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細(xì)胞培養(yǎng)范文1

【關(guān)鍵詞】 內(nèi)耳干細(xì)胞 培養(yǎng) 移植 中毒性耳聾 動(dòng)物模型 大鼠

長(zhǎng)期或過(guò)量使用鏈霉素、慶大霉素及丁胺卡那霉素等類藥物導(dǎo)致的中毒性耳聾是臨床常見(jiàn)的藥物副作用。根據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局統(tǒng)計(jì)，每年我國(guó)因藥物造成聽(tīng)力損害的患者高達(dá)數(shù)百萬(wàn)人。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其致病機(jī)制主要為：耳毒類藥如氨基甙類抗生素可抑制ATP 酶的活化，使內(nèi)、外淋巴液中K+、Na+ 倒置， 引起膜通透性改變和多種水解酶釋放， 最終使內(nèi)耳毛細(xì)胞萎縮、變性、壞死，而且內(nèi)耳毛細(xì)胞損傷通常是不可逆的。近年來(lái)，隨著神經(jīng)干細(xì)胞研究的不斷深入，已有研究表明：內(nèi)耳損傷后外源基因刺激可以產(chǎn)生新的毛細(xì)胞。因而，通過(guò)促進(jìn)耳源性神經(jīng)干細(xì)胞向毛細(xì)胞轉(zhuǎn)化，利用其本身的分化特性， 重建毛細(xì)胞形態(tài)和神經(jīng)連接， 恢復(fù)毛細(xì)胞功能也許是治療中毒性耳聾的有效途徑之一。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)移植內(nèi)耳干細(xì)胞入中毒性耳聾模型大鼠內(nèi)耳，觀察移植后的內(nèi)耳干細(xì)胞生長(zhǎng)、整合等情況，為治療中毒性耳聾提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用健康SD大鼠20只，雌雄不限，體重350～400 g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 試劑和抗體 Neurobasal培養(yǎng)基、B27輔助培養(yǎng)基（GIBCO公司）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF，Sigma公司）、胰蛋白酶（Sigma公司）、巢蛋白（nestin）抗體（Sigma公司）、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)及其單克隆抗體（Sigma公司）。

1.3 主要儀器 離心機(jī)、超凈工作臺(tái)、二氧化碳培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡、FACS Calibur型流式細(xì)胞儀（BD公司）等。

1.4 中毒性耳聾模型的建立 聽(tīng)耳廓反射和前庭功能正常的大鼠給予硫酸慶大霉素肌內(nèi)注射。選用中等度的中毒劑量80 mg/（kg·d），連續(xù)使用10天。經(jīng)聽(tīng)耳廓反射測(cè)定器檢查判定鼠的聽(tīng)力下降程度以及耳蝸切片觀察耳蝸損傷狀況，特別是內(nèi)耳毛細(xì)胞崩解的程度，確定造模成功與否。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組 本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為2組，每組10只：干細(xì)胞組，行干細(xì)胞耳蝸內(nèi)移植；生理鹽水組，耳蝸內(nèi)注入生理鹽水。

1.6 耳蝸干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定

1.6.1 耳蝸干細(xì)胞取材 水合氯醛深度麻醉P0大鼠（胚鼠），無(wú)菌操作條件下分離內(nèi)耳耳蝸。經(jīng)碘酊、乙醇消毒后固定于燭臺(tái)， 去外膜，在解剖顯微鏡下操作，剪去動(dòng)物耳廓及外耳道(外耳道為軟骨性) ，暴露鼓膜，透過(guò)菲薄的鼓膜可見(jiàn)到聽(tīng)骨鏈。用耵聹鉤沿鼓膜下緣6點(diǎn)處進(jìn)針，鉤住下鼓室部位稍用力迅速將顳骨乳突部連同鼓膜整塊摘除，暴露出鼓岬及其前下方的蝸錐，摘除聽(tīng)骨，刺破兩窗膜(圓窗和卵圓窗)，用眼科剪剪開(kāi)耳蝸前方的薄層骨連接至顱內(nèi)，通過(guò)此口用耵聹鉤入顱內(nèi)向后外方骨折取出完整的內(nèi)耳標(biāo)本，剪去連接的顳肌， 找到大鼠耳蝸內(nèi)螺旋溝及內(nèi)毛細(xì)胞下方區(qū)域并取材。HBSS液沖洗幾次后剪碎，加入0.125%胰蛋白酶37℃消化30 min。中止反應(yīng)之后加入0.01% DNA 酶，吸管輕柔吹打成單細(xì)胞懸液。

1.6.2 耳蝸干細(xì)胞培養(yǎng) 無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)〔DMEM/F12(1∶1)液 +2% B27 + bFGF 20 μg/L+表皮生長(zhǎng)因子（EGF） 20 μg/L〕。待原代克隆形成后分離克隆制作單細(xì)胞懸液，按1×108/L 接種培養(yǎng)。7天后將其移至離心管中，500 r/min 離心， HBSS液洗滌，去上清，余液混勻，涂于多聚賴氨酸包被的載片上，晾干， 4%多聚甲醛固定。

1.6.3 耳蝸干細(xì)胞鑒定［1-2］ 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法，用抗巢蛋白抗體 (1∶200) 以及BrdU標(biāo)記內(nèi)耳干細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.7 耳蝸干細(xì)胞耳蝸內(nèi)移植 將中毒性耳聾模型鼠麻醉后，在無(wú)菌條件下，用微量注射器將經(jīng)BrdU標(biāo)記的內(nèi)耳干細(xì)胞沿耳蝸壁或者圓窗和卵圓窗注射入內(nèi)耳耳蝸結(jié)構(gòu)。對(duì)照組耳蝸內(nèi)注射生理鹽水，方法同上。

1.8 取材與觀察 移植4周后，取大鼠內(nèi)耳移植部位的組織，剪切，1%胰酶充分消化30 min，過(guò)濾，離心洗滌5 min，棄上清，沉淀以PBS制成細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)分析。制作實(shí)驗(yàn)動(dòng)物內(nèi)耳的組織切片及耳蝸鋪片，在熒光顯微鏡下觀察內(nèi)耳組織結(jié)構(gòu)的變化。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS軟件包進(jìn)行t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 內(nèi)耳干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 取自 P0大鼠內(nèi)耳的內(nèi)耳干細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中，鏡下觀察剛分離的單細(xì)胞呈圓形，大小不一，折光性好，懸浮在培養(yǎng)瓶中，無(wú)突起長(zhǎng)出。培養(yǎng)1天少數(shù)細(xì)胞伸出突起，3～4天貼壁的細(xì)胞突起伸長(zhǎng)，5～6天細(xì)胞的突起相連交織成網(wǎng)。將離心后的細(xì)胞重新制備成單細(xì)胞懸液，6～7天后可見(jiàn)大量懸浮的細(xì)胞團(tuán)形成，細(xì)胞團(tuán)中有很多生長(zhǎng)狀態(tài)良好的單個(gè)細(xì)胞，呈桑葚形狀。上述細(xì)胞球經(jīng)巢蛋白免疫熒光鑒定呈陽(yáng)性，表明分離培養(yǎng)的細(xì)胞是具有自我更新能力的干細(xì)胞。BrdU特異性標(biāo)記細(xì)胞核，細(xì)胞團(tuán)打散后，可觀察到大量BrdU標(biāo)記陽(yáng)性的干細(xì)胞，說(shuō)明這些細(xì)胞是具有增殖能力的內(nèi)耳干細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)后，有些克隆球自然貼壁， 并沿球體周圍伸出突起向四周呈放射狀延伸。細(xì)胞球貼壁后，少數(shù)細(xì)胞從球體遷移出來(lái)，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，呈三角形、錐形或多角形（圖1）。

