信息，便于深入了解全身給藥系統(tǒng)的效果，但是這些模型可能大大低估了在病人體內(nèi)靶向給藥的復(fù)雜性。迄今，已被驗證的磁轉(zhuǎn)染作為活體內(nèi)癌癥治療最有前途的應(yīng)用是在人類腫瘤移植的小鼠模型中。用磁性納米粒子-脂質(zhì)體復(fù)合物傳遞熒光素酶質(zhì)粒，Namiki等人發(fā)現(xiàn)外部有磁鐵并經(jīng)過納米粒子處理的動物組有很強的熒光素酶活性，傳遞相同劑量基因的其他的對照組卻沒有明顯的表達。這個結(jié)果在腫瘤組織勻漿中的二次試驗得到證實，那個實驗是用siRNA干擾磁性組中的EGF受體，而在非磁性組中沒用siRNA。與有外部磁鐵靶向的控制組相比，對照組中腫瘤塊EGF受體的siRNA傳遞減少了50%。還有一項研究也顯示了不同的納米復(fù)合物組分與療效之間的差異。相比于之前使用的磁性復(fù)合物，新配方在非目標器官中siRNA的積累量減少10倍，提出增加配方的選擇性可以提高對器官的靶向性。這可能是由于新配方的尺寸較小的緣故。總之，這些結(jié)果都是磁轉(zhuǎn)染具有明確療效強有力的證據(jù)，除了用傳遞報告基因來證實外。單核細胞由于其具有與腫瘤細胞天然的親和力，也被用來作為癌癥治療的基因載體。一種方法是先將單核細胞在體外轉(zhuǎn)染，再經(jīng)過血液注射將治療基因傳遞到腫瘤組織。這種方法雖然避免了非內(nèi)源性載體引起的組織毒性，但問題一直是沒有靶向足夠數(shù)目的腫瘤細胞。Muthana等人最新的研究檢查了傳遞磁性納米粒子基因的單核細胞在腫瘤組織中的生長能力。作者發(fā)現(xiàn)磁性組中16.9±4.2%的腫瘤細胞表達GFP，而在非磁性組中腫瘤細胞GFP的表達大量增加，增量超過4.9±3.5%。沒有數(shù)據(jù)顯示這是否會導(dǎo)致單核細胞在肝臟中的減少，這項研究也沒有顯示任何治療效果，它傳遞的是一個標志基因，它證明了磁性納米粒子能被用于改善細胞作為基因載體的功能。
3小結(jié)與展望
基因治療范文5
1基因治療的途徑和常用載體
基因治療技術(shù)，一種新的治療策略在口腔再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用發(fā)展迅速。基因治療通常采用兩種途徑，體外間接基因治療(ex vivo)和體內(nèi)直接基因治療(in vivo) [3,6]。無論間接還是直接基因轉(zhuǎn)移都需要借助載體才能將外源基因轉(zhuǎn)入靶細胞內(nèi)。目前載體系統(tǒng)主要分為病毒和非病毒兩種[3]，常用的病毒載體有腺病毒（AV），腺相關(guān)病毒（AAV），逆轉(zhuǎn)錄病毒（RV，包括慢病毒載體），單純皰疹病毒（HSV），雜合病毒等[7-9]。非病毒性載體有裸DNA、脂質(zhì)體與脂質(zhì)體復(fù)合物、納米顆粒等[3]。
2基因治療在口腔再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用
2.1 頜面骨組織再生：用于治療頜骨缺損的靶基因很多，作用機制和環(huán)節(jié)不盡相同，目前的研究主要集中于骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)基因。Park等[10]應(yīng)用脂質(zhì)體和腺病毒載體分別將BMP-2基因?qū)氪笫蠊撬杌|(zhì)細胞(BMSC，bone marrow stromal cells)，比較了兩種載體的體外、體內(nèi)成骨能力。體外實驗結(jié)果顯示腺病毒組的轉(zhuǎn)染效率是脂質(zhì)體組的兩倍。