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淋巴細(xì)胞范文1

【關(guān)鍵詞】 黃芪注射液 銀屑病 Th細(xì)胞亞群 IFNγ IL4

Effects of Astragulus injection on Th cell subset function in patients with psoriasis in vitro

Abstract Objective：To study the effects of Astragulus injection on Th cell subset function in patients with psoriasis.Methods：The peripheral blood lymphocytes from 20 patients with psoriasis at the remission stage were stimulated with either phytohem agalutinin(PHA)(patientcontrol group)or PHA together with Astragulus(patientAstragulus group)and were then cultured in vitro for 48 hours.The samples from 10 healthy people stimulated with PHA were used as the normal control group.The levels of interferonγ(IFNγ) and interleuikin4(IL4) in the super

〔1〕本課題為山西省青年科技研究基金資助項(xiàng)目(課題編號(hào)：20011030)。

natants of lymphocytes were detected using ELISA.Results：The IFNγlevel in the patientcontrol group were statistically higher than those in the control group(P＜0.05).But the IL4 lever were lower than those(P＜0.05).The level of IFNγin the patientAstragulus group were markedly lower than those in the patientcontrol group(P＜0.05).But the IL4 level were higher than those(P＜0.05).Conclusion：Astragulus injection can lower the Th1 cell subset and promote disverting to Th2 cell subset，therefor shows an importont significance in treating psoriasis.

Key words Astragulus injection；psoriasis；Th cell subsets；IFNγ；IL4

銀屑病是一種在遺傳基礎(chǔ)上與多種因素相互作用的慢性炎癥性疾病，目前許多學(xué)者傾向于將銀屑病歸于自身免疫性疾病，其發(fā)病與機(jī)體T細(xì)胞亞群免疫失衡密切相關(guān)，認(rèn)為其發(fā)病初期表現(xiàn)為外周血T細(xì)胞過(guò)度活化［1］，是Th1介導(dǎo)的細(xì)胞免疫疾病。中藥黃芪對(duì)細(xì)胞免疫、體液免疫、非特異性免疫功能及細(xì)胞因子均有調(diào)節(jié)作用，實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，黃芪可調(diào)節(jié)變應(yīng)性鼻炎、肺癌［2］、糖尿病［3］、過(guò)敏性紫癜等疾病的T細(xì)胞亞群失衡狀態(tài)。本研究通過(guò)體外檢測(cè)黃芪注射液對(duì)兩種主要細(xì)胞因子水平的影響，以探討黃芪注射液對(duì)銀屑病患者輔助T淋巴細(xì)胞亞群功能狀態(tài)的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2007年11月—2008年5月門(mén)診及住院的進(jìn)行期尋常型銀屑病患者20 例，男14 例，女6 例，年齡17～65 歲，病程0.5～13年，所有病例均已除外自身免疫性疾病和其他系統(tǒng)性疾病，就診前1個(gè)月未內(nèi)用及外用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等影響全身免疫功能的藥物。對(duì)照組為10 例與病例組性別、年齡相匹配的健康志愿者，男5 例，女5 例，年齡25～56 歲。

1.2 主要試劑與儀器

淋巴細(xì)胞分層液(上海試劑二廠(chǎng)產(chǎn)品)，RPMI1640凍干粉(美國(guó)Gibco公司)，新生小牛血清(美國(guó)Gibco公司)，植物血凝素(PHA—P)凍干粉(美國(guó)Sigma公司)，黃芪注射液(每支10 mL相當(dāng)于原藥材20 g，正大青春寶公司)，人IFNγ、IL4定量ELISA試劑盒(北京邦定生物醫(yī)學(xué)公司)，自動(dòng)化板式酶標(biāo)儀(ZS—CF 5000型中國(guó)航天工業(yè)總公司)，水平式離心機(jī)(LDZ5－2型北京醫(yī)用離心機(jī)廠(chǎng))，倒置顯微鏡(Olympus公司)，CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Asheville NC)。

1.3 方法

1.3.1 淋巴細(xì)胞分離與培養(yǎng)

分別取三組外周靜脈血10 mL，肝素抗凝對(duì)倍稀釋后，以2∶1比例輕輕加入淋巴細(xì)胞分離液上，以2 000 r/min，離心15 min，吸取單個(gè)核細(xì)胞層，經(jīng)吸附法獲得淋巴細(xì)胞，Hank′s液洗滌2次，將洗好的細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)液配成2×107/mL的細(xì)胞懸液，取健康人上述細(xì)胞懸液200 μL加入1.8 mL含10％胎牛血清的RPMl1640培養(yǎng)液中，植入無(wú)菌培養(yǎng)板，設(shè)為正常對(duì)照組；取患者上述細(xì)胞懸液400 μL，均分2份，各200 μL如上加入1.8 mL含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，植入無(wú)菌培養(yǎng)板，1份設(shè)為病例未加藥組；另1份加入黃芪注射液，終濃度為1 mg/mL，設(shè)為病例黃芪組。以上各組中均加入PHA體外誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞，終濃度5 mg/mL。將培養(yǎng)板置37℃，含5％CO2的孵育箱中，用倒置顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，培養(yǎng)48 h，收集培養(yǎng)上清液500 μL，－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 細(xì)胞因子檢測(cè)

培養(yǎng)上清液中IFNγ與IL4水平采用雙抗體夾心法定量ELISA試劑盒檢測(cè)，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，最后在自動(dòng)化CF5000板酶標(biāo)上測(cè)定OD492值(此型酶標(biāo)儀可直接報(bào)告標(biāo)本的濃度值)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，所測(cè)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用±s表示，組間差異用t檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)

果

2.1 病例對(duì)照組和正常對(duì)照組IFNγ與IL4比較(見(jiàn)表1)

病例對(duì)照組與正常對(duì)照組相比，IFNγ明顯升高(P＜0.05)，IL4明顯降低(P＜0.05)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示銀屑病患者Th1細(xì)胞亞群呈優(yōu)勢(shì)狀態(tài)，Th1/Th2失衡。

2.2 病例黃芪組和病例對(duì)照組IFNY與IL4比較(見(jiàn)表1)

經(jīng)黃芪注射液刺激后，病例黃芪組IFNγ水平明顯低于病例對(duì)照組P＜0.05，而IL4水平明顯高于病例對(duì)照組(P＜0.05)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表1 3組T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液IFNγ、IL4水平比較