2.2 內(nèi)耳組織CD4（+）T細(xì)胞計(jì)數(shù) 用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)分析，移植后內(nèi)耳組織CD4（+）T細(xì)胞占整個(gè)淋巴細(xì)胞百分比與移植前差異無(wú)顯著性〔（48±5）% vs. (45±6)%，P＞0.05〕。

2.3 內(nèi)耳的鏡下表現(xiàn) 在熒光顯微鏡下：生理鹽水組表現(xiàn)為毛細(xì)胞核消失，在毛細(xì)胞核的位置出現(xiàn)染色空白區(qū)； 而干細(xì)胞組發(fā)現(xiàn)有大量BrdU標(biāo)記陽(yáng)性的內(nèi)耳干細(xì)胞在移植區(qū)域，部分存活的內(nèi)耳干細(xì)胞遷移至耳蝸毛細(xì)胞表面， 形態(tài)上與內(nèi)、外毛細(xì)胞相似（圖2）。

3 討 論

Li等［3］在成年大鼠橢圓囊斑位置發(fā)現(xiàn)存在內(nèi)耳干細(xì)胞， 內(nèi)耳干細(xì)胞在體內(nèi)和體外培養(yǎng)可分化成毛細(xì)胞樣細(xì)胞，而且擁有高度的增生潛能和自我更新能力［4］。 Malgrange等［5］采用無(wú)血清培養(yǎng)基加絲裂原性生長(zhǎng)因子( EGF或bFGF)從P0大鼠耳蝸和內(nèi)耳螺旋溝區(qū)域分離培養(yǎng)出巢蛋白陽(yáng)性的神經(jīng)細(xì)胞球， 分裂后分化為耳蝸毛細(xì)胞和支持細(xì)胞， 提示這些巢蛋白陽(yáng)性細(xì)胞可能是出生后損傷的Corti 器內(nèi)新生毛細(xì)胞和支持細(xì)胞的來(lái)源。Ozeki等［6］也分別從E12和P5大鼠的耳泡和Corti器分離出永生化的毛細(xì)胞前體細(xì)胞系。

我們選擇在前期實(shí)驗(yàn)中已得到證實(shí)的內(nèi)耳Corti器位置取材，通過(guò)巢蛋白（早期神經(jīng)上皮細(xì)胞的標(biāo)志）以及BrdU（在細(xì)胞分裂前DNA的合成期，它可作為底物參與DNA的合成）標(biāo)記，證明我們?nèi)〔墨@得的細(xì)胞是具有增殖能力的干細(xì)胞。將獲得的內(nèi)耳干細(xì)胞移植前加BrdU（10 μmol/L）共培養(yǎng)72 h后，用微量注射器將耳蝸干細(xì)胞沿耳蝸壁或者圓窗和卵圓窗注射入內(nèi)耳耳蝸內(nèi)，鏡下觀察移植后4周大鼠內(nèi)耳組織。其中生理鹽水組表現(xiàn)為毛細(xì)胞核消失，在毛細(xì)胞核的位置出現(xiàn)染色空白區(qū)或毛細(xì)胞核腫脹，核體積明顯增大，染色變淡，且不均勻，有些腫脹細(xì)胞核外形不規(guī)則［7］，表明毛細(xì)胞損傷是中毒性耳聾的前提；而干細(xì)胞組可見(jiàn)大量BrdU標(biāo)記陽(yáng)性的干細(xì)胞從移植區(qū)域向周圍擴(kuò)散，部分存活的內(nèi)耳干細(xì)胞遷移至耳蝸毛細(xì)胞表面， 形態(tài)上與內(nèi)、外毛細(xì)胞相似， 移植的細(xì)胞團(tuán)外圍與受體膠原有很好的融合，表明移植的內(nèi)耳干細(xì)胞不僅能夠存活［8］，而且有一定的增殖能力。

用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)分析，內(nèi)耳組織CD4（+）T淋巴細(xì)胞的百分比與移植前沒(méi)有明顯變化，表明移植后排斥反應(yīng)較輕［9］。這主要是由于內(nèi)耳干細(xì)胞與其他干細(xì)胞一樣是一種非常原始的細(xì)胞，它們較低的免疫原性不會(huì)引起明顯的排斥反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：移植到中毒性耳聾模型大鼠內(nèi)耳的內(nèi)耳干細(xì)胞能夠向周圍擴(kuò)散、存活，而且有一定的增殖能力；移植的細(xì)胞團(tuán)外圍與受體膠原有很好的融合，表現(xiàn)為正常的毛細(xì)胞形態(tài)。至于這種表現(xiàn)為內(nèi)耳毛細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞能否重建毛細(xì)胞神經(jīng)連接， 恢復(fù)毛細(xì)胞功能，是我們后期研究的內(nèi)容。另外，由于屬于同種同源性移植［10-11］，加上內(nèi)耳干細(xì)胞又是一種非常原始的細(xì)胞，它的免疫原性較低，移植后的排斥反應(yīng)沒(méi)有想象的嚴(yán)重。

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細(xì)胞培養(yǎng)范文2

【關(guān)鍵詞】細(xì)胞培養(yǎng)室；技術(shù)服務(wù)與交流；培養(yǎng)室建設(shè)與管理

實(shí)驗(yàn)室是高等學(xué)校從事科研的重要基地，營(yíng)造一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)研究環(huán)境對(duì)實(shí)驗(yàn)室管理和建設(shè)起著至關(guān)重要的作用。實(shí)驗(yàn)室管理質(zhì)量的好壞，直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)研究是否進(jìn)展順利。良好的實(shí)驗(yàn)室建設(shè)，能給研究者帶來(lái)愉快的心情，同時(shí)也能有效的提高研究質(zhì)量。

細(xì)胞培養(yǎng)室是綜合實(shí)驗(yàn)室的一個(gè)重要組成部分, 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是生命科學(xué)各研究領(lǐng)域的一種最基本、最重要、也是應(yīng)用最廣泛的研究技術(shù)之一。對(duì)于高等醫(yī)學(xué)院校來(lái)說(shuō),各生物醫(yī)學(xué)相關(guān)學(xué)科均建有細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，其規(guī)模、檔次、技術(shù)水平、使用效率、管理模式、服務(wù)保障等方面都缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，普遍存在著小而全、投資分散、資金浪費(fèi)、缺乏有效管理、無(wú)法提供服務(wù)保障、不利于技術(shù)交流和創(chuàng)新等諸多問(wèn)題。本文總結(jié)了筆者在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室管理與建設(shè)方面的一些經(jīng)驗(yàn)，并與廣大同行進(jìn)行探討。

