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纖維素水解范文1

關(guān)鍵詞：小麥秸稈；糖化發(fā)酵；NaOH預(yù)處理

中圖分類號(hào)：TQ353 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）18-4355-04

第二代生物質(zhì)乙醇是利用不同的原料如木材、農(nóng)業(yè)或者森林廢棄物來生產(chǎn)，纖維素乙醇作為一種重要的可再生能源，具有能夠支撐全球能源消耗20%～100%的潛力。在纖維素乙醇的生產(chǎn)過程中非常重要的一步就是將半纖維素和纖維素水解為單糖，目前最具發(fā)展前景的水解方法為纖維素酶水解。為了使纖維素酶能夠與纖維素有效接觸，需要在水解之前對(duì)木質(zhì)纖維素材料進(jìn)行預(yù)處理，解除木質(zhì)素、半纖維素等對(duì)纖維素的保護(hù)作用，同時(shí)破壞纖維素的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，增加其比表面積[1]，從而提高纖維素的水解糖化效率。

NaOH溶液的潤漲處理是發(fā)現(xiàn)最早、應(yīng)用最廣的預(yù)處理手段之一，其處理溫度和壓力都低于其他預(yù)處理手段[2]。NaOH預(yù)處理打開了交聯(lián)木質(zhì)素和木聚糖的酯鍵，能夠部分溶解原料中的木質(zhì)素、半纖維素，降低纖維素的結(jié)晶度，同時(shí)增大了木質(zhì)素材料的比表面積，能夠得到較高的酶解糖化率，是一種較為有效的預(yù)處理方法[3]。

本試驗(yàn)使用NaOH溶液對(duì)小麥秸稈進(jìn)行預(yù)處理，分別研究了NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)、小麥秸稈固體含量、預(yù)處理時(shí)間等因素對(duì)小麥秸稈纖維素酶水解過程的影響，得到了最佳的NaOH預(yù)處理?xiàng)l件，之后對(duì)經(jīng)最佳條件預(yù)處理后的小麥秸稈進(jìn)行了同步糖化發(fā)酵試驗(yàn)，并在電子顯微鏡下觀察了預(yù)處理前后的秸稈結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)一步明確了NaOH預(yù)處理的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 小麥秸稈取自太湖農(nóng)村，機(jī)器收割，不含秸稈根部和麥穗。

1.1.2 酶制劑 纖維素酶購自Sigma公司，為淡黃色液體纖維素酶。

1.1.3 酵母菌 試驗(yàn)所用酵母為釀酒酵母BY4742， 于4 ℃下保存。

1.2 方法

1.2.1 小麥秸稈預(yù)處理 小麥秸稈粉碎后過80目篩，烘箱中55 ℃干燥，設(shè)置不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaOH、小麥秸稈固體含量及預(yù)處理時(shí)間，在121 ℃、0.2 MPa的條件下在高壓滅菌鍋中進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理結(jié)束后冷卻至室溫，加入適量的稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至中性，之后使用高速離心機(jī)進(jìn)行離心并清洗3～5次。預(yù)處理后的小麥秸稈于105 ℃烘干，保存于干燥皿中備用。

1.2.2 纖維素酶水解 分別取未經(jīng)預(yù)處理以及經(jīng)NaOH預(yù)處理的秸稈各4.0 g，定容至100 mL，根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果[4]，選取纖維素酶投加量為30 FPU/g秸稈，溫度40 ℃，檸檬酸鹽調(diào)節(jié)pH為4.8，共水解120 h，每隔24 h取樣1次，離心后取上清液進(jìn)行HPLC分析。

1.2.3 同步糖化發(fā)酵 根據(jù)本課題組關(guān)于同步糖化發(fā)酵條件的研究，分別取未經(jīng)預(yù)處理以及最優(yōu)條件下NaOH預(yù)處理后的秸稈各1.6 g，確定固體含量為0.16 g/mL，纖維素酶投加量為35 FPU/g秸稈，酵母菌濃度8 g/L，檸檬酸鹽調(diào)節(jié)pH為4.0，溫度設(shè)置為38 ℃，同步糖化發(fā)酵120 h，每隔24 h取樣分析。

1.3 分析方法

1.3.1 小麥秸稈成分分析 小麥秸稈纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量的測(cè)定采用NREL實(shí)驗(yàn)室提供的方法[5]。

1.3.2 還原糖及乙醇含量測(cè)定 樣品中纖維二糖、葡萄糖、木糖、乙醇濃度采用Shimadzu高效液相色譜分析儀檢測(cè)，檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器，色譜柱為Aminex HPX-87P Column。檢測(cè)條件：柱溫65 ℃，檢測(cè)器溫度60 ℃，流動(dòng)相為超純水，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。

1.3.3 小麥秸稈結(jié)構(gòu)分析 采用電鏡掃描觀察。樣品在室溫風(fēng)干之后平鋪于導(dǎo)電膠上，進(jìn)行離子濺射金處理45 s，用JSM-7401F場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察。

1.3.4 計(jì)算公式 纖維素水解產(chǎn)生葡萄糖的化學(xué)方程式如方程式（1）所示，理論上，100 g纖維素水解可產(chǎn)生111.1 g葡萄糖。葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇的化學(xué)方程式如方程式（2）所示，理論上，100 g葡萄糖發(fā)酵可產(chǎn)生51.1 g乙醇和48.9 g CO2。由此可知，100 g纖維素理論上可產(chǎn)生56.8 g乙醇。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同NaOH預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)小麥秸稈酶解效果的影響

2.1.1 NaOH對(duì)小麥秸稈酶解效果的影響 本試驗(yàn)首先考察了不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaOH預(yù)處理?xiàng)l件下，纖維素酶水解小麥秸稈的效果。分別以0.25%、0.50%、1.00%、2.00%和4.00%的NaOH溶液預(yù)處理已粉碎干燥的小麥秸稈，之后進(jìn)行120 h的水解試驗(yàn)，并每隔24 h取樣進(jìn)行還原糖含量分析。經(jīng)不同NaOH溶液預(yù)處理后小麥秸稈水解產(chǎn)物中還原糖情況如圖1所示。預(yù)處理過的小麥秸稈經(jīng)過酶解后，主要產(chǎn)生了纖維二糖、葡萄糖、木糖3種還原糖，由圖1可以看出，隨預(yù)處理NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，酶解液的還原糖含量逐漸升高，其產(chǎn)量均在NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.00%時(shí)達(dá)到最高，其中葡萄糖含量在酶水解48 h時(shí)達(dá)到最高，為14.13 g/L。之后NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大時(shí)，還原糖產(chǎn)量開始下降，可能因?yàn)樵陬A(yù)處理過程中NaOH溶解半纖維素和木質(zhì)素的同時(shí)也水解了部分纖維素，還原糖進(jìn)入了液相，在進(jìn)行固液分離時(shí)損失[6-8]。