3 討

論

CD4陽(yáng)性T輔助淋巴細(xì)胞(簡(jiǎn)稱(chēng)Th)為一多功能細(xì)胞群體，在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)中具有雙重作用，對(duì)免疫反應(yīng)的啟動(dòng)、最終表現(xiàn)形式和強(qiáng)弱起著關(guān)鍵作用。根據(jù)細(xì)胞因子分泌模式，CD4＋T細(xì)胞可分為T(mén)h1和Th2亞群，它們來(lái)自一個(gè)共同的前體細(xì)胞Th0，Th1和Th2是由Th0發(fā)育而來(lái)的兩種極化形式，Th1/Th2漂移需中間形式Th0的過(guò)渡。Th1細(xì)胞主要與細(xì)胞免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)，Th2細(xì)胞主要與體液免疫有關(guān)，二者同時(shí)還有相互抑制的作用。Th1細(xì)胞可分泌IL2、TNFα、IFNγ等，其中最主要的細(xì)胞因子是IFNγ，IFNγ可以活化巨噬細(xì)胞，刺激吞噬活性增強(qiáng)，是銀屑病病理生理學(xué)變化過(guò)程中重要病因之一。Th2細(xì)胞主要分泌IL4、IL10等，可抑制巨噬細(xì)胞的活化，從而抑制Th1細(xì)胞，對(duì)自身免疫性疾病有很強(qiáng)的保護(hù)作用［4］。IL4是促進(jìn)Th0向Th2分化的主要因素，它主要通過(guò)活化STAT6蛋白促進(jìn)Th2分化，STAT6基因敲除的小鼠則Th2細(xì)胞分化受損［5］，由此可見(jiàn)，在Th1/Th2平衡中，IFNγ主要促進(jìn)Th1的分泌，IL4主要促進(jìn)Th2的分化。故本研究選擇IFNγ、IL4作為檢測(cè)指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)Th1與Th2功能狀態(tài)。

正常機(jī)體內(nèi)，Th1/Th2維持著動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)Th1/Th2失調(diào)時(shí)，則表現(xiàn)為T(mén)h1或Th2細(xì)胞中某一亞群功能增強(qiáng)，另一亞群功能減弱，可導(dǎo)致腫瘤、感染、自身免疫性疾病及移植排斥反應(yīng)。一般而言，Th1反應(yīng)過(guò)度活化可導(dǎo)致器官特異性自身免疫性疾病，如1型糖尿病、自身免疫性甲狀腺炎、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等；Th2反應(yīng)過(guò)度活化可導(dǎo)致器官非特異性自身免疫性疾病，如變態(tài)反應(yīng)性疾病(哮喘、過(guò)敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎)、抗體介導(dǎo)的免疫性疾病(SLE、腎炎、過(guò)敏性紫癜)。Austin等［6］從銀屑病患者皮損中分離出T細(xì)胞，在體外給予刺激，使其分化、增殖并表達(dá)細(xì)胞因子，發(fā)現(xiàn)了Th1細(xì)胞分化偏態(tài)性。本研究結(jié)果顯示，病例對(duì)照組中IFNγ水平較正常對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)，IL4水平明顯低于正常對(duì)照組(P＜0.05)，呈現(xiàn)Th1類(lèi)細(xì)胞因子優(yōu)勢(shì)狀態(tài)，這與國(guó)外報(bào)道一致。IFNγ是角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)的促有絲分裂原，且抑制IL10的表達(dá)。給予系統(tǒng)性IFNγ和升高IFNγ的藥物如鋰制劑能誘導(dǎo)或加劇銀屑病［7］。IFNγ在正常情況下有抗增殖作用，但在銀屑病中，已證明KC對(duì)IFNγ改變了反應(yīng)性，表現(xiàn)為對(duì)IFNγ的生長(zhǎng)抑制不敏感，反而可提高KC的增殖反應(yīng)，阻礙KC的分化。可見(jiàn)銀屑病患者表皮細(xì)胞增殖與IFNγ過(guò)多表達(dá)有關(guān)。

黃芪為常用中藥，又名獨(dú)根、二人抬，來(lái)源于豆科植物蒙古黃芪和膜莢黃芪的干燥根。其性溫和、味甘，具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用，在變應(yīng)性鼻炎、肺癌、過(guò)敏性紫癜、1型糖尿病等疾病的研究中已證實(shí)黃芪可調(diào)節(jié)其Th1/Th2的不平衡狀態(tài)，且黃芪的免疫調(diào)節(jié)作用具有雙向性，其作用很大程度上取決于機(jī)體的免疫狀態(tài)，有利于調(diào)整機(jī)體的免疫失衡狀態(tài)［8］。近年來(lái)，應(yīng)用中藥黃芪治療銀屑病已被眾多基礎(chǔ)及臨床研究證明有效［9］。吳凡等［10］用黃芪注射液灌飼病毒性心肌炎小鼠2周后發(fā)現(xiàn)，小鼠心臟組織中IL2和TNFα的mRNA表達(dá)下降，IL10mRNA表達(dá)則升高，表明黃芪可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子在心臟組織的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮其治療作用。本研究結(jié)果顯示(病例黃芪組)黃芪注射液與銀屑病患者外周血淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)后，IL4水平明顯高于病例對(duì)照組(P＜0.05)，而IFNγ水平低于病例對(duì)照組(P＜0.05)，提示黃芪可下調(diào)銀屑病患者病理性Th1優(yōu)勢(shì)狀態(tài)，促進(jìn)向Th2優(yōu)勢(shì)狀態(tài)轉(zhuǎn)換，上調(diào)IL4表達(dá)水平，抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)，促進(jìn)其在自身免疫反應(yīng)中的免疫保護(hù)作用，逆轉(zhuǎn)Th1/Th2失衡狀態(tài)，這可為黃芪注射液臨床治療銀屑病提供一定的理論依據(jù)。