1 細(xì)胞培養(yǎng)室的服務(wù)職能

細(xì)胞培養(yǎng)除了需要嫻熟的操作技術(shù)外，更多的體現(xiàn)在培養(yǎng)技術(shù)的過(guò)程復(fù)雜，無(wú)菌要求嚴(yán)格。研究人員掌握該門(mén)技術(shù)的時(shí)間周期較長(zhǎng)。如果成天陷入清洗，包裝和消毒等簡(jiǎn)單繁瑣的勞動(dòng)中，就會(huì)影響研究人員專心致志地從事研究活動(dòng)中更重要的環(huán)節(jié)。建立大型細(xì)胞培養(yǎng)室，由專人進(jìn)行工作流程服務(wù)，實(shí)驗(yàn)室按研究人員的要求提供標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的實(shí)驗(yàn)用品和材料，可以極大地提高細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的成功率，確保實(shí)驗(yàn)器材符合細(xì)胞培養(yǎng)的要求，減少研究人員的無(wú)謂勞動(dòng)。因此可以將研究人員從煩瑣的勞動(dòng)中解放出來(lái)，安心從事更重要的研究活動(dòng)。

2 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)交流

細(xì)胞培養(yǎng)是一項(xiàng)通用的技術(shù)平臺(tái)。但針對(duì)各個(gè)研究課題而言，每個(gè)研究人員進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的目的和要求又各不相同，即既有共性，又有特殊性。一個(gè)學(xué)科自建的細(xì)胞培養(yǎng)室，一般僅局限于本學(xué)科領(lǐng)域內(nèi)有限的研究方向所必需的細(xì)胞培養(yǎng)方法和技術(shù)，對(duì)其它的特殊方法了解不多，因此不利于技術(shù)創(chuàng)新。即便是某個(gè)研究生掌握的新方法，常常由于畢業(yè)分配等原因離開(kāi)科室，而使新的特殊技術(shù)不復(fù)存在，不利于特殊技術(shù)的建立和完善。

如果大型細(xì)胞培養(yǎng)室面向全校開(kāi)放，自學(xué)科的研究人員中具有豐富科研經(jīng)驗(yàn)的研究人員、博士、碩士等不同層次、不同研究目的和不同要求，他們相互之間不存在利害關(guān)系，容易交流，毫無(wú)技術(shù)保留。每個(gè)人的經(jīng)驗(yàn)和教訓(xùn)很快為大家所用，可極大縮短技術(shù)學(xué)習(xí)的周期和提高新技術(shù)的交流。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室建立了技術(shù)檔案制度，不同學(xué)科的研究人員探索的新技術(shù)不會(huì)因走人而流失，可以極大地豐富和積累特殊技術(shù)，提高技術(shù)水平，為后來(lái)者提供更多的方便。

3 細(xì)胞培養(yǎng)室的建設(shè)

3．1 細(xì)胞培養(yǎng)室面積和房間安排 實(shí)驗(yàn)室的面積應(yīng)由實(shí)驗(yàn)臺(tái)的長(zhǎng)度、凈化工作臺(tái)的大小等儀器設(shè)備情況決定，同時(shí)還應(yīng)考慮科研及實(shí)驗(yàn)人員有足夠的空間，以便安全地進(jìn)行科研及實(shí)驗(yàn)活動(dòng)。此外,還應(yīng)設(shè)置面積不小于6 m2的緩沖間及與工作分開(kāi)的更衣柜等。如果細(xì)胞培養(yǎng)室面積大于一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)單元，至少應(yīng)有兩個(gè)出口，以隨時(shí)保持暢通。細(xì)胞室里的試驗(yàn)臺(tái)和儀器布局應(yīng)合理。一般來(lái)說(shuō)，二氧化碳培養(yǎng)箱和凈化工臺(tái)不應(yīng)對(duì)著門(mén)擺放，離心機(jī)不應(yīng)離得太遠(yuǎn)。

3．2 培養(yǎng)室的環(huán)境和設(shè)施 ① 照明以不影響對(duì)實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的各種現(xiàn)象的觀察為基準(zhǔn)，一般采用熒光燈。宜設(shè)置專門(mén)電力變壓器供電,提高供電質(zhì)量和可靠性；②房間裝修密閉性應(yīng)較高，且不宜開(kāi)設(shè)外窗，設(shè)窗主要為采光好，必要時(shí)還應(yīng)安裝空調(diào)。門(mén)、窗、墻表面應(yīng)涂布便于清洗去污和耐腐蝕的材料。由于細(xì)胞原代培養(yǎng)要求較高，設(shè)置空氣凈化裝置；③對(duì)于配制有毒的試劑，產(chǎn)生較大的氣味和有害氣體的實(shí)驗(yàn)應(yīng)在規(guī)范的通風(fēng)柜中操作。操作有放射性同位素的實(shí)驗(yàn),應(yīng)配備個(gè)人防護(hù)用品和淋浴室,其廢液應(yīng)妥善處理。

4 細(xì)胞培養(yǎng)室管理制度的建立

4．1 消毒清潔制度 ①每個(gè)進(jìn)入細(xì)胞室的工作人員應(yīng)保證其個(gè)人衛(wèi)生；②進(jìn)入緩沖間時(shí),應(yīng)更換潔凈的工作服和拖鞋,進(jìn)入培養(yǎng)室時(shí)須戴帽子和口罩。如做原代培養(yǎng),工作服應(yīng)消毒；③第一個(gè)進(jìn)入培養(yǎng)室的人員請(qǐng)及時(shí)開(kāi)啟空氣凈化裝置,最后離開(kāi)人員請(qǐng)關(guān)閉空氣凈化裝置；④每天實(shí)驗(yàn)前必須紫外線常規(guī)消毒1 h。每周一次衛(wèi)生消毒工作并做空氣細(xì)菌培養(yǎng)檢查。每月一次全面清潔工作。

4．2 培養(yǎng)箱的使用 ①每天觀察二氧化碳?jí)毫Ρ?及時(shí)更換二氧化碳鋼瓶。同時(shí)觀察二氧化碳流量指示表,同時(shí)培養(yǎng)箱內(nèi)應(yīng)放置一溫度計(jì),記錄其溫度與指示表溫度是否一致；②培養(yǎng)箱應(yīng)劃分不同區(qū)域，不同細(xì)胞應(yīng)放不同區(qū)域，同時(shí)保持適當(dāng)?shù)臐穸龋虎塾械呐囵B(yǎng)箱有高溫消毒功能，注意非管理人員不要?jiǎng)哟斯δ苕I，以免造成某些元件燒毀。

4．3 潔凈工作臺(tái)的使用 ①使用前1 h應(yīng)紫外線照射；②潔凈臺(tái)內(nèi)也應(yīng)劃分不同的區(qū)域，如材料區(qū)、操作區(qū)、污物區(qū)等；③注意安全，特別是酒精燈，如有酒精漏出應(yīng)立即吸干擦凈，如發(fā)生意外用紗布、棉布類蓋滅酒精燈；④ 實(shí)驗(yàn)完畢,所用過(guò)的器皿、雜物必須清理,同時(shí)進(jìn)行臺(tái)面清潔。

4．4 液氮瓶和低溫冰箱的管理 ①定期檢查液氮的容量，并做好記錄；②存、取細(xì)胞株時(shí)，注意防凍安全；③存放細(xì)胞株時(shí)，根據(jù)其種類不同，放置不同盒內(nèi)，同時(shí)應(yīng)標(biāo)記好名稱和時(shí)間并記錄；④低溫冰箱使用時(shí)應(yīng)按其種類劃分不同區(qū)域，做好標(biāo)記并記錄。