2.1.2 固體含量對(duì)小麥秸稈酶解效果的影響 本試驗(yàn)設(shè)置預(yù)處理時(shí)的小麥秸稈固體含量分別為0.025、0.050、0.100、0.150和0.200 g/mL，采用在“2.1.1”方法中確定的NaOH預(yù)處理最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.00%對(duì)小麥秸稈進(jìn)行預(yù)處理，之后進(jìn)行120 h的酶解試驗(yàn)，每24 h取樣測(cè)定其還原糖含量。不同固體含量下NaOH預(yù)處理產(chǎn)物中還原糖含量如圖2所示。由圖2可見，預(yù)處理過程中在小麥秸稈固體含量提高到0.050 g/mL時(shí)，酶解液中的3種還原糖含量均達(dá)到最高。其中葡萄糖在纖維素酶水解48 h時(shí)其濃度達(dá)到最大值14.13 g/L。之后固體含量繼續(xù)增大時(shí)，其還原糖產(chǎn)量下降。分析其原因可能是預(yù)處理過程中固體含量對(duì)預(yù)處理強(qiáng)度產(chǎn)生影響，固體含量過高時(shí)，因NaOH溶液的量相對(duì)減少，難以與秸稈充分接觸，從而影響了預(yù)處理效果[9，10]。

2.1.3 預(yù)處理時(shí)間對(duì)小麥秸稈酶解效果的影響 本試驗(yàn)設(shè)置預(yù)處理時(shí)間分別為15、30、50、60和90 min，采用“2.1.1”方法得到的預(yù)處理最佳NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.00%和“2.1.2”方法得到的最佳固體含量0.050 g/mL對(duì)小麥秸稈進(jìn)行預(yù)處理，之后進(jìn)行120 h酶解，每隔24 h取樣測(cè)定其還原糖產(chǎn)量。不同預(yù)處理時(shí)間下3種還原糖的產(chǎn)量如圖3所示。

由圖3可見，隨著預(yù)處理時(shí)間的增加，小麥秸稈酶解液3種還原糖含量在60 min時(shí)達(dá)到最大。其中葡萄糖濃度在酶水解24 h后達(dá)到最大值15.30 g/L。預(yù)處理50 min以上時(shí)，NaOH溶液對(duì)木質(zhì)素和半纖維素的溶解基本完成，纖維素充分暴露出來，預(yù)處理時(shí)間增加到60、90 min時(shí)，酶解產(chǎn)生還原糖的濃度變化不大，考慮到增加預(yù)處理時(shí)間會(huì)顯著增加能耗，故將60 min確定為最佳預(yù)處理時(shí)間。

2.2 NaOH預(yù)處理對(duì)小麥秸稈酶解效果的影響

通過上述試驗(yàn)可以得到NaOH預(yù)處理小麥秸稈的最佳條件為NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.00%，小麥秸稈固體含量0.050 g/mL，預(yù)處理時(shí)間60 min。將經(jīng)過預(yù)處理的小麥秸稈殘?jiān)附?20 h，其反應(yīng)進(jìn)程見圖4。

由圖4可知，在最佳預(yù)處理?xiàng)l件下，酶解24 h時(shí)，酶解液總還原糖產(chǎn)量達(dá)到最大，為34.65 g/L，其產(chǎn)率為86.61%。而未經(jīng)預(yù)處理的小麥秸稈在酶解剛開始時(shí)總還原糖產(chǎn)量便開始下降，最高僅為4.80 g/L，其產(chǎn)率僅為12.01%。最佳預(yù)處理?xiàng)l件下的總還原糖產(chǎn)率也明顯高于常規(guī)的稀堿預(yù)處理的總還原糖產(chǎn)率[3]。這是因?yàn)镹aOH預(yù)處理對(duì)半纖維素和木質(zhì)素均有較好的去除效果，解除了木質(zhì)素和半纖維素對(duì)纖維素的保護(hù)作用，同時(shí)破壞纖維素大分子之間的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，增大了小麥秸稈的比表面積，改善了底物與纖維素酶的接觸效果，同時(shí)也有效減少了木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的特異性吸附，使纖維素酶可以充分作用于底物，有效提高了小麥秸稈的酶解效果[11，12]。

2.3 小麥秸稈成分分析

使用NREL實(shí)驗(yàn)室的方法分別測(cè)定未經(jīng)NaOH預(yù)處理的小麥秸稈與經(jīng)過最優(yōu)條件預(yù)處理過的小麥秸稈成分，結(jié)果如表1所示。由表1可見，小麥秸稈在經(jīng)過了最優(yōu)條件預(yù)處理后，木質(zhì)素的含量由25.73%降低至11.75%，同時(shí)纖維素的含量由39.31%升高至58.84%。表明NaOH能夠提高纖維素在底物中所占比例，同時(shí)降低木質(zhì)素等所占比例[13]，有利于后續(xù)酶解進(jìn)程。

2.4 同步糖化發(fā)酵結(jié)果

未經(jīng)NaOH預(yù)處理的小麥秸稈與經(jīng)過最佳條件預(yù)處理的小麥秸稈經(jīng)同步糖化發(fā)酵后上清液成分如表2所示。

由表2可見，未經(jīng)NaOH預(yù)處理的小麥秸稈由于結(jié)晶以及木質(zhì)結(jié)構(gòu)的保護(hù)，酶解過程受到抑制，進(jìn)而影響了酵母菌對(duì)還原糖的發(fā)酵。而經(jīng)過最佳NaOH預(yù)處理?xiàng)l件處理后，乙醇的產(chǎn)量大幅上升，由處理前的7.98 g/L上升到38.32 g/L，乙醇產(chǎn)率由22.40%上升至71.70%，無法被酵母菌利用的木糖含量也由處理前的0.80 g/L上升到了12.94 g/L。

由此可見，NaOH預(yù)處理不僅能夠有效去除木質(zhì)素，而且基本不影響纖維素[14]，纖維素可以進(jìn)一步水解并發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，NaOH預(yù)處理是一種高效的木質(zhì)纖維素產(chǎn)乙醇的預(yù)處理方法。

2.5 NaOH預(yù)處理前后小麥秸稈結(jié)構(gòu)分析

小麥秸稈粉末在NaOH溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.00%、固體含量0.050 g/mL、121 ℃、0.2 MPa的條件下預(yù)處理60 min，恢復(fù)至室溫干燥后備用。同時(shí)準(zhǔn)備一份未經(jīng)預(yù)處理的小麥秸稈粉末，干燥后備用。樣品平鋪在導(dǎo)電膠上，噴金45 s后用掃描電鏡觀察，其SEM結(jié)果如圖5所示。

由圖5可見，未經(jīng)NaOH預(yù)處理的小麥秸稈表面光滑，纖維排列比較整齊，沒有明顯的破損和孔隙，結(jié)構(gòu)致密。經(jīng)過NaOH預(yù)處理后的小麥秸稈的半纖維素、纖維素和木質(zhì)素的部分結(jié)構(gòu)遭到破壞、分離，纖維和纖維束出現(xiàn)卷曲和折疊，變得柔軟疏松，排列凌亂；秸稈表面由預(yù)處理前的致密變得疏松，有序排列變得雜亂無章；原來光滑的表面上出現(xiàn)了片狀的物質(zhì)，這可能是溶出的半纖維素和木質(zhì)素[15]。經(jīng)過預(yù)處理的小麥秸稈的比表面積大大增加，這更有利于纖維素酶的吸附，有利于水解，從而提高了酶水解液中還原糖的得率。

3 結(jié)論

1）NaOH預(yù)處理小麥秸稈的最佳條件為：NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.00%，小麥秸稈固體含量0.050 g/mL，預(yù)處理時(shí)間60 min。

2）經(jīng)過NaOH預(yù)處理的小麥秸稈水解液還原糖得率可提升74.60個(gè)百分點(diǎn)。

3）通過SEM觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過NaOH預(yù)處理后，秸稈表面變得粗糙，有利于纖維素酶的吸附及進(jìn)一步水解。