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淋巴細(xì)胞范文2

【摘要】 目的： 探討不同時(shí)期人胎腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞凋亡。方法： 收集人胎35例，采用常規(guī)組織學(xué)HE染色、免疫組織化學(xué)細(xì)胞凋亡（TUNEL法）染色和細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行研究。結(jié)果： 9周，人胎腸系膜淋巴結(jié)原基內(nèi)未見(jiàn)凋亡的淋巴細(xì)胞。11~12周，有極少量淋巴細(xì)胞凋亡，13~32周，各胎齡段均有淋巴細(xì)胞凋亡。凋亡的淋巴細(xì)胞呈單個(gè)分布且多被巨噬細(xì)胞所吞噬。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各胎齡段淋巴細(xì)胞凋亡數(shù)差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。結(jié)論： （1）淋巴細(xì)胞凋亡是人胎腸系膜淋巴結(jié)發(fā)育過(guò)程中的普遍現(xiàn)象；（2）人胎發(fā)育時(shí)期，腸系膜淋巴結(jié)通過(guò)細(xì)胞凋亡方式對(duì)淋巴細(xì)胞的發(fā)育有一定篩選作用。

【關(guān)鍵詞】 淋巴結(jié)； 腸系膜； 人； 胎兒； 淋巴細(xì)胞； 凋亡

［Abstract］ Objective: To study the apoptosis of lymphocytes in mesenteric lymph nodes （MLNs）during different stages of human fetus development. Methods： Thirty-five human fetuses were collected. The Hermatoxylin-Eosin（HE） staining， immunohistochemistry apoptosis method (in-situ dT， dT-mediated dUTP nick labeling，TUNEL)， and cytometry were used in this study. Results： At the 9th week of fetal age， no apoptosis lymphocyte was seen in the primordium of the MLNs. In 11~12 weeks of fetal development， a few of apoptosis lymphocytes could be found. Obvious apoptosis lymphocytes were observed from the 13rd week to the 32nd week. They occurred singly and were phagocytized by macrophage. But there was not distinct difference between each stage of the developing fetuses (P>0.05)．Conclusions： (1) The apoptosis of lymphocytes is a common phenomenon during MLNs growth in human embryo development; (2)During the development of human fetus， the MLNs have screening function to lymphocytes through apoptosis.

［Key words］ lymph nodes； mesentery； persons； fetus； lymphocyte； apoptosis

細(xì)胞凋亡（apoptosis）不僅發(fā)生在一些疾病過(guò)程中，在胚胎發(fā)生、器官發(fā)育等方面也有重要的作用[1，2]。目前淋巴細(xì)胞的凋亡已有較多報(bào)道，但多側(cè)重于對(duì)動(dòng)物在體或離體及人離體淋巴細(xì)胞的研究，然而在人胎腸系膜淋巴結(jié)（mesenteric lymph nodes， MLNs）發(fā)生過(guò)程中淋巴細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)情況如何[3，4]？為此，于2005年1月擬探討人胎兒MLNs不同時(shí)期相關(guān)淋巴細(xì)胞凋亡的變化規(guī)律，以期對(duì)人胎腸系膜淋巴結(jié)的發(fā)生和腹腔內(nèi)免疫防御的研究提供形態(tài)學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

收集因故中止妊娠的人胎35例，各例均測(cè)量頂臀長(zhǎng)（crown-rump length，CRL），按Patten[5]標(biāo)準(zhǔn)確定胎齡（表1）。表1 胎齡、頂臀長(zhǎng)及例數(shù)分布

1.2 主要試劑

TUNEL（In-situ dT dT-mediated dUTP nick labeling）法染色細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（In situ cell apoptosis detection kit I， POD）和顯色劑（Diaminobenzidine， DAB），均由武漢博士德生物制劑公司提供。

1.3 方法

各例均取部分腸系膜淋巴結(jié)，用10％Formalin固定，常規(guī)石蠟包埋，制成4 μm連續(xù)切片。進(jìn)行常規(guī)HE染色和免疫組織化學(xué)TUNEL法染色。

免疫組織化學(xué)TUNEL法染色主要步驟：切片脫蠟下行入水，入3%H2O2 10 min，蒸水洗5 min，3次，依次加入標(biāo)記緩沖液和標(biāo)記液37 ℃孵育120 min，TBS洗3 min，3次，加入封閉液，封閉液1∶100稀釋生物素化抗地高辛抗體37 ℃孵育30 min，TBS洗3 min，3次，TBS1∶100稀釋SABC，37 ℃孵育60 min，TBS洗5 min，3次，DAB-H2O2液顯色，中性樹(shù)膠封片。

方法對(duì)照：均用TBS緩沖液代替標(biāo)記液，余步驟相同。

1.4 切片觀(guān)察、圖像分析及數(shù)據(jù)處理

以有核陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/視野（物鏡40倍目鏡10倍）對(duì)人胎腸系膜淋巴結(jié)內(nèi)凋亡的淋巴細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。每胎齡段標(biāo)本隨機(jī)取5例，每例取非連續(xù)切片2張，每張計(jì)數(shù)5個(gè)視野，將各胎齡段淋巴細(xì)胞凋亡數(shù)兩兩比較。用SPSS12.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1 淋巴細(xì)胞凋亡的HE染色觀(guān)察

光鏡下，經(jīng)HE染色的凋亡的淋巴細(xì)胞主要表現(xiàn)為胞體變小、胞質(zhì)濃縮、嗜酸性變、核染色質(zhì)凝集成塊、核固縮和顏色深染、致密度高。

9周，人胎腸系膜淋巴囊腔內(nèi)淋巴結(jié)原基形成，未見(jiàn)凋亡的淋巴細(xì)胞。11~12周，淋巴結(jié)原基周的淋巴囊壁結(jié)締組織形成被膜，原基增大，淋巴細(xì)胞增多并集中于一側(cè)（圖1）。15周以后，形成早期髓索，索間的間隙分化為淋巴竇，23周時(shí)皮質(zhì)可辨別，并且在皮質(zhì)內(nèi)見(jiàn)初級(jí)淋巴小結(jié)，29周以后，隨胎齡的增加，皮質(zhì)繼續(xù)增厚，可辨別淺層皮質(zhì)（內(nèi)有較多的初級(jí)淋巴小結(jié)）與薄層副皮質(zhì)區(qū)，在淋巴結(jié)內(nèi)均可見(jiàn)凋亡的淋巴細(xì)胞，單個(gè)散在分布于MLNs內(nèi)（圖2~4）。可見(jiàn)巨噬細(xì)胞吞噬凋亡淋巴細(xì)胞的現(xiàn)象（圖1~4)。