4．5 實(shí)驗(yàn)室資料管理制度 ①收集課題計(jì)劃書(shū)、實(shí)驗(yàn)路線、操作步驟、操作記錄，各種實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)及儀器說(shuō)明書(shū)等；②由負(fù)責(zé)人指定專人負(fù)責(zé)并督促不同時(shí)段內(nèi)完成。如果有不規(guī)范的資料，請(qǐng)有關(guān)人員及時(shí)糾正；③資料歸檔后的資料由專人統(tǒng)一管理。若有些課題涉及專利與發(fā)明等知識(shí)產(chǎn)權(quán)問(wèn)題，應(yīng)注意保密。

總之,隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,適應(yīng)高等醫(yī)學(xué)院校科研要求,如何建設(shè)好和管理好大型細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室對(duì)于促進(jìn)學(xué)校科學(xué)研究水平的提升是值得探討的課題。

參考文獻(xiàn)

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細(xì)胞培養(yǎng)范文3

關(guān)鍵詞：小鼠單核巨噬白血病細(xì)胞；細(xì)胞刮棒；高壓滅菌；酸堿度

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是目前很多醫(yī)學(xué)研究離不開(kāi)的技術(shù)，腫瘤細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)中占據(jù)核心的地位。腫瘤是對(duì)人類威脅最大的疾病之一，是研究癌變機(jī)制和抗癌藥物篩選的重要手段。腫瘤細(xì)胞雖具有無(wú)限增殖的特性，但并不表示培養(yǎng)起來(lái)很容易，很多因素都會(huì)影響到細(xì)胞的形態(tài)及功能。如：酸堿度、CO2濃度、環(huán)境溫度等。小鼠單核巨噬白血病細(xì)胞（RAW264.7）是炎癥研究中非常常見(jiàn)的研究對(duì)象，炎癥是伴隨多種疾病的并發(fā)癥，因此越來(lái)越受到重視。本文根據(jù)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)RAW264.7細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中的生活特性及影響因素，為細(xì)胞科研工作提幫助。

1 RAW264.7細(xì)胞研究

RAW264.7細(xì)胞是小鼠源性破骨前體細(xì)胞，該細(xì)胞株由Raschke WC等建立。它來(lái)自Abelson小鼠白血病病毒所致的腫瘤[1]。據(jù)知網(wǎng)上不完全統(tǒng)計(jì)，可以發(fā)現(xiàn)我國(guó)從1986年就已經(jīng)有對(duì) RAW264.7細(xì)胞的研究了[2]，至2014年共有2700余篇，截止2013年其研究趨勢(shì)，見(jiàn)圖1，可見(jiàn)RAW264.7細(xì)胞研究越來(lái)越受到重視，因此對(duì)于RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)需一個(gè)規(guī)范化的標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 RAW264.7細(xì)胞研究趨勢(shì)

2 RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)

RAW264.7是破骨前體細(xì)胞，因此在培養(yǎng)過(guò)程中很容易分化形成破骨細(xì)胞，另外 RAW264.7細(xì)胞也是一種巨噬細(xì)胞，具有很強(qiáng)的黏附和吞噬抗原的能力，很容易將外界環(huán)境中抗原吞噬，而發(fā)生分化，出現(xiàn)偽足現(xiàn)象，這是困擾科研工作者的一個(gè)難題。因此對(duì)RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)也是一個(gè)很長(zhǎng)時(shí)間摸索的過(guò)程。正常的RAW264.7細(xì)胞是圓形透亮的，而分化之后很容易產(chǎn)生觸角，此時(shí)細(xì)胞已經(jīng)在功能上發(fā)生改變，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在我國(guó)很多細(xì)胞庫(kù)給購(gòu)買(mǎi)者的建議是用0.25%的胰酶消化，因此我們采取了用0.25%的胰酶消化法來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)用一般的胰酶配制的0.25%的胰酶可以很快的將細(xì)胞消化下來(lái)，但是對(duì)細(xì)胞的損傷很大，細(xì)胞傳代之后在培養(yǎng)瓶中很難貼壁，很少貼壁的細(xì)胞，細(xì)胞棱廓也變得模糊不清，細(xì)胞再也很難恢復(fù)之前的狀態(tài)。根據(jù)很多培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞的科研工作者的經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為RAW264.7細(xì)胞很難用0.25%的胰酶消化這一說(shuō)法，一直困惑著我們。提示這種反差的現(xiàn)象也許跟胰酶的純度有關(guān)。于是我們改用細(xì)胞刮棒的方法進(jìn)行傳代，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)損傷較小，細(xì)胞在傳代2~4 h內(nèi)基本貼壁，且細(xì)胞狀態(tài)完好。具體方法是沿著細(xì)胞壁的一端順勢(shì)往另一端刮，力度要輕柔，能夠?qū)⒓?xì)胞刮掉即可。這里強(qiáng)調(diào)一定要輕，細(xì)胞是個(gè)很脆弱的個(gè)體，力度過(guò)大對(duì)細(xì)胞會(huì)造成物理?yè)p傷，嚴(yán)重時(shí)不能恢復(fù)其正常形態(tài)。對(duì)于RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基很多經(jīng)驗(yàn)者建議使用1640，中科院上海細(xì)胞庫(kù)則建議使用DMEM高糖培養(yǎng)基，胎牛血清可使用GIBCO胎牛血清，也可使用國(guó)產(chǎn)杭州四季清。因此我們對(duì)培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）的使用進(jìn)行了正交實(shí)驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)DMEM高糖培養(yǎng)基與GIBCO胎牛血清培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)最好，但對(duì)于資金短缺的科研工作者也可以使用DMEM高糖培養(yǎng)基與國(guó)產(chǎn)杭州四季清進(jìn)行培養(yǎng)，1640則需與GBICO胎牛血清配合使用，這樣才能保證細(xì)胞狀態(tài)圓而透亮。關(guān)于FBS是否滅活則需要根據(jù)你所買(mǎi)的FBS是否含有對(duì)細(xì)胞刺激較大的抗原決定，如有些杭州四季清含有低內(nèi)毒素，內(nèi)毒素是引起巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的激動(dòng)劑[3]，此時(shí)我們則需滅活，因此在購(gòu)買(mǎi)血清時(shí)應(yīng)盡量避免含有這類抗原的血清。血清購(gòu)買(mǎi)回來(lái)需及時(shí)分裝，分裝需在無(wú)菌條件下操作，然后置于-20℃保存。下面根據(jù)對(duì)RAW264.7培養(yǎng)研究，將細(xì)胞復(fù)蘇，細(xì)胞傳代以及細(xì)胞凍存的要點(diǎn)歸納如下。

2.1細(xì)胞復(fù)蘇 從液氮罐中取出凍存管，迅速將凍存管放到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋（37℃）中迅速解凍，不斷的搖動(dòng)，待凍存管內(nèi)液體完全溶解（控制在1 min內(nèi)），取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺(tái)內(nèi)，將凍存管內(nèi)的液體轉(zhuǎn)入15 mL離心管，加入2倍體積含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，800 rpm離心3 min，棄去上清液，重懸細(xì)胞，接種到培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，此時(shí)重點(diǎn)是細(xì)胞凍存本來(lái)就是對(duì)細(xì)胞的損傷，需采用的是20%的胎牛血清進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，第二次傳代后換成10%FBS培養(yǎng)。