4）經(jīng)過最佳條件NaOH預(yù)處理的小麥秸稈進(jìn)行同步糖化發(fā)酵其乙醇產(chǎn)率提高了49.30個(gè)百分點(diǎn)。

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纖維素水解范文2

關(guān)鍵詞：木質(zhì)纖維素；纖維素酶；纖維素酶解

DOI：10.16640/ki.37-1222/t.2017.10.185

1 引言

木質(zhì)纖維素原料來源十分廣泛，是儲(chǔ)量豐富的可再生資源[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年生產(chǎn)該類物質(zhì)約200×109噸，其中有90%以上是木質(zhì)纖維素類物質(zhì)，而它們當(dāng)中有8～20×109仍具有潛在的可利用性[2]。包括農(nóng)業(yè)廢棄物（秸稈、蔗渣等）如何處理，對(duì)環(huán)境壓力以及可再生能源的利用具有現(xiàn)實(shí)意義。因此，在生物燃料、生物基化學(xué)品、分子材料、食品等領(lǐng)域這些廉價(jià)及豐富的木質(zhì)纖維素，都具有廣泛的應(yīng)用空間。

纖維素的結(jié)構(gòu)單位時(shí)D-葡萄糖，其分子式為：（C6H10O5）n，式中n為葡萄糖基數(shù)目，稱為聚合度。經(jīng)長期研究，已證實(shí)天然纖維素中D-葡萄糖基以吡喃環(huán)的形式存在，并且相互以β-1，4糖苷鍵構(gòu)成分子鏈，因?yàn)檫@對(duì)吡喃式D-葡萄糖具有最低的能態(tài)，這也是其二聚物（纖維二糖）及共衍生物的真正形式。由于葡萄糖上帶有多個(gè)羥基，因此纖維素分子間容易形成氫鍵，進(jìn)而使得鏈與鏈之間氫鍵緊密連接易于聚集成結(jié)晶性的原纖結(jié)構(gòu)。如圖1所見，大量氫鍵網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中存在著相對(duì)規(guī)則的結(jié)晶區(qū)，其阻礙了纖維素分子的進(jìn)一步利用，故纖維素水解前需進(jìn)行預(yù)處理，破壞它的氫鍵及結(jié)晶區(qū)，以便更好地水解纖維素，從而增加它的酶可及面積。

2 纖維素酶作用機(jī)理

纖維素酶是指能夠水解纖維素β-1，4-糖苷鍵，進(jìn)而生成葡萄糖的一類酶的總稱，它是由幾種酶共同協(xié)同作用，而不是單一的酶，其中主要包括外切葡聚糖酶（CBH，C1）、內(nèi)切葡聚糖酶（EG，Cx）和β-葡萄糖苷酶（CB，纖維二糖酶）。長期的研究表明，結(jié)晶纖維素的徹底降解至少需要這3組纖維素酶的協(xié)同作用，如圖2所示，Cx能容易地降解接近類型的纖維素或衍生物，Cx只有和C1組分結(jié)合時(shí)才可以利用晶形式的纖維素。C1酶首先作用于結(jié)晶纖維素表面，使其形成結(jié)晶構(gòu)的纖維素鍵斷開，長鏈分子末端游離，從而其轉(zhuǎn)化成可被Cx酶作用的形式，Cx酶水解非結(jié)晶或纖維素、可溶性纖維素轉(zhuǎn)化為纖維二糖，最后由β-葡萄糖苷酶將纖維二糖、三水解為葡萄糖。

3 單一纖維素組分作用機(jī)理

（1）內(nèi)切葡聚糖酶（EG或Cx）。Cx酶作用于纖維素的β-1，4葡萄糖苷鍵，隨機(jī)切割，產(chǎn)生大量纖維素的還原性末端。測(cè)定Cx酶活力方法較多，通用的方法是利用羧甲基纖維素鈉（CMC）作為底物測(cè)其酶活，由于它是一種高聚合度的可溶性纖維素衍生物，還原性所占比例較少，纖維素酶易于作用β-1，4葡萄糖苷鍵。

（2）外切葡聚糖酶（CBH，C1）。C1酶是指切割有Cx酶所產(chǎn)生的纖維素分子還原性末端，能夠是纖維素長鏈釋放出葡萄糖及小分子的寡糖。

有研究表明，已知外切葡聚糖酶具有2個(gè)獨(dú)立的活性結(jié)構(gòu)域：其一是指具有催化纖維素功能的結(jié)構(gòu)域CD，其二是指具有結(jié)合纖維素功能的結(jié)合于CBD，二者由高度糖基化鏈相連接。查閱大量文獻(xiàn)指出，C1對(duì)纖維素結(jié)晶區(qū)破壞作用極大，能夠產(chǎn)生纖維二糖。其原因是首先是利用CBD把C1吸附在纖維素結(jié)晶區(qū)表面，其次再由單根葡聚糖鏈（纖維素）快速準(zhǔn)確地進(jìn)入CD中帶底物結(jié)合和催化部位的“隧道”，纖維二糖被準(zhǔn)確地從葡聚糖鏈上切割下來并被釋放出來的同時(shí)，C1分子沿著葡聚糖鏈向前滑動(dòng)2個(gè)葡萄糖單位[3]。

（3）β-葡萄糖苷酶（CB，纖維二糖）。CB酶又稱β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，它能夠作用于結(jié)合在末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，水解生成部分β-D-葡萄糖以及相應(yīng)的配基。在水相系統(tǒng)中，CB酶能水解纖維二糖及一些聚合度小于6的纖維糊精為葡萄糖，隨著聚合度的增加，水解效果顯著下降。

4 總結(jié)

木質(zhì)纖維素廣泛的來源，如農(nóng)業(yè)廢棄物、餐廚垃圾以及部分工業(yè)殘余物等，可通過預(yù)處理和水解發(fā)酵轉(zhuǎn)化為能源物質(zhì)。在此基礎(chǔ)上，需要在理論研究做出深入解釋，以便更好的應(yīng)用于實(shí)踐。

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纖維素水解范文3

關(guān)鍵詞：羧甲基纖維素酶；濾紙酶；β-葡萄糖苷酶；曲霉A25

中圖分類號(hào) S154 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2016）08-22-04

Abstract：67 strains of soil bacteria were isolated form farmland，from which a high-yielding cellulase strain was screened.These strains were inoculated on the cellulose medium，and a preliminary screening was conducted，in which we measured hydrolysis transparent circle and the ratio of the size of the colony under pH5.5 and 28℃ conditions by using the Congo Red staining.Furthermore，these selected strains were cultured，and a crude enzyme liquid was extracted for analyzing the activities of carboxymethyl cellulose（CMC），filter paper enzyme（FP）and β-glucosidase（BG）.Under different temperature conditions，the activity of cellulase was determined，and ultimately this one strain of Aspergillus A25 was obtained.Its great activity is under the condition of optimum temperature for 50 ℃.Producing cellulose enzyme activity was as following：CMC amounted to 2 340.92 U/mL，F(xiàn)P activity amounted to 2.66 U/mL，and BG activity amounted to 164.72 U/mL.