當將基因修飾細胞復(fù)合明膠海綿植入大鼠下頜骨的骨缺損區(qū)，BMP-2可以在體內(nèi)表達2 周以上，促進了下頜骨骨缺損的修復(fù)，其中腺病毒組4周后骨缺損幾乎完全愈合，而脂質(zhì)體組相對新骨形成速度較慢，6周后骨缺損基本愈合，陰性對照組8周時仍未見骨愈合。Zhao等[11]用腺病毒介導(dǎo)的BMP-2轉(zhuǎn)染BMSC細胞，結(jié)合磷酸三鈣支架材料可以修復(fù)下頜骨的缺損，獲得礦化密度較高的新生骨。Chang等[12]應(yīng)用腺病毒載體攜帶BMP-2，體外修飾BMSC，并植入小型豬的上頜骨缺損區(qū)，實驗組的骨缺損在3個月后完全修復(fù)，組織學(xué)觀察顯示新生骨為成熟的編織骨且鈣化良好。近期，Ke等[8]應(yīng)用安全性較好的AAV病毒載體介導(dǎo)BMP-2體外修飾BMSC，并將其植入兔子的上頜骨缺損，頜骨缺損的修復(fù)能力顯著提高。Ashinoff等[13]研究通過腺病毒介導(dǎo)的BMP-2 對大鼠下頜骨牽張成骨的影響。實驗結(jié)果表明，實驗組在牽張成骨部位新骨形成量顯著增加。
BMP基因治療在促進頜骨組織再生中的應(yīng)用非常廣泛，近來也有一些研究報道了其他治療基因的應(yīng)用，例如堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor， bFGF），音波刺猬因子（sonic hedgehog，SHH）等。Jiang等[14]將腺病毒介導(dǎo)的bFGF基因修飾的骨髓基質(zhì)干細胞移植入兔子下頜骨牽張成骨區(qū)域，可以有效地促進更多的新骨形成。Edward等[15]將逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的Shh修飾的三種細胞(牙齦纖維細胞、間充質(zhì)干細胞、脂肪來源細胞)復(fù)合I型膠原植入兔的顱骨缺損處，6周后通過X線片、組織學(xué)觀察，骨組織缺損區(qū)域幾乎完全修復(fù)，同時機體沒有出現(xiàn)任何不良反應(yīng)。
頜骨的生長調(diào)控需要多因子的協(xié)同作用，多個治療基因的聯(lián)合應(yīng)用也取得了一定進展。Koh等[16]的研究證實通過基因治療的同時表達兩種成骨因子BMP2和BMP7，表現(xiàn)出了更強的骨組織再生能力。通過X線片，Micro CT和組織學(xué)切片進行檢測，4周后 BMP2和BMP7的聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染組，其成骨能力顯著高于單個基因轉(zhuǎn)染組，表現(xiàn)為顱骨缺損區(qū)域幾乎完全修復(fù)，甚至個別缺損區(qū)的成骨量更致密，顯著高于陰性對照組。另外，將促血管生成因子與成骨因子聯(lián)合應(yīng)用，可以更好地協(xié)同促進頜骨組織再生。Peng等[17]的研究表明單獨應(yīng)用VEGF并不能促進骨的再生，但是將VEGF和BMP4基因共同修飾MDSC，并與明膠海綿共同植入小鼠的顱骨缺損區(qū)域后，血管新生和新骨形成能力顯著增強。