2.2細(xì)胞傳代 待細(xì)胞長(zhǎng)至80%~90%時(shí)，從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞，小心吸出培養(yǎng)液，用PBS清洗，加入3 mL 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，用細(xì)胞刮棒沿一個(gè)方向輕輕的將細(xì)胞刮下來(lái)，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，800 rpm離心3 min，棄去上清液，加入培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，分裝入培養(yǎng)瓶后，放入培養(yǎng)箱37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，因?yàn)镽AW264.7細(xì)胞的增殖非常快，因此傳代比例根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)需要1∶3~1∶10均可。

2.3細(xì)胞凍存 待細(xì)胞長(zhǎng)至80%~90%時(shí)，按細(xì)胞傳代方法把細(xì)胞收集起來(lái)，將配制好的凍存液加入細(xì)胞中重懸，每管2 mL，凍存液的配制方法是：胎牛血清與二甲基亞砜（DMSO）的比例為9∶1，依次放在4℃中40 min，-20℃中40 min，-80℃中過(guò)夜，第2 d轉(zhuǎn)移至液氮灌中保存。

3影響RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)的因素

3.1培養(yǎng)基酸堿度 根據(jù)對(duì)RAW264.7的培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)酸堿度對(duì)于RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)影響最大，GBICO的DMEM建議在配制過(guò)程中加入3.7 g NaHCO3，中科院上海細(xì)胞庫(kù)建議加1.5 g NaHCO3，然后用1MHCL調(diào)pH至7.2～7.4，過(guò)濾分裝置在4℃冰箱備用。但是在冰箱里放置3 d或1 w后培養(yǎng)基就很容易變紫，但是很多研究者并沒(méi)有在意這個(gè)問(wèn)題，仍然用變紫的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，之后細(xì)胞就會(huì)出現(xiàn)漂浮或者變成梭形。文獻(xiàn)提示可采用HEPES法進(jìn)行緩沖[4]，我們研究發(fā)現(xiàn)雖然HEPES緩沖能力更強(qiáng)，培養(yǎng)基變堿的時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)，但放置時(shí)間久后仍然會(huì)變紫，通過(guò)比較可采用將HEPES配置成母液，過(guò)濾并分裝，然后每次傳代的時(shí)候用HEPES調(diào)節(jié)培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基調(diào)至所需的pH。

3.2培養(yǎng)耗材 RAW264.7細(xì)胞是一類巨噬細(xì)胞，因此對(duì)于接觸細(xì)胞的培養(yǎng)耗材如：槍頭、培養(yǎng)皿等要求需要高一些，研究發(fā)現(xiàn)高溫180℃烘干的耗材比120℃高壓滅菌的耗材培養(yǎng)的細(xì)胞，細(xì)胞的形態(tài)更圓更亮，提示盡量減少抗原有助于RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)，這與方瑤等研究發(fā)現(xiàn)相一致[5]。

4結(jié)論

RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)和研究已然成為一個(gè)趨勢(shì)，對(duì)于RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)也需要標(biāo)準(zhǔn)化的方法，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)RAW.264.7細(xì)胞的最佳優(yōu)化條件即：DMEM高唐培養(yǎng)基+10%FBS，細(xì)胞刮棒沿著一個(gè)方向輕輕刮取細(xì)胞，傳代的比例最佳為1∶4，采用過(guò)濾的HEPES每次實(shí)驗(yàn)時(shí)調(diào)節(jié)pH。細(xì)胞的培養(yǎng)本身就是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，只有細(xì)胞處于最佳狀態(tài)時(shí)才能給科研工作者帶來(lái)更可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此對(duì)于細(xì)胞的培養(yǎng)，我們更要花耐心和精力去呵護(hù)。

參考文獻(xiàn)：

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細(xì)胞培養(yǎng)范文4

【關(guān)鍵詞】高職院校；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)；教學(xué)改革

一、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)課程教學(xué)中存在的問(wèn)題

（一）課程的教學(xué)目標(biāo)與工作需求之間存在一定差距。高職教育應(yīng)注重培養(yǎng)學(xué)生的實(shí)踐操作能力，因此在實(shí)際的教學(xué)過(guò)程中也要以此為目標(biāo)進(jìn)行教學(xué)。但在實(shí)際的教學(xué)過(guò)程中，盡管學(xué)校安排的實(shí)踐教學(xué)的課時(shí)不少，但卻并沒(méi)有取得良好的教學(xué)效果，其原因在于教學(xué)的過(guò)程過(guò)于形式化，并沒(méi)有把培養(yǎng)綜合動(dòng)手能力這一具體教學(xué)目標(biāo)滲透到實(shí)踐教學(xué)中，并且，在該課程考試中，也偏重于對(duì)理論知識(shí)的考核，輕視對(duì)職業(yè)技能的考核。教學(xué)目標(biāo)并沒(méi)有完全納入整個(gè)課程的教學(xué)體系，不能有效滿足社會(huì)對(duì)人才的需求。

（二）課程的教學(xué)內(nèi)容與實(shí)踐工作聯(lián)系不緊密。在課程的實(shí)踐教學(xué)內(nèi)容中，普遍存在著設(shè)計(jì)性、綜合性實(shí)驗(yàn)較少的問(wèn)題，新的知識(shí)和技術(shù)不能有效的運(yùn)用于實(shí)驗(yàn)中，這就造成了學(xué)習(xí)內(nèi)容與工作內(nèi)容相脫離的現(xiàn)象。不利于學(xué)生日后的工作發(fā)展。

（三）課程的保障設(shè)施不足制約教學(xué)進(jìn)一步深入。細(xì)胞培訓(xùn)課程需要良好的配套設(shè)施來(lái)支撐整個(gè)教學(xué)計(jì)劃，然而，目前高職院校普遍存在著教學(xué)實(shí)踐設(shè)備不足、缺乏現(xiàn)代化生產(chǎn)模型的問(wèn)題。并且，在校外實(shí)訓(xùn)環(huán)節(jié)，由于缺乏與實(shí)際一線工廠的聯(lián)系和溝通，學(xué)生在實(shí)訓(xùn)場(chǎng)合沒(méi)有太多的鍛煉機(jī)會(huì)，這些都制約著課程的推進(jìn)和學(xué)生實(shí)踐能力的提升。

（四）課程的實(shí)踐教學(xué)環(huán)節(jié)管理不規(guī)范。高職院校對(duì)學(xué)生的實(shí)踐過(guò)程未能實(shí)現(xiàn)全程管理，缺乏對(duì)學(xué)生的實(shí)時(shí)指導(dǎo)，學(xué)生在實(shí)踐環(huán)節(jié)中主要依靠自覺(jué)性進(jìn)行自我鍛煉。管理的不科學(xué)、不深入、不具體造成了很多學(xué)生在實(shí)習(xí)中敷衍了事，影響了整體的教學(xué)質(zhì)量。

二、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)踐教學(xué)的設(shè)計(jì)理念

（一）細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)課程的具體定位。高職院校的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)課程應(yīng)立足于市場(chǎng)，深入探究當(dāng)前農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、食品加工等行業(yè)的具體需求，依托自身的資源優(yōu)勢(shì)，培養(yǎng)符合企業(yè)要求的具有高素質(zhì)技能的人才。

（二）細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)課程的未來(lái)崗位技能需求。通過(guò)對(duì)高職院校學(xué)生就業(yè)情況、生物科技行業(yè)發(fā)展情況、企業(yè)崗位的需求情況的調(diào)研，市場(chǎng)上主流的關(guān)鍵技能為動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、生物檢測(cè)技術(shù)、分離純化技術(shù)。專業(yè)的設(shè)置要充分滿足企業(yè)對(duì)專業(yè)技能的需求，只有這樣才能真正提高學(xué)生的職業(yè)技能。