Key words：Cerboxymethl cellulose；Filter paper enzyme；β- glucosidase；Aspergillus A25

纖維素物質(zhì)是地球上含量最豐富的碳水化合物[1]，而目前人類對(duì)纖維素的開發(fā)與利用還非常有限，因此如何更有效地開發(fā)和利用纖維素資源已成為當(dāng)今世界的熱門課題之一。目前，對(duì)纖維素的降解利用主要是用酸堿處理等化學(xué)手段，以及汽爆及蒸汽加熱等物理手段[2]。生物法由于對(duì)設(shè)備要求低，分解后的產(chǎn)物易回收利用，以及對(duì)環(huán)境污染較小等特點(diǎn)而備受重視。纖維素是一個(gè)復(fù)雜酶系，根據(jù)其功能的不同可分為3類：作用于纖維素非結(jié)晶區(qū)的內(nèi)切葡聚糖酶（CMC）；作用于無定型區(qū)切割糖苷鍵的外切葡聚糖酶（FP）；以及作用于纖維二糖的β-葡萄糖苷酶（BG）[3-5]。協(xié)同作用才能將結(jié)構(gòu)復(fù)雜的天然纖維降解。纖維素酶在食品、洗滌、紡織、飼料、造紙等方面具有廣泛的應(yīng)用和發(fā)展前景[5]。通過對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的67株菌株進(jìn)行初篩和復(fù)篩，A25這一株菌株是本次實(shí)驗(yàn)所篩選的，具有較高降解纖維素活力的菌株，本文對(duì)其纖維素酶的生產(chǎn)培養(yǎng)特性進(jìn)行研究，對(duì)于了解其降解機(jī)制以及實(shí)際應(yīng)用都有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料 從農(nóng)田土壤中分離得到67株土壤細(xì)菌。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNS法標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 稱0.05g經(jīng)105℃烘干至恒重的葡萄糖溶于少量蒸餾水中，用蒸餾水定溶至500mL配制成濃度為50μg/mL的葡萄糖溶液。取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL和1.2mL葡萄糖溶液再加入蒸餾水將體積配制至10mL。再分別從中取2mL，再加蒸餾水1.0mL再加DNS試劑2.0mL搖勻，置于沸水中煮沸5min，取出置與冷水中冷卻到室溫，測(cè)其OD530值。根據(jù)OD值，以葡萄糖濃度為縱坐標(biāo)，吸光值為橫坐標(biāo)，列出直線回歸方程（Y=aX+b）。

1.2.2 產(chǎn)纖維素酶菌株的培養(yǎng) 在無菌條件下，將67株菌株接種到纖維素培養(yǎng)基中，放在培養(yǎng)箱里溫度為28℃，培養(yǎng)48h。

1.2.3 剛果紅染色 把培養(yǎng)好的霉菌用剛果紅染色劑覆蓋培養(yǎng)皿一層進(jìn)行染色30min。然后用0.9%生理鹽水沖洗2～3次，觀察其透明圈的大小，并計(jì)算出H/C的比值即酶活，（酶活性=透明圈直徑的值與菌落直徑的比值）。根據(jù)比值的大小進(jìn)行初步篩選。

1.2.4 粗纖維酶液的制備 在無菌操作下，將初步篩選的7株霉菌分別接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)3～4d，溫度為28℃，轉(zhuǎn)速為160r。

1.2.5 纖維素酶發(fā)酵液的處理 纖維素酶霉菌搖瓶培養(yǎng)好后，用循環(huán)水式抽濾機(jī)進(jìn)行抽濾。將濾液轉(zhuǎn)入到原三角燒瓶中，放入冰箱備用。

1.2.6 酶活力的測(cè)定 采用DNS法（3，5-二硝基水楊酸比色法）[6-7]。

1.2.7 羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）酶活力測(cè)定 以2.0mL 20%（w/v）羧甲基纖維素鈉溶液為底物，用pH5.0檸檬酸緩沖液配制）。加1mL稀釋酶液于50℃，恒溫水浴反應(yīng)30min，然后加入2mL DNS顯色液，終止反應(yīng)，煮沸5min，再放入冰水中冷卻至室溫。用722S分光光度計(jì)在530nm處測(cè)定光密度OD值，同時(shí)相同條件作空白樣調(diào)零。

1.2.8 濾紙（FP）酶活力測(cè)定 精確吸取4.0mL稀釋酶液和1.0mL pH4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液，置于試管中，加入新華5號(hào)濾紙條（1×3cm）一條，滴入甲苯2～3滴防腐。40℃反應(yīng)24h。吸取上述濾紙酶液2.0mL加入蒸餾水1.0mL，2.0mL DNS顯色液，終止反應(yīng)。沸水煮沸5min，然后再放入冷水中冷卻至室溫。在530nm處測(cè)定光密度OD值，同時(shí)相同條件下作空白調(diào)零。

1.2.9 β-葡萄糖酶（BG）活法測(cè)定 取1.0mL稀釋酶液加2.0mL pH4.6乙酸-乙酸鈉緩沖液配制的1%的水楊酸溶液，50℃酶解30min，加入2.0mL DNS顯色液，終止反應(yīng)，于沸水中水浴5min，用冷水冷卻至室溫，在530nm處測(cè)定其OD值，同時(shí)相同條件下作空白調(diào)零。

1.4 濾紙崩潰實(shí)驗(yàn) 取稀釋酶液4.0mL和1.0mL pH4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液置于試管中。（15×50cm）加入新華5號(hào)濾紙條（1×3cm）一條，滴入甲苯2～3滴（防腐），于恒溫箱內(nèi)40℃保溫24h。觀察濾紙崩潰情況，觀測(cè)標(biāo)準(zhǔn)如下：+++表示濾紙完全沉在底部，搖動(dòng)試管后濾紙呈糊狀；++表示濾紙完全下沉，搖后呈小片狀；+表示濾紙沿底部呈毛狀，搖后部分溶化；-表示濾紙直立完整無缺，搖后不溶化。

1.5 還原糖含量的測(cè)定 采用DNS法[9]測(cè)還原糖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)纖維素酶菌株的初篩 將67株菌株接種到羧甲基固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)48h，用剛果紅染色靜止30min后測(cè)其H/C的比值，結(jié)果見表2。

從本實(shí)驗(yàn)室保存的67株菌株中，將各菌株分別采用纖維素固體培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)并進(jìn)行篩選，從中篩選出高產(chǎn)纖維素酶菌株。從表2這些菌株的透明圈的直徑與菌落的直徑比值大小可以看出，A25、A5、O7、O8O9、D2、H7、HD的H/C比值較高，這7株產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)，紅色水解透明圈較明顯、較大，具有較高的纖維素酶活力。H/C是透明圈與菌落的比值，比值越大酶活越強(qiáng)。根據(jù)紅色水解透明圈出現(xiàn)的快慢、大小可大致得出該菌株的產(chǎn)纖維素酶情況，這可作為初次判斷的依據(jù)。通過表2的結(jié)果說明A25、A5、O7、O8O9、D2、H7、HD7株菌株具有較高的酶活力。

2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參照1.2.1所描述的方法制備出標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線（圖1），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線求出直線回歸方程y=0.003 4x-0.505，R2=0.996 8（y：葡萄糖濃度，x：OD530的值），通過直線回歸方程可以計(jì)算纖維素酶酶促反應(yīng)中產(chǎn)生葡萄糖的濃度，從而根據(jù)酶活力單位定義算出酶活。