2.2 顳下頜關(guān)節(jié)組織再生：顳下頜關(guān)節(jié)的組織工程需要促進功能性骨和軟骨組織再生，并需要建立適當?shù)墓?軟骨交界區(qū)。 Schek等[18-19]將分化的豬軟骨細胞和Ad.BMP7基因修飾的人牙齦纖維細胞復(fù)合到生物支架中，并將復(fù)合物移植到免疫缺陷小鼠的皮下，4周后構(gòu)建了一種骨-軟骨組織，包括血管化骨，成熟的軟骨以及清晰的礦化界面。另一項研究進展是將基因直接導(dǎo)入下頜髁突，1999年，Kuboki等[20]用腺病毒載體攜帶B-半乳糖苷酶基因直接體內(nèi)法注射到豚鼠顳下頜關(guān)節(jié)上腔，4周后發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)軟骨表面和滑膜均有B-半乳糖苷酶的穩(wěn)定表達，從而證明了腺病毒介導(dǎo)基因治療顳下頜關(guān)節(jié)疾病的可行性。Rabie等[21] 用AAV病毒載體介導(dǎo)了治療基因VEGF感染了大鼠的髁突組織，體內(nèi)試驗證明VEGF的表達增強，促進了下頜髁突的軟骨內(nèi)成骨進程。Li等[22]用AAV病毒載體攜帶Vastatin基因，局部注射到顳下頜關(guān)節(jié)后區(qū)，進一步證明轉(zhuǎn)基因不僅表達在髁突軟骨，而且在關(guān)節(jié)盤和關(guān)節(jié)窩都有持續(xù)的表達。這些研究為生理性骨-軟骨結(jié)構(gòu)的構(gòu)建以及TMJ局部基因治療的應(yīng)用前景提供了實驗依據(jù)。
2.3 牙周組織再生：牙周病造成牙周支持組織破壞及牙周附著喪失，是導(dǎo)致牙齒缺失的最主要原因。牙周病治療的目的不僅在于控制炎癥，更在于使已經(jīng)破壞的牙周組織再生以形成新附著。牙周組織再生包括因炎癥破壞吸收的硬組織(牙槽骨與牙骨質(zhì))和軟組織(牙周膜與牙齦)。Jin等[23]將攜帶血小板衍生生長因子-B（plateletderived growth factor-B，PDGF-B）的腺病毒直接注射于牙周缺損處，結(jié)果顯示，病毒感染組牙槽骨的修復(fù)4倍于對照組，而牙骨質(zhì)的修復(fù)則6倍于對照組，提示應(yīng)用PDGF- B 基因治療可以促進牙周的修復(fù)潛能。Chang等[24]的進一步研究證實在牙周骨缺損處直接局部注射腺病毒介導(dǎo)的PDGF-B 是安全可靠的，沒有發(fā)現(xiàn)治療引起的機體不良反應(yīng)。盡管2周內(nèi)在缺損局部可以檢測到病毒載體的DNA, 隨著時間的推移病毒載體的量逐漸衰減。可見PDGF-B基因轉(zhuǎn)染可有效地促進細胞增殖和缺損的充填，證實了基因轉(zhuǎn)入牙周細胞可以為牙周再生提供一個便捷的途徑。
2.4 牙體組織再生：牙再生的研究是口腔再生醫(yī)學(xué)研究中最為活躍的領(lǐng)域。Rutherford等[25]采用了體外間接基因轉(zhuǎn)染方式，將攜帶BMP-7的腺病毒載體感染培養(yǎng)的成體纖維細胞，然后將修飾后的細胞與膠原復(fù)合植入白鼬炎性牙髓組織中，研究發(fā)現(xiàn)BMP-7的基因轉(zhuǎn)染促進了修復(fù)性牙本質(zhì)的形成。Nakashima等[26-27]用電穿孔（Electroporation）的方法將分化因子（Gdf1）轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的小鼠牙髓細胞中可以在體外促進其向成牙本質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化。Nakashima等[28]又用超聲波的方法轉(zhuǎn)染Gdf1，發(fā)現(xiàn)它還可以促進犬的自體牙髓干細胞分化為成牙本質(zhì)細胞，同時在犬的模型上修復(fù)性牙本質(zhì)的形成增加，其中管狀牙本質(zhì)的再生最為明顯。可見，通過轉(zhuǎn)染特異性基因和生長因子進入成體牙細胞，為促進組織工程牙的形態(tài)發(fā)生提供了新的思路。