（三）細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)課程的教學(xué)設(shè)計(jì)思路。搭建開(kāi)放性和職業(yè)性的實(shí)踐平臺(tái)，充分體現(xiàn)專業(yè)內(nèi)涵，著重培養(yǎng)學(xué)生的職業(yè)能力素養(yǎng)。實(shí)踐的內(nèi)容要嚴(yán)格基于工作過(guò)程需求，并在此基礎(chǔ)上改變過(guò)去單一學(xué)校的教育模式，積極實(shí)施校企合作的教學(xué)理念，讓學(xué)生在學(xué)校期間就能切實(shí)體會(huì)到工作環(huán)境和氛圍，從而提升細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的教學(xué)質(zhì)量。

三、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)課程的教學(xué)新體系的建立

（一）立足企業(yè)產(chǎn)品，設(shè)計(jì)教學(xué)活動(dòng)。以疫苗為例，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的課程未來(lái)的就業(yè)方向其中很有分量的一份工作就是生產(chǎn)疫苗。目前，疫苗的生產(chǎn)主要依托于雞胚成纖維細(xì)胞進(jìn)行。所以，在課程的實(shí)踐教學(xué)活動(dòng)中要以雞胚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)為側(cè)重點(diǎn)，以具體的崗位要求為標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)置相應(yīng)的教學(xué)體系。

（二）以工作過(guò)程為導(dǎo)向，設(shè)計(jì)教學(xué)的具體任務(wù)。以企業(yè)雞胚成纖維細(xì)胞疫苗的生產(chǎn)為例，要結(jié)合具體的生產(chǎn)崗位需求，按照生產(chǎn)流程，把細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)課程分解為六個(gè)部分。分別為雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)準(zhǔn)備工作、雞胚成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)、雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的檢測(cè)、雞胚成纖維細(xì)胞的傳代培養(yǎng)、雞胚成纖維細(xì)胞的病變培養(yǎng)、雞胚成纖維細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇六項(xiàng)具體任務(wù)。通過(guò)細(xì)化培訓(xùn)任務(wù)，把教學(xué)目標(biāo)融入到實(shí)際的教學(xué)環(huán)節(jié)中，進(jìn)一步培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度，培養(yǎng)學(xué)生分析和解決問(wèn)題的能力，鍛煉學(xué)生的創(chuàng)新意識(shí)和職業(yè)能力，為學(xué)生適應(yīng)好日后的工作打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

（三）以教學(xué)做一體化為核心，設(shè)計(jì)教學(xué)模式。所謂教學(xué)做一體化是指重點(diǎn)培養(yǎng)學(xué)生的自主學(xué)習(xí)能力，以學(xué)生為主體，在教師的主導(dǎo)下，通過(guò)實(shí)踐活動(dòng)鍛煉學(xué)生的創(chuàng)新意識(shí)和職業(yè)素養(yǎng)。在具體的教學(xué)實(shí)踐中，以行動(dòng)為導(dǎo)向，以任務(wù)為驅(qū)動(dòng)，拓寬實(shí)踐教學(xué)的渠道，從感知理解到學(xué)以致用，充分激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)熱情，營(yíng)造和諧有序的學(xué)習(xí)氛圍。

四、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)課程的教學(xué)體系的組織和落實(shí)

（一）校企合作共同開(kāi)發(fā)課程的實(shí)踐內(nèi)容和目標(biāo)。改變傳統(tǒng)的教材編寫(xiě)模式，采用校企合作的方式，以具體的工作流程為主線，以工作任務(wù)為載體，嚴(yán)格按照企業(yè)的崗位需求進(jìn)行編寫(xiě)實(shí)踐教學(xué)內(nèi)容，使教學(xué)與工作不分離，使教學(xué)更有針對(duì)性。

（二）具體教學(xué)任務(wù)的開(kāi)展。緊緊圍繞教學(xué)目標(biāo)，把具體的工作任務(wù)細(xì)化為七個(gè)步驟，第一，教師講解工作任務(wù)和工作方式；第二，學(xué)生根據(jù)具體任務(wù)組建團(tuán)隊(duì)，并策劃出具體工作方案；第三，將團(tuán)隊(duì)工作方案進(jìn)行匯報(bào)，經(jīng)教師指導(dǎo)進(jìn)一步完善實(shí)施方案；第四，在教師指導(dǎo)下，開(kāi)展團(tuán)隊(duì)工作；第五，團(tuán)隊(duì)進(jìn)行內(nèi)部總結(jié)和交流；第六，班級(jí)內(nèi)開(kāi)展團(tuán)隊(duì)間的交流與溝通；第七，以團(tuán)隊(duì)為單位進(jìn)行教學(xué)實(shí)踐活動(dòng)總結(jié)。

（三）搭建開(kāi)放式教學(xué)實(shí)踐平臺(tái)。開(kāi)放式教學(xué)是產(chǎn)學(xué)研相結(jié)合人才培養(yǎng)模式，是指在時(shí)間、地點(diǎn)、內(nèi)容、手段等方面全方位的向?qū)W生開(kāi)發(fā)的教學(xué)模式。高職院校與企業(yè)合作，運(yùn)用實(shí)際的企業(yè)項(xiàng)目進(jìn)行教學(xué)實(shí)踐，由學(xué)生分組進(jìn)行，采取教師帶隊(duì)、組長(zhǎng)負(fù)責(zé)的原則，利用課余時(shí)間開(kāi)展項(xiàng)目研究，并定期對(duì)項(xiàng)目進(jìn)展做出報(bào)告，最終實(shí)現(xiàn)項(xiàng)目的成功研發(fā)。

五、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)課程的教學(xué)評(píng)價(jià)體系

科學(xué)的教學(xué)評(píng)價(jià)體系不僅是對(duì)教學(xué)實(shí)踐的監(jiān)控，更重要的是有利于激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，培養(yǎng)學(xué)生的職業(yè)素養(yǎng)、創(chuàng)新精神和團(tuán)隊(duì)精神。根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)課程的自身特點(diǎn)，考核體系主要分為四個(gè)部分，即常規(guī)教學(xué)部分，開(kāi)放實(shí)踐教學(xué)部分、專門(mén)考核部分和獎(jiǎng)勵(lì)部分。結(jié)合技能評(píng)價(jià)、定量評(píng)價(jià)、校企合作評(píng)價(jià)等方式完善評(píng)價(jià)體系。

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)課程的改革任重而道遠(yuǎn)，需要學(xué)校、企業(yè)、學(xué)生三方的密切配合，不斷深化改革，切實(shí)實(shí)現(xiàn)教學(xué)做一體化，推動(dòng)高職院校的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)課程的教學(xué)培養(yǎng)質(zhì)量，為社會(huì)輸送高素質(zhì)的人才。