2.3 高產(chǎn)纖維素酶菌株的復(fù)篩 挑選上述試驗(yàn)中濾紙酶活性較高的7個(gè)菌株進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)，將所獲得的菌株A25、A5、O7、0809、D2、H7、HD菌株接到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行搖床發(fā)酵培養(yǎng)后，在獲得發(fā)酵液的基礎(chǔ)上制得粗酶液。測(cè)定其濾紙酶活、CMC酶活和β-葡萄糖苷酶活。各菌株均設(shè)3個(gè)處理，取其平均值，如表3。

2.4 溫度對(duì)酶促反應(yīng)的影響 溫度對(duì)酶促反影響的原因主要有以下2個(gè)方面，一是溫度對(duì)酶蛋白穩(wěn)定性的影響，即對(duì)酶熱變性失活作用，二是溫度對(duì)酶促反應(yīng)本身的影響，其中可能包括影響酶和底物的結(jié)合，影響Vmax，影響酶和底物分子解離基團(tuán)的pK，影響酶與抑制劑、激活劑或輔酶的結(jié)合等[8]。吸粗酶液2mL和2mL DNS和1mL蒸餾水加入試管分別于40℃、50℃、60℃、70℃和80℃不同水浴鍋中處理30min后，對(duì)菌體的酶活進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果見圖2。由圖2可見，反應(yīng)溫度對(duì)菌株A25的酶活有顯著影響，其最適酶活溫度為50℃，當(dāng)水浴處理溫度高于50℃或低于50℃時(shí)，該菌株A25酶活減弱，但是培養(yǎng)液仍具有較高的纖維素酶活力；同時(shí)也表明該菌株所產(chǎn)的纖維素酶具有較高熱穩(wěn)定性。可見，50℃所測(cè)得的酶活力最高，即此酶的最適酶活溫度為50℃。

3 討論

3.1 高產(chǎn)纖維素酶菌株的初篩 纖維素在纖維素酶的作用下水解成纖維二糖和葡萄糖，水解后的糖類與剛果紅染料形成紅色沉淀，使產(chǎn)酶菌株的菌落周圍出現(xiàn)清晰的紅色水解圈，根據(jù)水解圈的大小可粗略的估計(jì)菌株產(chǎn)酶的情況，然后選取透明圈較大的菌株進(jìn)行接種。剛果紅是對(duì)纖維素酶進(jìn)行初步篩選的試驗(yàn)方法，實(shí)驗(yàn)方法比較簡(jiǎn)單。通過它可以使纖維素固體培養(yǎng)基上的菌種的代謝產(chǎn)物形成淺紅色水解透明圈。用剛果紅染液覆蓋培養(yǎng)皿一層靜止染色30min，纖維素酶菌株產(chǎn)纖維素酶越多，產(chǎn)生的紅色水解透明圈越大，產(chǎn)纖維素酶速度越快，淺紅色水解透明圈出現(xiàn)的越早。雖然水解透明圈H/C的比值大小直接反映了酶活水平的高低，但不能完全代表菌株產(chǎn)酶能力，不能定量說明該菌株產(chǎn)纖維素酶的能力。也有研究表明液體樣品的酶濃度與透明圈的直徑（下轉(zhuǎn)127頁）（上接24頁）成線性關(guān)系，可以對(duì)酶活進(jìn)行初步定量[10]。

3.2 高產(chǎn)纖維素酶菌株的復(fù)篩 已知纖維素酶的作用方式：CO酶是使天然纖維素晶體分鏈，起一個(gè)分離和水合作用，從而使天然纖維素裂解成為直鏈纖維素；而C0酶雖不能水解天然纖維素，但能水解直鏈纖維素的β-l，4-葡萄糖苷鍵生成纖維二糖，纖維二糖再經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解成為葡萄糖。前人研究認(rèn)為，纖維素的降解關(guān)鍵是濾紙酶活的高低，再結(jié)合β-葡萄糖苷酶活，而CMC酶活只作參考。通過對(duì)7個(gè)菌株發(fā)酵液的濾紙酶活、CMC酶活、β-葡萄糖苷酶活進(jìn)行測(cè)定，初步篩選出產(chǎn)纖維素酶活力較高的A25菌株。初步試驗(yàn)表明，在50℃反應(yīng)時(shí)間30min，pH5.5時(shí)A25菌株產(chǎn)生的纖維素酶的活性有較大提高。建議對(duì)A25進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化試驗(yàn)，以探明其最適的產(chǎn)酶條件，或?qū)ζ溥M(jìn)行進(jìn)一步的誘變，以提高其酶活性應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。

3.3 溫度對(duì)纖維素酶活性的影響 從粗酶液中吸粗酶液2mL和2mL DNS和1mL蒸餾水加入試管中，在不同的水浴溫度下水浴處理30min后，對(duì)菌體的產(chǎn)酶量進(jìn)行檢測(cè)。為了確定酶活的最適溫度，通過測(cè)40～80℃不同溫度下的實(shí)驗(yàn)確定酶活，不同培養(yǎng)溫度對(duì)纖維素酶有不同的影響，結(jié)果表明，曲霉A25水浴處理在40℃時(shí)酶活力表現(xiàn)較低，50℃時(shí)酶活力達(dá)到最大值，水浴處理溫度超出50℃時(shí)酶活力逐漸變小。對(duì)于纖維素酶活的最適溫度為50℃，即纖維素酶產(chǎn)量的最適溫度在50℃。

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纖維素水解范文4

關(guān)鍵詞：生物乙醇 纖維素酶 工程菌株

The study and development progress of Bio-ethanol and cellulase production

Liping Yang1 Shuiwen Cai1 Ling Luo1 Hui Liu1，2

1. Changsha Environmental Protection and Professional technique College, 410004 2 Hunan

2. Agricultural university, 410128, Changsha, China

Abstract: With the fossil fuels from shortage to exhaustibility, the humanity is facing toward a common problem in energy crisis. Finding new energy sources is important to sustainable economic development and even human survival. Bio-ethanol, as an energy source that is renewable, affordable, and environmentally safe, will become a substitute for oil. Elevation of cellulase production and reduction of the cellulase production cost are the key factor for enhancing the market competitiveness of cellulosic bioethanol. In this paper, we discussed the development progress of bio-ethanol and cellulose industry to provide a basis for the future upgrading of bio-ethanol production industry and the development of gene engineering strain.

Keywords: bio-ethanol cellulose engineering strain

隨著石化燃料由短缺變成枯竭，能源危機(jī)是人類面臨的共同問題。1998年，Campbell和Laherrere對(duì)石油儲(chǔ)備和未開發(fā)的石油進(jìn)行評(píng)估后認(rèn)為，天然油在2010年前的產(chǎn)量就開始下降，到2050年全球每年石油供應(yīng)量將從目前的25億桶下降到5億桶[1]。隨著石化燃料供應(yīng)的減少，尋找新的能量來源關(guān)系到經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展乃至人類的生存問題。生物乙醇作為一種可再生的、經(jīng)濟(jì)上可承受的，并且對(duì)環(huán)境安全的能源物質(zhì)將逐漸成為石油的替代品[2]。生物乙醇的生產(chǎn)經(jīng)歷了以1代淀粉原料生產(chǎn)乙醇和以木質(zhì)纖維素為代表的非淀粉原料的2代生物乙醇工業(yè)。2代生物乙醇生產(chǎn)克服不與食品的供應(yīng)之間存在競(jìng)爭(zhēng)，但是纖維素酶產(chǎn)量低、不穩(wěn)定、難以工業(yè)化導(dǎo)致2代生物乙醇的生產(chǎn)成本大大提高。本文從生物乙醇產(chǎn)業(yè)發(fā)展過程、木質(zhì)纖維質(zhì)物質(zhì)生產(chǎn)生物乙醇的市場(chǎng)前景及纖維素降解酶的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為生物乙醇生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)的提升、纖維素工程菌的研發(fā)提供基礎(chǔ)。