3基因治療的前景展望
成功的基因治療必須包括選擇適當?shù)闹委熁颉⑦m當?shù)霓D(zhuǎn)導(dǎo)，使其在體內(nèi)獲得安全、持續(xù)和可調(diào)控的表達。口腔再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的基因治療，雖然在動物試驗上取得了一些初步經(jīng)驗，但是離真正的臨床推廣應(yīng)用還有相當長的一段距離。將來的研究將著眼于以下幾個方面：①對于目的基因，仍需進一步明確何種基因或多種基因的聯(lián)合應(yīng)用；②選擇與構(gòu)建一個安全、高效、可調(diào)控的甚至是具有組織特異性的靶向基因載體仍是基因治療面臨的重要問題；③在基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法上仍需決定最佳基因載體或者靶細胞的數(shù)量、最佳轉(zhuǎn)入體內(nèi)的時機，以及減少不良反應(yīng)以達到最佳治療效果。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)日趨成熟和基因工程研究的深入，相信這些問題在不遠的將來都會得到解決。
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基因治療范文6
椎間盤退變性疾病(disc degeneration disease，DDD)是一種發(fā)病率及致殘率極高的疾病，常引起以頸肩腰腿疼痛為主要表現(xiàn)的臨床癥候群，據(jù)資料表明，DDD患者占美國骨科住院人數(shù)的1/3以上，目前對DDD的常規(guī)治療方法包括藥物治療、理療、臥床休息、類固醇注射封閉以及手術(shù)治療等。但是，這些措施僅能夠改善疾病的臨床癥狀，并不能從根本上減緩或終止退變的進程。因此，進一步研究椎間盤退變的發(fā)生機制，試圖從分子水平上對椎間盤退變進行調(diào)控，從而對椎間盤退變進行治療是非常有價值的。以往對DDD發(fā)生機制的研究主要集中在椎間盤的生物力學(xué)改變、椎間盤的自身免疫因素、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡失衡及椎間盤的營養(yǎng)障礙等幾方面。近期的研究顯示，Sox家族的Sox9基因很可能與椎間盤退變有著密切的關(guān)系，現(xiàn)將其相關(guān)研究情況作一綜述。
1椎間盤退變與膠原改變
椎間盤內(nèi)含有大量的膠原，其中Ⅰ、Ⅱ型膠原是最主要的膠原，約占總量的80%，其次是Ⅵ型膠原，占10%~20%。在正常情況下，Ⅰ型膠原主要存在于外層纖維環(huán)，Ⅱ型膠原則主要分布在髓核和軟骨終板。Ⅱ型膠原，在椎間盤中央含量最高，到邊緣則逐漸減少，而Ⅰ型膠原則剛好相反。而且膠原在椎間盤內(nèi)的分布情況并不隨年齡的增長而改變。但是，隨著椎間盤的退變，膠原的構(gòu)成情況卻發(fā)生了變化。在退變的早期，正常類型的膠原在它們的分布范圍有增加的趨勢，提示在退變早期椎間盤存在一過性修復(fù)反應(yīng)，這一點已經(jīng)在核中軟骨細胞的Ⅱ型膠原mRNA增強表達得到證實［1］。髓核中，Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅵ型膠原含量也有增加，Ⅰ型膠原在纖維環(huán)中也呈增加趨勢。隨退變程度的加重，膠原的性質(zhì)發(fā)生了改變，Ⅰ型膠原開始出現(xiàn)在髓核中，軟骨終板喪失了Ⅱ型膠原的表達。Ⅳ型和Ⅹ型膠原也在髓核中出現(xiàn)，膠原成分的改變說明髓核內(nèi)軟骨樣細胞表型發(fā)生變化，可能失去了軟骨特征而出現(xiàn)骨化現(xiàn)象。最后，膠原的翻譯后修飾出現(xiàn)非酶糖化或脂質(zhì)過氧化作用，交聯(lián)增加。以上種種變化最終導(dǎo)致椎間盤細胞外環(huán)境的破壞，椎間盤的彈性和膨脹時的抵抗力減弱，這種改變極難自行修復(fù)。