細(xì)胞培養(yǎng)范文5

羊水細(xì)胞培養(yǎng)是產(chǎn)前診斷的一個(gè)重要技術(shù)手段，主要應(yīng)用于胎兒染色體疾病的產(chǎn)前診斷。由于羊水中存活細(xì)胞比較少、培養(yǎng)周期長(zhǎng)、無(wú)菌要求和技術(shù)要求高，容易失敗，使羊水細(xì)胞培養(yǎng)在產(chǎn)前診斷的應(yīng)用受到限制。針對(duì)以上情況，近年來(lái)我們吸取了國(guó)內(nèi)外的一些先進(jìn)經(jīng)驗(yàn)[1，2]，結(jié)合自身的條件，與相關(guān)科室進(jìn)行合作，對(duì)羊水細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，并對(duì)1 200例孕15～30周孕婦進(jìn)行了羊水細(xì)胞培養(yǎng)的產(chǎn)前診斷，取得了理想效果。

對(duì)象與方法

1.對(duì)象：選取2003年7月至2005年12月在河南省新鄉(xiāng)市婦幼保健院接受產(chǎn)前羊水細(xì)胞培養(yǎng)檢查的孕婦共計(jì)1 200例，常規(guī)羊水細(xì)胞培養(yǎng)(常規(guī)組)和高效改良羊水細(xì)胞培養(yǎng)(改良組)均抽取600例。來(lái)診孕婦按1∶1的比例隨機(jī)分成2組。常規(guī)組年齡分布(28.8±3.6)歲，孕周分布孕15～24周，平均(20.2±2.8)周，改良組年齡分布(28.5±3.7)歲，孕周分布15～24周，平均(20.3±2.7)周，2組年齡、孕周比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本次高效改良羊水細(xì)胞培養(yǎng)科研項(xiàng)目經(jīng)過(guò)新鄉(xiāng)市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)施行。

2.檢驗(yàn)方法：對(duì)羊水細(xì)胞培養(yǎng)后在顯微鏡下進(jìn)行觀察，檢查染色體情況，進(jìn)行染色體異型性分析。根據(jù)分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)量。(1)常規(guī)羊水細(xì)胞培養(yǎng)。取妊娠16～20周的羊水10～20 ml，注入10 ml離心管中，1 000 r/min心10 min，棄去上清液，留0.5～1.0 ml輕輕吹打成細(xì)胞懸液，移入25 ml培養(yǎng)瓶中，加入pH值為6.8的F10培養(yǎng)液3 ml和血清1 ml，置37 ℃溫箱中靜置培養(yǎng)5～6 d，見(jiàn)纖維或上皮樣細(xì)胞生長(zhǎng)，以后每天或隔天觀察一次，一般培養(yǎng)8～14 d，細(xì)胞進(jìn)入旺盛生長(zhǎng)期[3]。(2)高效改良羊水細(xì)胞培養(yǎng)。穿刺抽取羊水25 ml，然后分別取10 ml注入2只20 ml試管中，高速離心(1 000 r/min)8 min，上清液棄去，每只試管中留4～5 ml制備成細(xì)胞混懸液。在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液4 ml，緩慢滴入細(xì)胞混懸液，恒溫(37.5 ℃)靜置。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，一般6～9 d細(xì)胞生長(zhǎng)最為旺盛，可以收獲細(xì)胞。收獲前30 min，滴定秋水仙素終末濃度2 mg/L。收獲先后進(jìn)行離心，低滲，固定和制片程序。標(biāo)本經(jīng)過(guò)老化后用胰酶染色并消化，然后在顯微鏡下觀察。我們于10倍目鏡和10倍物鏡下觀察。以梭長(zhǎng)形羊水細(xì)胞為主要類型的生長(zhǎng)細(xì)胞，形成的細(xì)胞克隆覆蓋1個(gè)或1個(gè)以上的完整視野;培養(yǎng)瓶中有2～3個(gè)以上細(xì)胞克隆，且每個(gè)細(xì)胞克隆中存在有20個(gè)以上的圓形、雙圓形或葡萄狀透亮細(xì)胞，細(xì)胞核大而圓，細(xì)胞圓而大，明亮如一片明珠，相互聯(lián)接，細(xì)胞克隆中央的細(xì)胞開(kāi)始老化，克隆周邊細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)時(shí)間，鏡下觀察后，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)記錄，然后進(jìn)行計(jì)數(shù)資料的χ2檢驗(yàn)。

結(jié)果

1.2組培養(yǎng)時(shí)間比較：常規(guī)組的總體培養(yǎng)時(shí)間為9～14 d，平均(11.0±2.6) d;改良組的總體培養(yǎng)時(shí)間6～10 d，平均(7.5±2.3) d。改良組培養(yǎng)時(shí)間和常規(guī)組相比較明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

2.成功率比較：改良組羊水細(xì)胞培養(yǎng)的成功率為95.8 %(575/600)，常規(guī)組成功率為37.7 %(226/600)，改良組羊水細(xì)胞培養(yǎng)的成功率明顯高于常規(guī)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2 =4.25，P

3.分裂相檢出率比較：改良組分裂相平均每例為(93.6±22.1)個(gè)，常規(guī)組分裂相為(53.2±19.9)個(gè)，改良組分裂相的檢出率明顯高于常規(guī)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.95，P

4.異常檢出率比較：改良組發(fā)現(xiàn)異常核型12例，其中21-三體綜合征6例(50.0 %)，18-三體綜合征3例(25.0 %)，其他3例(25.0 %)，總陽(yáng)性率為2.0 %(12/6 000)。常規(guī)組發(fā)現(xiàn)異常核型4例，其中21-三體綜合征2例(50.0 %)，18-三體綜合征2例(25.0 %)，其他2例(25.0 %)，總陽(yáng)性率為0.7 %(4/6 000)。改良組異常核型檢出率高于常規(guī)組，但是2組檢出的異常核型的比例基本相同，都分別是21-三體綜合征50.0 %，18-三體綜合征25.0 %，其他25.0 %，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2 =4.12，P

討論

羊水細(xì)胞培養(yǎng)法是1966年首先應(yīng)用于臨床胎兒染色體疾病的產(chǎn)前診斷并獲得成功的[4]，此后廣泛應(yīng)用并成為目前產(chǎn)前診斷的重要技術(shù)手段[5];然而其無(wú)菌要求、恒溫要求、培養(yǎng)接種和收獲技巧比較高，容易失敗。在此基礎(chǔ)上，我們結(jié)合臨床實(shí)際，對(duì)該方法進(jìn)行了改良：(1)增加抽取羊水量;(2)2只試管離心;(3)細(xì)胞懸液量增加;(4)收獲前30 min，滴定秋水仙素終末濃度2 mg/L。收獲先后進(jìn)行離心，低滲，固定和制片程序。標(biāo)本經(jīng)過(guò)老化后用胰酶染色并消化。經(jīng)改良后提高了效率，并且在臨床應(yīng)用中取得了良好的效果。

普通羊水細(xì)胞培養(yǎng)法和高效改良羊水細(xì)胞培養(yǎng)法都是比較安全可靠的產(chǎn)前診斷方法。高效改良羊水細(xì)胞培養(yǎng)法的培養(yǎng)時(shí)間可以縮短3～4 d，培養(yǎng)成功率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通羊水細(xì)胞培養(yǎng)法，而且分裂相，異常核型的發(fā)現(xiàn)比率等技術(shù)指標(biāo)都高于普通羊水細(xì)胞培養(yǎng)法，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值，值得在臨床推廣應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

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2馬長(zhǎng)俊，陳園茶，霍沛丹.羊水培養(yǎng)與染色體制片方法[J].生殖與避孕，1985，5:23.

3程在玉，主編.醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)基礎(chǔ)與臨床[M].青島：青島出版社，1993.75.