2.2 淋巴細(xì)胞凋亡的免疫組織化學(xué)觀(guān)察

光鏡下，凋亡的淋巴細(xì)胞經(jīng)免疫組織化學(xué)TUNEL法染色后，免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色顆粒，位于胞核內(nèi)（圖5）。對(duì)照片結(jié)果為陰性。9周，人胎腸系膜淋巴結(jié)原基內(nèi)未見(jiàn)凋亡的淋巴細(xì)胞。11~12周，出現(xiàn)極少的淋巴細(xì)胞凋亡，散在分布（圖5）。早期凋亡的淋巴細(xì)胞，核染色質(zhì)成大小不等的深褐色顆粒，邊集于核膜下，形成環(huán)狀核（圖5~7）；晚期細(xì)胞核染色質(zhì)凝集成塊，核固縮，深染，進(jìn)而核碎裂，形成凋亡小體（圖7、圖8）。

13~32周，各胎齡段均見(jiàn)有淋巴細(xì)胞凋亡，凋亡的淋巴細(xì)胞數(shù)略有增加，但經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，人胎腸系膜淋巴結(jié)凋亡的淋巴細(xì)胞細(xì)胞計(jì)數(shù)在各胎齡段間差異沒(méi)有顯著性（P＞0.05）。

3 討論

細(xì)胞凋亡是生命有機(jī)體內(nèi)正常的生理現(xiàn)象，是有核細(xì)胞在一定條件下通過(guò)啟動(dòng)自身的內(nèi)部機(jī)制，主要是通過(guò)內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶的激活而發(fā)生的細(xì)胞自然死亡過(guò)程，這種基因控制下的細(xì)胞自我消亡過(guò)程，亦稱(chēng)為程序性細(xì)胞死亡（programmed cell death， PCD），細(xì)胞凋亡是多細(xì)胞動(dòng)物生命活動(dòng)過(guò)程如胚胎發(fā)生過(guò)程中重要組成部分[1~9]。本實(shí)驗(yàn)觀(guān)察到從11周MLNs原基形成到32周各胎齡段腸系膜淋巴結(jié)發(fā)育過(guò)程中均有淋巴細(xì)胞凋亡現(xiàn)象存在，證實(shí)了淋巴細(xì)胞凋亡也是人胎MLNs發(fā)育過(guò)程中的普遍現(xiàn)象。有研究報(bào)道，中樞淋巴器官內(nèi)，絕大多數(shù)的與自身抗原發(fā)生反應(yīng)的淋巴細(xì)胞往往不能發(fā)育成熟而被篩選掉，這一過(guò)程是通過(guò)細(xì)胞凋亡的方式實(shí)現(xiàn)的[10]。本實(shí)驗(yàn)觀(guān)察到在外周淋巴器官發(fā)育過(guò)程中，淋巴細(xì)胞凋亡也作為一種普遍現(xiàn)象存在，這與一些學(xué)者認(rèn)為胎兒發(fā)育時(shí)期淋巴細(xì)胞是在中樞淋巴器官內(nèi)獲得死亡信號(hào)，而在外周凋亡的觀(guān)點(diǎn)相符合[1，11，12]。同時(shí)，也說(shuō)明遷入MLNs內(nèi)的初始T、B細(xì)胞大多數(shù)按正常規(guī)律發(fā)育分化。提示在人胎淋巴結(jié)的發(fā)育過(guò)程中，淋巴結(jié)對(duì)來(lái)自中樞淋巴器官的淋巴細(xì)胞仍存在一定的篩選作用。本實(shí)驗(yàn)研究表明，隨著胎齡增加，淋巴結(jié)體積逐漸增大，凋亡細(xì)胞細(xì)胞數(shù)量并未隨胎齡增大而明顯增加（P＞0.05），提示了人胎發(fā)育過(guò)程中，淋巴結(jié)內(nèi)成熟淋巴細(xì)胞數(shù)量呈逐漸增多趨勢(shì)。

參考文獻(xiàn)

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淋巴細(xì)胞范文3

【摘要】 目的 探討弱激光對(duì)機(jī)體免疫刺激作用的機(jī)理。 用劑量63.7J/cm2的He-Ne激光照射小鼠神闕穴，照射時(shí)間為10天，每天照射5min，（1）采用臺(tái)盼藍(lán)活體注射顯示巨噬細(xì)胞吞噬力試驗(yàn)方法；（2）采用吖啶橙（AO）顯示核酸的熒光染色法分別觀(guān)察小鼠腸系膜淋巴結(jié)內(nèi)巨噬細(xì)胞的吞噬功能和淋巴細(xì)胞內(nèi)核酸含量的。（3）觀(guān)察淋巴結(jié)組織結(jié)構(gòu)。結(jié)果 （1）照射組淋巴結(jié)內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬功能較對(duì)照組顯著增高，差異有非常顯著性(P

【關(guān)鍵詞】 激光；巨噬細(xì)胞； 淋巴細(xì)胞

An experimental study of He- Ne laser irradiation on the macrophages and lymphocytes in lymph node

【Abstract】 Objective To research the effects of He-Ne laser irradiation on immunity of organism.Methods Shenque acupoints of mice abdomen were irradiated by He-Ne laser at the dosages of 63.7J/cm2 for 10 days，5 minutes each day.n following methods are taken：(1)Observing the phagocytosis of the macrophages in lymph node after trypan blue injecting the live mice.(2)Observing the changes of nucleic acid of lymphocytes with fluorescence microscope.(3) Observing the tissue structure of lymph node by HE stain.Results The four indexes：number of trypan granule，area of granule，ratio of granule area to cell area and granule integral optical density at irradiated group were higher than that of non-irradiated group (P

【Key words】 laser;macrophage; lymphocyte

淋巴結(jié)是機(jī)體的主要周?chē)馨推鞴伲挥诹馨脱h(huán)的通路上，其大小、結(jié)構(gòu)及內(nèi)含細(xì)胞成分的變化與機(jī)體的免疫功能狀態(tài)密切相關(guān)。本文采用He-Ne激光照射小鼠神闕穴后，觀(guān)察激光對(duì)腸系膜淋巴結(jié)組織結(jié)構(gòu)和其內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬力及淋巴細(xì)胞增殖能力的影響。旨在探討低強(qiáng)度激光對(duì)機(jī)體免疫刺激作用機(jī)制，為臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 昆明種小白鼠，體重18~22g，雌雄各半，隨機(jī)分成對(duì)照組和照射組，采用上海產(chǎn)1000B(c)He-Ne激光器照射小鼠神闕穴（剪毛），照射功率25mW，照射劑量為63.7J/cm2，光斑直徑0.3cm，照射時(shí)間為10天，每天照射5min。