2Sox家族及Sox9基因
1990年，Berta等［2］在人類和小鼠中克隆了決定因子SRY基因，人們發(fā)現(xiàn)SRY基因產(chǎn)物含有的一個保守區(qū)與一種染色體蛋白HMG-1和HMG-2中的DNA結(jié)合基序非常相似。HMG框是一個長約79個氨基酸的DNA結(jié)合基序，根據(jù)該HMG框的保守性，由此命名了編碼一類新的轉(zhuǎn)錄因子的基因家族，稱為Sox家族，該家族特點為其所編碼的蛋白質(zhì)與HMG框有60%同源性。2000年，Girard等［3］人利用已經(jīng)克隆的Sox基因全長序列和大量的完整的HMG基序?qū)ox基因家族的分類進行了詳細的研究，他們提出Sox基因家族可以分為A~J十個亞族。同一亞族內(nèi)不同基因間在HMG基序內(nèi)的相似性在80%以上；不同亞族間的相似性就低于這個數(shù)字。另外，同一亞族中同一Sox基因在脊椎動物中不僅在HMG基序區(qū)存在同源性而且在其他區(qū)也存在較大的相似民生。在哺乳動物發(fā)育過程中，Sox基因在廣泛范圍內(nèi)表達。Sox1，Sox2，Sox3，Sox9和Sox11在神經(jīng)組織中主同水平表達；Sox9在軟骨組織中和性腺中表達；Sox2亦在雞胚胎的晶狀體和腸的表皮細胞中表達。
Sox9基因是Sox基因家族成員之一，1994年，Zanaria等［4］克隆了Sox9基因，發(fā)現(xiàn)它與SRY的HMG框區(qū)域的同源性大于60%，基因定位于染色體17q24Ⅱ~25Ⅰ區(qū)段內(nèi)，在男性的發(fā)育中與SRY基因相同，作為轉(zhuǎn)錄因子而調(diào)控其下游基因的表達。SRY基因并不是直接調(diào)節(jié)的發(fā)育而是通過Sox9共同作用才發(fā)生作用。Foster等［5］將從三個獨立文庫中分離得到的cDNA克隆序列組裝出Sox9的復(fù)合轉(zhuǎn)錄單位，其長度為3934 bp，Sox9基因具有一個開放閱讀框架（ORF），該框架能夠編碼509個氨基酸，其中104~182位的79個氨基酸殘基編碼HMG盒，與SRY基因的HMG盒編碼序列同源性高達71%；除此之外，在其所編碼的Sox9蛋白C端約1/3處有一富含脯氨酸、谷氨酰胺和絲氨酸的區(qū)域，該區(qū)域類似于某些轉(zhuǎn)達錄因子的反式激活域（transactivation/transcription activation domain，TA域），這一非酸性區(qū)域在進化上相當保守，很可能Sox9蛋白因含有HMG盒樣DNA結(jié)合基序及該TA域而具有轉(zhuǎn)錄因子活性。
3Sox9基因與椎間盤退變