細(xì)胞培養(yǎng)范文6

膠原是動(dòng)物體內(nèi)含量最豐富的蛋白質(zhì)，屬于不溶性纖維蛋白質(zhì)，遍布于體內(nèi)各種器官和組織，如皮膚、骨、軟骨、肌腱、角膜等等。明膠（Gelatin. Gel），是膠原的部分變性衍生物，無(wú)抗原性，生物相容性好，可生物降解[7]。

甲殼素是一種天然高分子化合物，屬于多糖。殼聚糖（Chitosan, CS）, 是甲殼素的脫乙酰化產(chǎn)物，是細(xì)胞外基質(zhì)中糖胺聚糖結(jié)構(gòu)類似物。殼聚糖是一種具有優(yōu)良生物相容性的可降解材料，其在哺乳動(dòng)物體內(nèi)能被溶菌酶降解成氨基糖，氨基糖可以進(jìn)入糖胺聚糖和糖蛋白的代謝循環(huán)，也可以排除體外。它還具有低抗原性、促進(jìn)傷口愈合，抗菌等特性。此外殼聚糖是帶正電荷的線性多糖，它可與帶負(fù)電的生物大分子，如明膠形成聚電解質(zhì)配合物。殼聚糖還具有較好的力學(xué)性能，而且易于加工成型。綜合明膠和殼聚糖的優(yōu)點(diǎn)，將殼聚糖和明膠復(fù)合制備多孔支架材料, 將能滿足對(duì)支架材料的要求[8-10]。

目前，氣管組織工程研究的方法是在體外的支架材料上培養(yǎng)氣道平滑肌細(xì)胞(airwaysmooth muscle cell, ASMC )，形成有功能的組織。本實(shí)驗(yàn)研究在不同條件下制備殼聚糖-明膠三維支架的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，以及平滑肌細(xì)胞在支架中生長(zhǎng)的狀態(tài)，為篩選可作為氣道組織工程研究用的材料奠定基礎(chǔ)。

2 材料和方法明

明 膠（ Sigma Chemical Co. ） ； 殼聚糖（HaiHui Bioengineering Co. ） ； 溶菌酶（7000u/mg,Biosharp,Japan）；戊二醛(分析純,成都科龍化工試劑)；醋酸（分析純，成都科龍化工試劑）；DMEM/F-12 培養(yǎng)基（Hyclone, USA）；胎牛血清(Sigma, USA)；培養(yǎng)用三蒸水；細(xì)胞培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板（Costar，USA）；MTT（Sigma, USA）；FITC-Phalloidin（Sigma,USA）。

2.1 制備三維殼聚糖-明膠支架 2.2 結(jié)構(gòu)觀察

用掃描電子顯微鏡（SEM，TESCAN VEGA ?? LMU）對(duì)支架的架構(gòu)進(jìn)行觀察。在使用SEM 觀察支架之前，先用液氮冷凍支架的表面和部分使之?dāng)嗔?然后噴涂上金。支架孔的平均直徑作為支架的有效孔徑。隨機(jī)選擇每個(gè)樣品的三個(gè)不同區(qū)域，至少選擇20 個(gè)孔測(cè)量孔徑。

2.3 孔隙度的測(cè)量 支架浸入量筒后，原正己烷和支架的總體積記為（V2）。取出支架后，剩余的正己烷體積記為（V3）。支架的孔隙度ε 可以通過(guò)以下公式獲得：ε（%）=（V1－V3）／(V2－V3) [13]。

2.4 大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng) 2.5 細(xì)胞在殼聚糖-明膠三維支架中的增殖 2.6 免疫熒光染色

將細(xì)胞種植于三維支架材料上以后，選擇適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，對(duì)細(xì)胞骨架進(jìn)行染色。實(shí)驗(yàn)步驟： 2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)都反復(fù)進(jìn)行4 次，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差表示，n=4。組間數(shù)據(jù)采用χ2 分析，p<0.01 表示差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；p<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)算、統(tǒng)計(jì)軟件采用Originpro7.5 及ImageJ 1.4g program。

3 結(jié)果

3.1 預(yù)凍溫度和材料濃度對(duì)支架微結(jié)構(gòu)的影響 比較不同的預(yù)凍溫度，最高的孔隙度為93±0.6 %，其預(yù)凍溫度為-196℃。而同樣的預(yù)凍溫度下，濃度為2wt%和3wt%的支架的孔隙度降為90±0.6%和84±4.7%（表1）。在-20℃、-80℃的預(yù)凍溫度下，孔隙度有著同樣的變化趨勢(shì)，而相比于-196℃的預(yù)凍溫度，孔隙度都降低了，顯示出孔隙度取決于材料的預(yù)凍溫度和濃度。

凍干過(guò)程是在冰點(diǎn)以下使材料中冰晶升華，形成與原冰晶同樣尺度的孔徑。在較低的預(yù)凍溫度下，由于冷凍速度較快，形成數(shù)量較多和體積細(xì)小的冰晶，導(dǎo)致凍干材料孔徑較小，孔壁較薄，孔隙度較大。在預(yù)凍溫度較高時(shí)，冰晶可以不斷生長(zhǎng)，形成數(shù)量較少和體積較大的晶體，導(dǎo)致凍干材料孔徑較大，孔壁較厚，孔隙度較小 [19]。而溶液的濃度直接影響溶液的粘度。當(dāng)溶液濃度較大即粘度較大時(shí)，不利于水和分子鏈的遷移，以至于形成的冰晶較小。

因此孔徑與溶液的濃度成反比[13]。

3.2 細(xì)胞在支架中的生長(zhǎng)

通過(guò)掃描電鏡來(lái)觀察平滑肌細(xì)胞在材料上的生長(zhǎng)。由圖2 可以看出，細(xì)胞接種到三維支架上以后，能貼附到支架上，在細(xì)胞數(shù)較少的情況下，細(xì)胞更趨向于沿著孔壁生長(zhǎng)。多孔結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢(shì)在于為細(xì)胞提供了足夠的生長(zhǎng)空間和更大的附著面積, 同時(shí)有利于營(yíng)養(yǎng)成分的進(jìn)入和代謝產(chǎn)物的排出而不致引起細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用[20]。培養(yǎng)6 天的時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞在支架上黏附生長(zhǎng)良好，但細(xì)胞并未完全伸展。同時(shí)細(xì)胞沒(méi)有鋪滿孔壁，還較少向孔中生長(zhǎng)。

3.3 MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖

通過(guò)MTT 實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)試氣道平滑肌細(xì)胞在材料中的細(xì)胞活性。細(xì)胞在材料中的生長(zhǎng)受到多種因素的影響，包括表面結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)等。把等量的細(xì)胞種植于支架中。由圖3 可見(jiàn)，隨著時(shí)間的增加OD 值也隨之增加，說(shuō)明細(xì)胞在材料中生長(zhǎng)良好。同時(shí)有圖3 可以看出，支架的微結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞的增殖情況有一定的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著支架孔徑以及孔隙度的增大，時(shí)間的延長(zhǎng)， 細(xì)胞的增殖情況良好。而且孔隙度對(duì)細(xì)胞增殖的影響較為顯著（*p<0.01,**p<0.05）, 說(shuō)明支架的孔徑對(duì)細(xì)胞的增殖起著重要的作用，然而支架的孔隙度在細(xì)胞增殖過(guò)程中起著更為顯著和決定性作用。

3.4 免疫熒光染色