生物乙醇產(chǎn)業(yè)發(fā)展過程

從上世紀(jì)80年代開始，人們就開始以谷物為原料來生產(chǎn)乙醇用作供氧燃料，這些被業(yè)內(nèi)稱為第1代燃料乙醇的原料。在一些國家，如美國、加拿大、巴西、中國等，乙醇已經(jīng)被廣泛地?fù)饺氲狡椭衼泶婕兤褪褂茫渲幸掖嫉捏w積含量可達(dá)到10%。最近美國正在實(shí)施一項(xiàng)混合燃油計(jì)劃E85，即汽車制造商生產(chǎn)一種可使用乙醇混合物E85（85% 的乙醇和15% 的汽油按體積比混合）的汽車[3]。巴西早在1929年就建立了一項(xiàng)利用乙醇作為發(fā)動(dòng)機(jī)燃料的計(jì)劃，并在接下來幾年里安裝了第一個(gè)使用乙醇作為燃料的發(fā)動(dòng)機(jī)。1984年，巴西要求新生產(chǎn)的汽車能使用水化生物乙醇（96%的生物乙醇+4%的水）作為燃料[3]。混合燃料的使用不僅可以減少汽油的使用量，還可以降低溫室效應(yīng)氣體以及有毒氣體的釋放。

但是隨著世界人口的不斷增長，以谷物等第1代淀粉原料生產(chǎn)乙醇就與食品的供應(yīng)之間存在競(jìng)爭(zhēng)，這些谷物為原料生產(chǎn)乙醇就不能滿足全球的需求。中國在過去三十年中GDP的年平均增長量為10%，這使得中國成為世界上最大的燃料消費(fèi)國之一，同時(shí)也成為世界上造成空氣污染最嚴(yán)重的國家。由于大部分的能源由燃燒化石燃料提供，中國政府正努力解決諸如國內(nèi)因迅速枯竭的石油和天然氣資源而越來越依賴進(jìn)口石油來滿足國內(nèi)一半的實(shí)際需求[4]，以及嚴(yán)重的環(huán)境污染等問題。為了改善現(xiàn)狀，中國政府決定增加使用能源的種類，尤其提倡使用可再生的、排放更少溫室氣體的燃料，如乙醇這樣的生物燃料和生物柴油。由于生物燃料從諸如玉米、木薯、大豆這樣的農(nóng)產(chǎn)品中提取而來，這對(duì)改善中國農(nóng)村人口的經(jīng)濟(jì)狀況有積極影響。除了向乙醇生產(chǎn)者發(fā)放津貼以鼓勵(lì)乙醇的生產(chǎn)之外，中國政府近年來也強(qiáng)制要求中國十個(gè)省份必須銷售濃度為10%的乙醇汽油，這些措施使得中國2008年的乙醇產(chǎn)量迅速達(dá)到14.6億升且在2010年達(dá)到21.5億升，一舉成為繼美國和巴西之后的世界第三乙醇生產(chǎn)大國。盡管中國政府之前要求到2020年國內(nèi)乙醇的年消費(fèi)量要達(dá)到100億升，然而由于擔(dān)心乙醇生產(chǎn)可能與食物生產(chǎn)行業(yè)形成競(jìng)爭(zhēng)，且考慮到國內(nèi)農(nóng)村可用耕地?cái)?shù)量有限，以及水資源供應(yīng)短缺的問題，中國政府于2007年宣布暫停國內(nèi)谷物乙醇的生產(chǎn)。

為了解決這個(gè)矛盾，以木質(zhì)纖維素為代表的非淀粉原料成為生物乙醇生產(chǎn)的重要原料物質(zhì)。木質(zhì)纖維素，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有三種：纖維素35%～37%、半纖維(23-25%)和木質(zhì)素(18-22%)組成。每年光合可產(chǎn)生大于1，500億噸的植物干物質(zhì)，其中一半以上是纖維素和半纖維素[5]。另外，人類活動(dòng)產(chǎn)生的廢棄物中也含有大量的纖維素，如農(nóng)業(yè)廢物( 稻草、稻殼、麥稈、花生殼、玉米芯、棉籽殼、甘蔗渣等)、食品加工廢物(果皮、果渣等)、木材廢物(木屑、樹皮)以及城市廢棄物(40%~60% 固體廢物是垃圾和廢紙)等。如果能有效地利用生物轉(zhuǎn)化技術(shù)將這些纖維素轉(zhuǎn)化成簡(jiǎn)單糖，再發(fā)酵產(chǎn)生乙醇等能源物質(zhì)，不僅可以變廢為寶，而且還可以避免由于化石燃料燃燒所帶來的環(huán)境污染，更重要的是可以緩解或解決石化能源短缺乃至枯竭所帶來世界性能源危機(jī)。

木質(zhì)纖維質(zhì)物質(zhì)生產(chǎn)生物乙醇的市場(chǎng)前景

到2020年，全世界從木質(zhì)纖維素物質(zhì)生產(chǎn)生物乙醇的產(chǎn)量大約是165億加侖（合計(jì)約625億升），美國將占有63.9%的市場(chǎng)，歐洲和中國分別將占有10.4%和11.5%的市場(chǎng)[3]。目前，生物乙醇的產(chǎn)業(yè)，尤其是非淀粉類的生物乙醇產(chǎn)業(yè)主要在于政府的補(bǔ)貼和維持，其原因在于利用木質(zhì)纖維生產(chǎn)生物乙醇的生產(chǎn)成本較高。第1代淀粉類原料與第2代非淀粉類原料發(fā)酵生產(chǎn)生物乙醇不同之處在于前面的預(yù)處理和酶解糖化過程。淀粉類原料很容易被酶接觸到，就被淀粉酶和糖化酶酶解為葡萄糖(C6糖)，然后葡萄糖再被普通的酵母發(fā)酵生產(chǎn)出乙醇，這樣，生產(chǎn)工藝環(huán)節(jié)少，流程短，成本就非常低。但是木質(zhì)纖維素物質(zhì)經(jīng)過自然選擇和漫長進(jìn)化，木質(zhì)素將半纖維素和纖維素緊密包裹在內(nèi)部，形成緊密結(jié)構(gòu)，被天然“設(shè)計(jì)”成可以抵御酶進(jìn)攻的分子結(jié)構(gòu)。因此與淀粉乙醇不同的是首先要有高溫高壓蒸汽或結(jié)合加酸堿等化學(xué)品的預(yù)處理技術(shù)將緊密結(jié)構(gòu)打開，讓酶能夠接觸到纖維素和半纖維素。纖維素和半纖維素酶解后發(fā)酵可以生產(chǎn)出乙醇[6]。纖維素酶解后可得到葡萄糖(C6糖)，半纖維素酶解后可得到木糖(C5糖)，淀粉類和纖維素都是由葡萄糖聚合成的長鏈結(jié)構(gòu)，只是結(jié)合的方式不同而已，因此酶解過程需要的酶是不同的；而半纖維素是由C5糖聚合而成的長鏈結(jié)構(gòu)，也需要特定的酶。纖維素及半纖維酶的成本更高，這也是導(dǎo)致木質(zhì)纖維素乙醇成本比淀粉乙醇高的重要原因之一。在每加侖生物乙醇的生產(chǎn)中，利用木質(zhì)纖維生產(chǎn)，纖維素酶的成本大約是15-20美分，而利用淀粉類生產(chǎn)，淀粉酶的費(fèi)用僅僅只占到了2－4美分[7]。因此要想提高纖維素生產(chǎn)生物乙醇的市場(chǎng)的競(jìng)爭(zhēng)力，提高纖維素酶的產(chǎn)量，降低纖維素酶的成本成為解決問題的關(guān)鍵因素。我國是纖維素酶的需求大國，由于纖維素酶的廣泛應(yīng)用，我國市場(chǎng)需求量將以每年25%～35%的速度上升，用纖維素酶產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)生物乙醇的關(guān)鍵技術(shù)將在未來幾年內(nèi)得到解決，那時(shí)我國纖維素酶年需求量將增加到25-40萬噸，每年將為我國節(jié)省生產(chǎn)燃料乙醇用糧500-1，000萬噸[8]。由于產(chǎn)酶菌種落后，產(chǎn)率低，成本高，嚴(yán)重影響我國纖維素酶工業(yè)發(fā)展，從而阻礙了以木質(zhì)纖維素為原料的2代生物乙醇工業(yè)的發(fā)展。