1.2 方法 （1）取材前3日，每天往腹腔內(nèi)注射0.5%的無(wú)菌臺(tái)盼藍(lán)0.3ml，第4日取腸系膜淋巴結(jié)。用10%福爾馬林固定，常規(guī)法制成石蠟切片，用伊紅淡然，將切片用HI-CI型醫(yī)學(xué)圖像系統(tǒng)于每組600倍光鏡下隨機(jī)選擇12屏，統(tǒng)計(jì)巨噬細(xì)胞吞噬臺(tái)盼藍(lán)的顆粒數(shù)目(GN)、顆粒面積(GA)及其與細(xì)胞面積之比(GA/CA)和顆粒積分光密度(IOD) 4項(xiàng)指標(biāo)，并輸入微機(jī)作F檢驗(yàn)。（2）取腸系膜淋巴結(jié)涂片，用Carnoy 氏固定液固定15min，再用0.01% AO緩沖液染色10min，置OLYMPUS BHF-型熒光顯微鏡的高倍鏡下觀(guān)察，DNA呈黃色熒光，RNA呈紅色熒光，DNA或RNA含量越多，黃色或紅色越深越亮。（3）常規(guī)HE染色方法觀(guān)察淋巴結(jié)的組織結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 He-Ne激光對(duì)淋巴結(jié)巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響 淋巴結(jié)的每組切片置圖像分析系統(tǒng)的光鏡下放大600倍，隨機(jī)選擇12屏觀(guān)察淋巴結(jié)髓質(zhì)區(qū)，巨噬細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)色顆粒為陽(yáng)性，臺(tái)盼藍(lán)顆粒呈大小、粗細(xì)不等，分布不均，顏色深淺各異。圖像分析結(jié)果用統(tǒng)計(jì)軟件作F檢驗(yàn)，見(jiàn)表1。

淋巴細(xì)胞范文4

    淋巴細(xì)胞的分離隨機(jī)選擇采集后6h內(nèi)的ACD抗凝全血(200ml,上海市血液中心提供)并制備成濃縮白細(xì)胞,在無(wú)菌條件下用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞,用PBS(含EDTA0.5mmol/L)洗滌2次,1640培養(yǎng)基洗滌1次,棄上清后重懸于1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清),置5%CO237℃孵箱中培養(yǎng)過(guò)夜;次日離心收集懸浮細(xì)胞,加入自體血漿重懸至106個(gè)細(xì)胞/mL。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組淋巴細(xì)胞樣本的制備在避光條件下,取5ml細(xì)胞懸浮液,加入終濃度100μmol/L的核黃素,混合均勻后,注入PVC光照袋中,編入實(shí)驗(yàn)組;另取5ml細(xì)胞懸液加入上述核黃素等體積的PBS,混勻注入PVC袋,編入對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組置于420nm的可見(jiàn)光光源下進(jìn)行雙面照射,照射量為40J/cm2;對(duì)照組不接受光照。將各組淋巴細(xì)胞離心后,重懸于1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)。各取2.5ml加入24孔板,每孔中加入終濃度0.5μg/mL的PHA;同時(shí),以同等樣本量的不加PHA的細(xì)胞懸液作為平行對(duì)照。于5%CO237℃孵箱中培養(yǎng)。淋巴細(xì)胞增殖檢測(cè)對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)48h后,分別取各組淋巴細(xì)胞100μl加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,加入BrdUlabelingreagent,混勻,置5%CO237℃孵箱中培養(yǎng)24h;用BrdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒內(nèi)相關(guān)試劑處理后,于450nm處讀取吸光度值。根據(jù)讀數(shù)計(jì)算實(shí)驗(yàn)組淋巴細(xì)胞增殖抑制率:實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖抑制率I=[1-(O.D.PHA+實(shí)驗(yàn)組–O.D.PHA-實(shí)驗(yàn)組)/(O.D.PHA+對(duì)照組–O.D.PHA-對(duì)照組)]×100%。淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子分泌檢測(cè)對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)72h后,收集上述各組淋巴細(xì)胞各1ml,1600rpm離心5min,取上清,用細(xì)胞因子酶標(biāo)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-10、IL-12、IL-4的含量。AnnexinV-PE/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)收集培養(yǎng)24h的對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞各1ml,經(jīng)1600rpm離心5min棄上清,用PBS洗滌2次,重懸于1×bindingbuffer中,加入3μlAnnexin-V:PE和3μl7-AAD,混勻,室溫避光放置15min,加入400μl1×bindingbuffer,混勻,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。數(shù)據(jù)分析使用MicrosoftExcel軟件,所有量值數(shù)據(jù)均采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±S)”表示,作配對(duì)t檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    核黃素光化學(xué)法對(duì)PHA誘導(dǎo)后的淋巴細(xì)胞增殖的影響如表1所示,對(duì)照組接受PHA刺激的淋巴細(xì)胞較未接受PHA刺激的細(xì)胞O.D.值顯著升高,而實(shí)驗(yàn)組淋巴細(xì)胞接受PHA刺激后O.D.值沒(méi)有明顯變化,核黃素光化學(xué)處理對(duì)淋巴細(xì)的增殖抑制率為(94.49±7.61)%。核黃素光化學(xué)法對(duì)淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的影響因淋巴細(xì)胞樣本來(lái)自不同的捐獻(xiàn)者,對(duì)抗原刺激產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力存在個(gè)體差異,因此不同淋巴細(xì)胞對(duì)同一細(xì)胞因子的分泌量存在很大差異,導(dǎo)致SD值比較高,但對(duì)同一份淋巴細(xì)胞樣本,接受PHA刺激后,對(duì)照組淋巴細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)組淋巴細(xì)胞同一細(xì)胞因子分泌量的比較仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PHA刺激后,與對(duì)照組淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子相比較,實(shí)驗(yàn)組淋巴細(xì)胞IFN-γIL-10和IL-12的分泌量分別降低了(89.54±22.75)%、(77.83±22.3)%和(88.57±15)%。AnnexinV-PE/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果FSC-SSC散點(diǎn)圖(圖略)顯示,核黃素光化學(xué)處理之后的淋巴細(xì)胞前向角散射減少,表明處理后細(xì)胞大小發(fā)生改變;從AnnexinV-PE/7-AAD雙標(biāo)圖(圖略)可以看出,實(shí)驗(yàn)組絕大多數(shù)淋巴細(xì)胞位于A(yíng)nnexin陽(yáng)性的兩個(gè)象限內(nèi),其中早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡或壞死細(xì)胞均高于對(duì)照組。,經(jīng)核黃素處理后的實(shí)驗(yàn)組淋巴細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡或壞死率較對(duì)照組有顯著性差異。