椎間盤的退變與其內(nèi)部的細胞外基質(zhì)的改變有密切的聯(lián)系。椎間盤的細胞外基質(zhì)主要由抵抗張力的膠原和抵抗壓力的蛋白多糖共同組成，而細胞外基質(zhì)的穩(wěn)定是椎間盤結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)。因此椎間盤內(nèi)膠原變化，包括膠原的成分和構(gòu)象改變必將影響椎間盤的生物學(xué)性質(zhì)，并且更易造成椎間盤退變［6、7］。Nerlich［8］和Ahsan等［9］的研究發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增加，椎間盤髓核中膠原的類型發(fā)生變化，最初為Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ型膠原的增加，隨后為Ⅱ型膠原的喪失；椎間盤內(nèi)蛋白聚糖含量逐漸下降，呈聚集狀態(tài)的蛋白聚糖下降尤為明顯，非聚集蛋白聚糖比例相對增加，這種變化在髓核更為顯著。同時，伴隨蛋白聚糖的下降，含水量明顯降低。Oegema等［10］發(fā)現(xiàn)，間盤退變后，椎間盤細胞產(chǎn)生的基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallporoteinases，MMPs）增多，抑制了基質(zhì)合成。其它的研究結(jié)果還顯示［11］，椎間盤的退變過程是由于細胞因子的減少和致炎因子的增多，導(dǎo)致MMPs活性增加，椎間盤軟骨樣細胞分泌蛋白聚糖和Ⅰ、Ⅱ型膠原能力下降、降解加速。進而使椎間盤軟骨樣細胞賴以生存的細胞外環(huán)境被破壞，髓核內(nèi)水分喪失，不能維持椎間盤內(nèi)應(yīng)有的張力，加劇細胞退變，并且這種改變很難自行修復(fù)。有資料顯示Sox9、Ⅱ型膠原、aggrecan是最主要的三種軟骨細胞因子［12~14］，并且Sox9被當作Ⅱ型膠原mRNA轉(zhuǎn)錄中的正向操縱了［15~17］；Sive等［18］用原位雜交方法分析了正常與退變椎間盤內(nèi)Sox9、Ⅱ型膠原和蛋白多糖三種軟骨因子的表達狀況，發(fā)現(xiàn)在退變的椎間盤的髓核與纖維環(huán)中Sox9與Ⅱ型膠原mRNA的表達明顯降低。通過免疫定位分析方法發(fā)現(xiàn)椎間盤纖維環(huán)組織中Sox9的表達水平與年齡呈反比［19］。Paul等［20］在體外實驗中發(fā)現(xiàn)Sox9腺病毒載體能夠增加細胞內(nèi)Sox9與Ⅱ型膠原的表達。同時在纖維環(huán)穿刺法制備的兔椎間盤退變的病理模型中注射重組腺病毒載體，發(fā)現(xiàn)注射Sox9腺病毒的椎間盤與注射病毒對照組相比仍能維持更好的軟骨細胞表型。有學(xué)者更進一步的對不同時期椎間盤（包括新生兒椎間盤，正常椎間盤，退變各個時期椎間盤）應(yīng)用RT-PCR、Westernblot和免疫組化方法檢測髓核中Sox9、Ⅱ型膠原基因的表達，并分析兩者的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)Sox9 mRNA在椎間盤髓核細胞中的表達從新生兒到嚴重的椎間盤退變的病人逐漸降低，且它在人的椎間盤退變過程中也有表達，從新生兒到嚴重退變的椎間盤細胞中，Ⅱ型膠原下降的幅度與Sox9降低的幅度基本一致，這表明椎間盤退變的發(fā)生一定與Sox9的表達降低有關(guān)系，Sox9在正向調(diào)控Ⅱ型膠原的合成方面發(fā)揮了重要的作用。另外，1993年，Tommerup等［21］通過對染色體易位斷裂點定位作圖，提出17號染色體短民Sox9如果發(fā)生突變，就可以導(dǎo)致軀干發(fā)育異常（campomelic dysplasia，CD）。CD是一種罕見的可致死先天性軟骨骼發(fā)育異常綜合征（國外報道發(fā)病率為05~1/10萬），其典型病狀是先天弓形和長骨扭曲，常合并四肢骨骼異常如先天性脊柱裂、多趾畸形和軟骨形成障礙，患者常因呼吸衰竭而死于出生后的第一個月內(nèi)，因為疾病的嚴重程度不一，極少數(shù)病人能活到成年。