木質(zhì)纖維素及纖維素降解酶

木質(zhì)纖維素，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有三種：纖維素(35%～37%)、半纖維(23%-25%)和木質(zhì)素(18%-22%)組成[9]。纖維素屬于可再生自然資源，是生物界最重要的碳源物質(zhì)，每年由光合作用產(chǎn)生的植物干質(zhì)量約1，500億噸，其中纖維素占850億噸[5]。

纖維素酶(cellulase)是指能夠水解纖維素β-1，4-D-葡萄糖苷鍵，使纖維素變成纖維二糖和葡萄糖的一組酶的總稱。纖維素酶是一種具有很高活力的木聚糖酶，是一種復(fù)合酶，屬生物催化劑[10]。纖維素酶主要是指三類關(guān)鍵酶:（1）外切型纖維素酶，系統(tǒng)命名為外切β-1，4-D-葡聚糖酶，又稱纖維二糖水解酶(EC3.2.1.91，也稱Cl酶)。這類酶作用于纖維素線狀分子末端，水解β-1，4-糖苷鍵，每回依次從纖維素分子中切下一個(gè)纖維二糖分子，所以又稱纖維二糖水解酶(簡(jiǎn)稱CBH)。（2）內(nèi)切型纖維素酶，系統(tǒng)命名為內(nèi)切β-l，4-D-葡聚糖酶(EC3.2.1.4，也稱Cx酶或CMCase)。這類酶是纖維素酶中最重要的酶，它作用于纖維素分子內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)水解β-1，4-糖苷鍵，將長鏈纖維素分子截短，產(chǎn)生大量帶有非還原末端的小分子纖維素。（3）纖維二糖酶，系統(tǒng)命名為β-葡萄糖苷酶(EC2.1.21，也稱CB酶)，這類酶將纖維二糖水解成葡萄糖分子。當(dāng)以上三種纖維素酶的關(guān)鍵酶的活性比例適當(dāng)時(shí)，就能協(xié)同作用完成對(duì)纖維素的降解，但各個(gè)酶組分單獨(dú)作用時(shí)效果極差。所以說纖維素酶降解纖維素時(shí)一個(gè)協(xié)同表達(dá)和作用的過程[11-12]。

不同來源的纖維素酶分子特征和催化活性都不盡相同。細(xì)菌產(chǎn)生的纖維素酶量少，主要是內(nèi)切酶，大多數(shù)對(duì)結(jié)晶纖維素沒有活性，而且不能分泌到細(xì)菌細(xì)胞外，常常聚集形成多酶復(fù)合體[13]。真菌能產(chǎn)生大量的纖維素酶，產(chǎn)生的酶組分，能分泌到菌體外，一般不聚集成多酶復(fù)合體，但可以相互發(fā)生強(qiáng)烈的協(xié)同作用。纖維素酶分子的大小因來源不同也有明顯的差異，變化范圍很廣。多數(shù)真菌和少數(shù)細(xì)菌的纖維素酶都受到糖基化，所含碳水化合物的比率不同在很大程度上決定了酶的多型性，表現(xiàn)為分子量的差別[14]。纖維素酶的酶活力一般都很低，因而酶生產(chǎn)成本高。據(jù)報(bào)道，纖維素水解成葡萄糖所需的酶蛋白要比淀粉相應(yīng)水解所需的大100倍，這是影響纖維素酶實(shí)際應(yīng)用的重要原因之一[3]。

迄今為止，人們已從40多種細(xì)菌和數(shù)種真菌中克隆到了多種纖維素酶基因，有一百多種基因可在大腸桿菌中表達(dá)，大多數(shù)克隆的纖維素酶基因能產(chǎn)生信號(hào)肽，從而使表達(dá)產(chǎn)物部分或全部轉(zhuǎn)移至E.coli的細(xì)胞質(zhì)間隙[15]。雖然克隆到大腸桿菌的基因，不需要載體的啟動(dòng)子就可表達(dá)，但表達(dá)水平很低，推測(cè)可能是其啟動(dòng)子不能完全被識(shí)別的緣故。但在大腸桿菌中表達(dá)纖維素酶基因存在兩個(gè)主要問題:一是提取有很大困難，二是表達(dá)水平低、酶蛋白不能分泌，離工業(yè)化應(yīng)用的目標(biāo)還有一定的距離，所以在纖維素酶基因的表達(dá)方面人們將目光轉(zhuǎn)向了真核表達(dá)系統(tǒng)[16]。

木霉屬是研究最廣泛的纖維素酶產(chǎn)生菌[6]，世界纖維素酶市場(chǎng)中的纖維素酶20%是來自木霉屬和曲霉屬[17]。綠色木霉是一種在各種氣候帶的土壤中能夠普遍存在的一種多細(xì)胞絲狀真菌，能夠分泌完全的纖維素酶系，其中產(chǎn)量較高并且穩(wěn)定，是目前纖維素酶商業(yè)化生產(chǎn)的主要生產(chǎn)菌株[18]。對(duì)于綠色木霉的研究直到九十年代初僅有CBHⅠ基因克隆的報(bào)道，王建榮、張曼夫利用里氏木霉的基因序列同源片段做探針，構(gòu)建了綠色木霉基因文庫，并克隆了CBHⅠ、CBHⅡ基因，并對(duì)其基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究[19]。

纖維素酶的合成一般受纖維素誘導(dǎo)及葡萄糖降解物的阻遏，多數(shù)菌株纖維素酶的合成既受纖維二糖、山梨糖等的誘導(dǎo)，又為葡萄糖、甘油等易利用碳源的阻遏，還受菌體生長速度的影響[6]。在綠色木霉中，纖維素酶屬誘導(dǎo)型酶類，其多個(gè)酶組分的表達(dá)經(jīng)過嚴(yán)密的調(diào)控。在綠色木霉中能產(chǎn)生分泌型的纖維素酶，當(dāng)CBHⅡ基因缺失時(shí)，會(huì)影響纖維素酶系其他酶的表達(dá)，而缺失其他基因時(shí)，只單獨(dú)影響自身的表達(dá)。另有研究表明CBHⅡ是纖維素酶系統(tǒng)中最先表達(dá)的酶，其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)一步誘導(dǎo)其他纖維素酶基因的表達(dá)，但CBHⅡ基因的表達(dá)受纖維素降解產(chǎn)物葡萄糖的抑制[20]。