    TA-GvHD的發(fā)生率與輸入的具有免疫活性的淋巴細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān),輸入的供血者的淋巴細(xì)胞數(shù)量越多,發(fā)病的可能愈高,病情愈嚴(yán)重,死亡率也愈高。因此血液制品中淋巴細(xì)胞的滅活是預(yù)防TA-GvHD的最有效的辦法。利用γ射線(xiàn)照射可以有效抑制血液制品中淋巴細(xì)胞的增殖活性,射線(xiàn)產(chǎn)生的電離輻射會(huì)對(duì)淋巴細(xì)胞的DNA造成不可逆的損傷,使其失去增殖和分化能力。因此,該方法是目前國(guó)際上公認(rèn)的預(yù)防TA-GVHD的有效方法。由于輻照對(duì)紅細(xì)胞的代謝及功能可造成不同程度的影響,所需儀器設(shè)備昂貴,對(duì)操作人員存在輻射危害等原因,該方法在臨床實(shí)踐中的使用受到了一定的限制[10]。核黃素是一種自然存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的多環(huán)平面結(jié)構(gòu)的芳香族化合物,可穿越細(xì)胞膜、病毒脂薄膜以及核膜與核酸結(jié)合,在接受了UVA或可見(jiàn)光提供的能量后,發(fā)生電子轉(zhuǎn)移,使鳥(niǎo)嘌呤堿基氧化并形成共價(jià)加成化合物,阻止核酸的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制,進(jìn)一步的反應(yīng)甚至可使核酸骨架鏈斷裂,達(dá)到滅活淋巴細(xì)胞和病原體的目的。由于核黃素(即維生素B2),是人體必需的一種維生素,對(duì)人體無(wú)任何毒性,在這一點(diǎn)上核黃素光化學(xué)法明顯優(yōu)于其他血液病原體滅活方法[11]。核黃素光化學(xué)法成為近年來(lái)血液制品病原體滅活技術(shù)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn),已有研究證明該方法可以用于血漿、血小板等血液成分的病原微生物的滅活[12]。為了研究核黃素光化學(xué)對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞的滅活作用,本實(shí)驗(yàn)將淋巴細(xì)胞懸浮于自體血漿,所得結(jié)果能夠真實(shí)反映血液中淋巴細(xì)胞的滅活效果。實(shí)驗(yàn)中使用PHA誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組淋巴細(xì)胞的增殖,觀(guān)察核黃素光化學(xué)法對(duì)淋巴細(xì)胞增殖活性的抑制作用和效果。結(jié)果顯示,對(duì)照組淋巴細(xì)胞經(jīng)PHA刺激后細(xì)胞增殖明顯,而經(jīng)核黃素光化學(xué)法處理的實(shí)驗(yàn)組淋巴細(xì)胞接受PHA刺激后幾乎沒(méi)有增殖,表明核黃素光化學(xué)法可有效抑制淋巴細(xì)胞增殖活性,增殖抑制率為(94.69±7.61)%。TA-GvHD發(fā)生的“細(xì)胞因子風(fēng)暴學(xué)說(shuō)”認(rèn)為,活化的供者T細(xì)胞釋放大量IFN-γ等細(xì)胞因子,這些細(xì)胞因子又能夠進(jìn)一步活化供者T細(xì)胞使其擴(kuò)增,這種逐級(jí)放大形成惡性循環(huán)的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)能夠促進(jìn)TA-GvHD時(shí)的組織和細(xì)胞損傷[13];臨床研究發(fā)現(xiàn)IL-12在臨床急性移植物抗宿主病(aGvHD)發(fā)生中起重要的正向調(diào)節(jié)作用[14];IL-10在aGvHD的發(fā)病過(guò)程中的重要作用也已得到證實(shí)[15,16];Mur-phy等研究發(fā)現(xiàn)以IL-4基因剔除小鼠作為骨髓移植供體,移植后aGvHD的發(fā)生率降低,提示供體來(lái)源的IL-4在aGvHD中可能起正調(diào)控作用[17]。鑒于細(xì)胞因子在GvHD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用,研究核黃素光化學(xué)處理對(duì)供血者淋巴細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的分泌能力的影響,有利于進(jìn)一步探討利用核黃素光化學(xué)法預(yù)防TA-GvHD的可行性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在PHA刺激條件下,核黃素光化學(xué)處理的淋巴細(xì)胞IFN-γ、IL-10和IL-12的分泌量較對(duì)照組均有明顯降低。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組淋巴細(xì)胞分泌IL-4的量較少,2組分泌量無(wú)明顯差異。這一結(jié)果表明,核黃素光化學(xué)法可明顯抑制人外周血淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-10和IL-12的活性,這與我們之前將淋巴細(xì)胞懸浮于PBS中進(jìn)行光化學(xué)處理的結(jié)果一致[18]。另外,由于TA-GvHD一般發(fā)生于輸血后1~30d內(nèi)[19],為了更準(zhǔn)確地描述核黃素光化學(xué)處理對(duì)淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響,有必要延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行繼續(xù)檢測(cè)。位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸(phosphatidyl-serine,PS)外翻,是細(xì)胞凋亡早期的1項(xiàng)重要標(biāo)志,而AnnexinV作為一種Ca2+依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白,能與PS發(fā)生特異性結(jié)合。用熒光素PE標(biāo)記An-nexinV作為熒光探針,利用流式細(xì)胞儀可以檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生,而將AnnexinV與非侵入性染料7-氨基放線(xiàn)菌素D(7-Amino-ActinomytinD,7-AAD)聯(lián)合使用則可以區(qū)分凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。本次研究結(jié)果顯示,在經(jīng)核黃素光化學(xué)處理24h之后,絕大多數(shù)細(xì)胞發(fā)生死亡,其中凋亡和壞死細(xì)胞的比例均明顯高于對(duì)照組,這一結(jié)果表明核黃素光化學(xué)處理可能是通過(guò)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡,達(dá)到滅活的目的,這一點(diǎn)還有待從其他方面進(jìn)行驗(yàn)證。核黃素光化學(xué)法作為血液制品病原體滅活的新方法,其有效性及安全性已經(jīng)得到證實(shí)[20,21],本次研究則表明核黃素光化學(xué)法可以有效滅活人外周血淋巴細(xì)胞。由此可以推測(cè),核黃素光化學(xué)法可以在滅活血液制品中病原體的同時(shí),達(dá)到滅活淋巴細(xì)胞,預(yù)防TA-GvHD的目的。這樣可以簡(jiǎn)化血液安全處理的程序,降低因反復(fù)處理對(duì)血制品造成的影響,因此核黃素光化學(xué)法是1種非常有潛力的血液安全處理方法。