Lefebrve等［22］亦推測在CD患者中Sox9基因活性的降低將抑制Ⅱ型膠原的產(chǎn)生而導(dǎo)致嚴重的骨骼發(fā)育障礙。昆士蘭大學(xué)的Wright等認為小鼠中的一種“短尾突變”實際上代表一種潛在的CD模式，Sox9是“短尾”鼠中有缺陷的基因，雖然不表現(xiàn)性反轉(zhuǎn)，但這些小鼠應(yīng)當也還有一系列其它骨骼發(fā)育上的異常。目前可引起椎間盤退變的各種因素恰恰也是可以誘發(fā)Sox9基因突變的因素，因此我們有理由懷疑，在椎間盤退變過程中，很可能也象“短尾突變”或“CD”一樣，存在Sox9基因的突變。或者即使沒有Sox9基因編碼序列上的突變，也可能存在調(diào)控方面的缺陷。這些都十分值得我們進行更深入的研究探索。
4Sox9對Ⅱ型膠原的調(diào)控機制
雖然，當前已經(jīng)確認Sox9是Ⅱ型膠原合成過程中的一個重要的轉(zhuǎn)錄因子，且其在軟骨的發(fā)育、成熟過程中對Ⅱ型膠原的正向調(diào)控作用已十分明確，但其中確切的調(diào)控機制是什么呢？亦即Sox9是通過什么機制正向調(diào)控二型膠原蛋白表達呢？Lefebvre V等［22］在研究中發(fā)現(xiàn)，Ⅱ型膠原基因（Co12al）的內(nèi)含子Ⅰ中一個最小的DNA元件引起了轉(zhuǎn)基因小鼠中軟骨特異性細胞的表達，并發(fā)現(xiàn)該元件在瞬時細胞轉(zhuǎn)染實驗中也是一個軟骨細胞特異性的強增強子。Co12al的表達與軟骨細胞中所表達的高水平Sox9 RNA和Sox9蛋白密切相關(guān)，實驗證實這個最小的Co12al增強子是Sox9作用的靶序列，Sox9直接結(jié)合到這個最小的Co12al增強子的一段序列上并將該軟骨細胞增強子激活，共轉(zhuǎn)染實驗中發(fā)現(xiàn)，在非軟骨細胞中，Sox9也是作為一個有效地增強子激活劑而發(fā)揮作用。Lefebvre V設(shè)計出該增強子的突變體，使其不能與Sox9相結(jié)合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)軟骨細胞中增強子的活性消失，共轉(zhuǎn)染的非軟骨細胞中由Sox9引起的增強子的激活亦受到抑制。Lefebvre V將Sox9蛋白截短，去除其反式激活域（transactivation domain，TA域）部分但保留其與DNA結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)與全長的Sox9蛋白相比，增強子的活性受到了明顯的抑制。以上試驗結(jié)果強烈的表明Sox9參與了軟骨細胞中Co12al的細胞特異性激活作用以及Ⅱ型膠原合成的調(diào)控，且其調(diào)控機制是通過Sox9蛋白的DNA結(jié)合域與Co12al增強子直接結(jié)合而發(fā)揮作用，而Sox家族的其他成員對該增強子并無激活作用。除了與DNA直接結(jié)合，Sox9是否還通過其他的方式（如信號通路等）調(diào)控Ⅱ型膠原的表達呢？目前并無相關(guān)報道。
總之，椎間盤退變的基因治療正處于早期的實驗階段，對Sox9基因在椎間盤退變中作用和機制的研究亦剛剛展開。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和對椎間盤退變的生物學(xué)機理研究的不斷深入，相信Sox9基因終將廣泛應(yīng)用到椎間盤退變的臨床治療中。
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