淋巴細(xì)胞范文5

【摘要】 目的 分析HBV感染者外周血各亞群淋巴細(xì)胞的變化。方法 對(duì)112例乙肝患者采用熒光定量PCR技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)血中HBV-DNA及檢測(cè)各組外周血T細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+、CD3-/CD16+CD56+(NK細(xì)胞)、CD3-CD19+(B細(xì)胞)表達(dá)百分比。結(jié)果 與急性肝炎組比較，慢性肝炎、肝硬化組CD3、CD4、CD8均有下降(P

【關(guān)鍵詞】 乙肝病毒;T淋巴細(xì)胞亞群;急性肝炎;慢性肝炎

乙型肝炎的病變由HBV感染誘發(fā)的免疫病理反應(yīng)造成。為探討乙型肝炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程中免疫功能變化特點(diǎn)，本研究采用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)112例乙肝患者血清中HBV-DNA的感染情況進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)對(duì)其外周血T細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+、CD3-/CD16+CD56+(NK細(xì)胞)、CD3-CD19+(B細(xì)胞)進(jìn)行分析，探討HBV感染者的細(xì)胞免疫狀態(tài)及其與病毒復(fù)制的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病例選擇 我院2008年1—6月收治的住院患者112例，男79，女33例，年齡15～65歲，平均(31±22)歲。病程6～106個(gè)月。診斷符合西安會(huì)議修訂的《病毒性肝炎防治方案》診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，其中慢性乙型肝炎(CAH)57例，乙型肝炎肝硬化(LC)36例，急性乙肝(AHB)19例，均排除甲、丙、丁、戊型肝炎。入院前3個(gè)月內(nèi)無(wú)免疫制劑史。

1.2 主要試劑和儀器 北京醫(yī)用離心機(jī)廠(chǎng)低速離心機(jī)，日本日立公司SANYO型低溫冰箱，F(xiàn)icoll淋巴細(xì)胞分離液(比重1.077±0.002)購(gòu)自上海試劑二廠(chǎng)，TagDNA聚合酶購(gòu)自晶美生物制品公司，熒光定量試劑盒購(gòu)自深圳達(dá)安基因公司，淋巴細(xì)胞亞群?jiǎn)慰乖噭簊imultestTM IMK-Lymphocyte購(gòu)自BD公司，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自Beckman coulter公司。

1.3 流式細(xì)胞儀測(cè)定淋巴細(xì)胞亞群百分比

將含EDTA2Na空腹全血3mL，在采集后4h通過(guò)simultestTM IMK-Lymphocyte試劑盒、FACScalibur流式細(xì)胞儀分析淋巴細(xì)胞亞群，包括CD3+、CD4+、CD8+、NK、B細(xì)胞表達(dá)百分比，最后進(jìn)行各淋巴細(xì)胞亞群百分比統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 血清HBV-DNA檢測(cè) 參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。直接吸取血清50μL，加等量的DNA提取液混勻，100℃沸水浴10min，轉(zhuǎn)至4℃靜置6～8h，離心5min，取上清液5μL做PCR反應(yīng)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間樣本均數(shù)比較采用Student`s t檢驗(yàn)，組間的兩兩比較采用Student-Newman-Keuls。

2 結(jié)果

2.1 各組外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表1。

2.2 血清HBVDNA(+)與HBVDNA(-)組的CD3、CD4、CD8、NK、B細(xì)胞比較 見(jiàn)表2，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P>0.05。表1 各組外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果比較

3 討論

HBV感染人體后可引起肝臟和其他臟器的病變。乙型肝炎的發(fā)生是機(jī)體與病毒相互作用的結(jié)果。HBV侵入肝細(xì)胞內(nèi)增殖，可使受染細(xì)胞表達(dá)HBsAg、HbcAg等，能為機(jī)體免疫系統(tǒng)所識(shí)別，引起一系列的免疫應(yīng)答。人體外周T淋巴細(xì)胞由不同的亞群組成，T淋巴細(xì)胞是宿主抗病毒、抗腫瘤免疫反應(yīng)中起主導(dǎo)作用的免疫活性細(xì)胞，構(gòu)成了免疫系統(tǒng)的主要部分。

T淋巴細(xì)胞由不同的亞群組成。人成熟T細(xì)胞按表型不同可將其分為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞。CD3+代表總T淋巴細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞為輔T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞為細(xì)胞毒性T細(xì)胞。本研究通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定發(fā)現(xiàn)，隨著病情發(fā)展從急性肝炎組到慢性肝炎、肝硬化組CD3+、CD4+、CD8+、NK細(xì)胞均有所下降(P

NK細(xì)胞是機(jī)體天然免疫的主要承擔(dān)者。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在HBV感染中肝硬化患者的NK細(xì)胞均低于慢性肝炎及急性肝炎組(P

乙型肝炎細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)是由宿主免疫應(yīng)答和病毒共同作用的結(jié)果。HBV的慢性感染使機(jī)體的免疫系統(tǒng)發(fā)生明顯的異常。T淋巴細(xì)胞是人體主要的免疫細(xì)胞，其數(shù)量和比例是反映機(jī)體免疫水平的主要指標(biāo)。淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)與乙肝臨床分型有一定關(guān)系。本文結(jié)果表明檢測(cè)CD3+、CD4+、CD8+、NK、B細(xì)胞對(duì)了解肝病發(fā)病機(jī)制及肝臟損害程度有重要臨床意義。

參考文獻(xiàn)

[1] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲(chóng)病學(xué)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì)，病毒性肝炎防治方案[J].中華內(nèi)科雜志，2001，40(1)：62-68.

[2] 肖光明.乙型肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化[J].實(shí)用肝臟病雜志，2005，8(1)：22-24.

[3] Gamadia LE，Rentenaar RJ，Barrs PA，et al.Differentiation of cytomegalovirus-specific CD8+Tiers cells in healthy and immunosuppressed virus carriers[J].Blood，2001，98(10)：754-761.

[4] 王靜艷，穆桂玲，劉沛，等.乙型重型肝炎基因變異與免疫異常的關(guān)系[J].中華傳染病雜志，2001，4(19)：73-76.

[5] 肖光明，姚細(xì)安，連粵湘，等.乙型肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化[J].實(shí)用肝臟病雜志，2005，8(1)：22-24.

淋巴細(xì)胞范文6

[關(guān)鍵詞]流式細(xì)胞儀；艾滋病；T淋巴細(xì)胞亞群

[中圖分類(lèi)號(hào)]R511 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1673-7210（2007）05（c）-057-01

獲得性免疫缺陷綜合征（艾滋病）是由免疫缺陷病毒HIV感染所引起的一種嚴(yán)重的傳染性疾病，HIV主要侵犯CD4＋T淋巴細(xì)胞，并可導(dǎo)致細(xì)胞免疫損害。 T淋巴細(xì)胞亞群的水平和疾病的進(jìn)展程度有密切關(guān)系，是判斷病情進(jìn)展，推測(cè)預(yù)后及評(píng)價(jià)抗病毒療效的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 病例資料

15例AIDS患者，20例HIV感染者來(lái)源于本市疾病控制中心送檢和本院就診的2003~2006年病例，均經(jīng)免疫印跡試驗(yàn)確診。30例健康成人標(biāo)本為本院體檢中心送檢。根據(jù)臨床醫(yī)生分期診斷將感染者分為兩組，即HIV感染者無(wú)癥狀組(AS組)、艾滋病組(AIDS組)。

1.2 主要儀器和試劑

BeckmanCoulter Epics XL流式細(xì)胞儀； CD4+-FITC/CD8+-PE/CD3+-PECYS三色熒光標(biāo)記抗體，IgG二色熒光標(biāo)記抗體。

1.3 研究及統(tǒng)計(jì)方法

3組均采空腹靜脈血2 ml，EDTA-K2抗凝。取CD4+-F ITC/CD8+-PE/CD3+-PECYS三色熒光標(biāo)記抗體20 μl和抗凝全血50 μl加入TruCOUNTTube絕對(duì)計(jì)數(shù)專(zhuān)用試管中充分混勻，室溫，避光孵育20 min，加入1×FAGS溶血?jiǎng)?50 μl，充分混勻，室溫下避光孵育15 min待測(cè)。另取一支管加入IgG二色熒光標(biāo)記抗體20 μl和抗凝血50 μl作為陰性對(duì)照。運(yùn)行SYSTEM Ⅱ程序上機(jī)檢測(cè)，用FLOW CHECK校準(zhǔn)FCM的光路和流路。確定其CV值小于2%。每管收集5 000個(gè)以上細(xì)胞進(jìn)行分析。

數(shù)據(jù)以x±s表示,采用t檢驗(yàn),方差分析,判斷各組之間的相關(guān)程度。

2結(jié)果

AS組和AIDS組的CD4＋淋巴細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)和百分率均明顯低于正常組(P

3 討論

人免疫缺陷病毒感染逐漸耗竭在免疫調(diào)節(jié)中起重要作

用的CD4＋T淋巴細(xì)胞，最后引發(fā)獲得性免疫缺陷綜合征，因此CD4＋淋巴細(xì)胞水平被廣泛應(yīng)用于確定HIV感染的病期，本文中的數(shù)據(jù)驗(yàn)證了這點(diǎn)：AS組病人比正常對(duì)照組的CD4＋水平明顯降低，而AIDS組病人的CD4＋水平則較AS組有明顯降低，即隨著病程的進(jìn)展，外周血CD4＋水平呈進(jìn)行性地下降。HIV感染所致免疫功能的損傷不僅是CD4＋淋巴細(xì)胞的破壞，其他免疫細(xì)胞也不同程度地受到影響。CD8＋淋巴細(xì)胞通過(guò)分泌各種細(xì)胞因子殺死被病毒感染的靶細(xì)胞，它是機(jī)體抗HIV最主要的免疫細(xì)胞，在HIV感染初期，隨著病毒量的增加，CD8＋淋巴細(xì)胞的數(shù)量也隨之上升，其數(shù)量與病毒量呈正相關(guān)[1]。本研究結(jié)果顯示，AS組CD4＋淋巴細(xì)胞減少，而CD8＋淋巴細(xì)胞增多及CD4＋/CD8＋比值顯著下降等都與上述討論相吻合，3組中僅AIDS患者CD3＋水平有顯著下降（P＜0.05)，但表1中數(shù)據(jù)顯示，在A(yíng)IDS組中三種T細(xì)胞均有不同程度的下降，這說(shuō)明AIDS病人整體的免疫防御與監(jiān)視功能均有所下降，這與CD4＋衰竭引起的全身性免疫功能下降有關(guān)[2]。

另外，CD3＋與CD8＋的水平也能在一定程度上體現(xiàn)HIV病情的進(jìn)展，可作為輔助檢查項(xiàng)目，以便綜合分析病情。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Paul ME,Shcarcr WT,Kozinctz CA,et parison of CD8+T cell subsets in HIV infected rapid progressor children versus non-rapid progressor children[J].J Allergy Clin Immunol,2001,108(2):258-264.

[2]Sieg SF,Mitchem JB,Bazlar DA,et al.Close link between CD4+ and CD8+ T cell proliferation defects in patients with human immunodeficiency virus disease and relationship to extended period of CD4+ lymphopenia[J].J Infect Dis,2002,185(10):1401-1416.