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，定點(diǎn)突變和基因重排技術(shù)在纖維素酶的生產(chǎn)工業(yè)中的應(yīng)用越來越廣泛。在里氏木霉 (T.reesei) 中，需要產(chǎn)生至少14種酶協(xié)同作用才能水解未經(jīng)化學(xué)處理過的植物干物質(zhì)。為了降低纖維素酶的復(fù)雜性，將里氏木霉的CBH1、嗜酸耐熱菌的葡聚糖內(nèi)切酶EI 以及曲霉(Aspergillus niger)的β- 葡萄糖苷酶以90∶9∶1(質(zhì)量比)混合形成一個(gè)三元復(fù)合物，此三元復(fù)合物在120 小時(shí)內(nèi)水解預(yù)處理過的纖維素的能力與李氏木霉中纖維素酶體的水解能力相當(dāng)。為了提高此三元復(fù)合物水解纖維素的活力，利用定點(diǎn)突變的方法對(duì)葡聚糖內(nèi)切酶EI的活性位點(diǎn)進(jìn)行修飾，結(jié)果與突變前的三元復(fù)合物相比，其水解纖維素的活性提高了12%[21]。Zinnia R等在里氏木霉菌中應(yīng)用同源重組技術(shù)將外切β－葡萄糖苷酶整合到egl3和xyn3基因啟動(dòng)子的下游，增強(qiáng)了纖維素酶的表達(dá)量4倍到7.5倍，這些重組菌株能有效的降解纖維素物質(zhì)[22]。

生物乙醇及纖維素降解酶的未來發(fā)展趨勢(shì)

隨著石化燃料供應(yīng)的減少，尋找新的能量來源關(guān)系到經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展乃至人類的生存問題。生物乙醇作為一種可再生的、經(jīng)濟(jì)上可承受的，并且對(duì)環(huán)境安全的能源物質(zhì)將逐漸成為石油的替代品[2]。由于產(chǎn)酶菌種落后，產(chǎn)率低，成本高，嚴(yán)重影響我國纖維素酶工業(yè)發(fā)展，從而阻礙了以木質(zhì)纖維素為原料的2代生物乙醇工業(yè)的發(fā)展。因此要想提高纖維素生產(chǎn)生物乙醇的市場(chǎng)的競(jìng)爭(zhēng)力，提高纖維素酶的產(chǎn)量，降低纖維素酶的成本成為解決問題的關(guān)鍵因素。目前纖維素酶工程菌株中不穩(wěn)定、產(chǎn)酶量不高、難應(yīng)用于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)等三大難題。利用基因工程技術(shù)改造菌種，尤其是纖維素酶基因啟動(dòng)子的改造，在發(fā)酵過程中其酶形成過程不受主要代謝產(chǎn)物葡萄糖的抑制，促進(jìn)其他纖維素酶基因的協(xié)同表達(dá)，大幅度提高菌株在發(fā)酵過程中的產(chǎn)纖維素酶的能力，將是工程菌柱構(gòu)建的方向，構(gòu)建不受葡萄糖抑制、穩(wěn)定、高效的表達(dá)纖維素酶工程菌。可以解決本項(xiàng)目的實(shí)施將會(huì)大大提高纖維素酶的產(chǎn)量，降低木質(zhì)纖維素生產(chǎn)生物乙醇時(shí)纖維素降解成本，從而促進(jìn)木質(zhì)纖維素生產(chǎn)生物乙醇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

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纖維素水解范文5

關(guān)鍵詞：纖維素酶；菌種篩選；鑒定；酶活力

中圖分類號(hào)： Q936 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20151132001

纖維素是農(nóng)作物秸稈的主要成分之一，也是地球上含量最為豐富的可降解生物質(zhì)，其為葡萄糖聚合物，以β-1，4糖苷鍵聚合。它的降解與轉(zhuǎn)化是生物圈碳素循環(huán)與生物能傳遞的重要環(huán)節(jié)。利用微生物對(duì)纖維素進(jìn)行降解，對(duì)于自然界生物能源的利用具有重要意義。世界各國均積極開展對(duì)纖維素降解菌的研究[1]。東北地區(qū)作為我國的糧食主產(chǎn)區(qū)，每年產(chǎn)生大量富含纖維素的農(nóng)業(yè)秸稈，傳統(tǒng)的焚燒污染環(huán)境且造成大量生物質(zhì)浪費(fèi)。

本試驗(yàn)從吉林市左家林地土壤中分離出一株纖維素降解菌，由菌絲、菌落形態(tài)以及16S rDNA初步鑒定為散囊菌綱（ Uncultured Eurotiomycetes）。其具有較強(qiáng)纖維素酶產(chǎn)酶活性，對(duì)于纖維素的降解轉(zhuǎn)化具有積極意義，菌種具有進(jìn)一步研究?jī)r(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料

土壤樣品，采自吉林省吉林市左家地區(qū)林地；化學(xué)試劑均為分析純，購于北京化學(xué)試劑廠；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）購自生工生物工程（上海）有限公司。Biospin凝膠回收試劑盒，購自BioFlux公司；

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：MgSO?7H2O 4 0.1g，F(xiàn)eSO4?7H2O 0.1g， K2HPO4 1.0g， MnSO4 5×10-4g，CMC-Na 10.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏10.0g，水1000ml，自然pH，121℃滅菌30min。

剛果紅篩選培養(yǎng)基：KNO3 2.0g，MgSO4 0.5g，KH2PO4 1.0g，NaCl 1.0g，Na2HPO4 1.0g，蒸餾水500ml，加熱溶解后加入CMC-Na 20.0g、瓊脂20.0g、剛果紅0.2g充分溶解后，蒸餾水定容至1000ml，HCl調(diào)pH直至達(dá)到7.0～7.2，121℃滅菌30min，搖勻后倒平板。

纖維素鈉篩選培養(yǎng)基：CMC-Na 5.0g，蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，瓊脂12.0g，，水 1000ml，121℃滅菌30min，搖勻后到平板。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基：Na2HPO4 3.0g，NH4NO3 0.8g，CaCl2 0.5g，ZnSO40.01g，F(xiàn)eSO4?7H2O 0.01g，MgSO4?7H2O 0.5g，MnSO4?H2O 0.01g，CMC-Na 10.0g，蛋白胨1.0g，酵母膏1.0g， 水1000ml，HCl調(diào)pH值7.0～ 7.2，121℃滅菌30min，搖勻后到平板。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，去皮切成小塊，用蒸餾水1000ml小火沸煮30min，8層紗布過濾，濾液補(bǔ)水至1000ml，調(diào)pH6.5。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集與菌種分離

于左家地區(qū)林地，取腐殖質(zhì)表層土壤5g土樣于三角瓶中，加入50ml無菌水，震蕩5min，至分散均勻。取5ml懸液于50ml富集培養(yǎng)基，28℃，80r/min震蕩培養(yǎng)5～7d。取富集培養(yǎng)液按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5做系列稀釋，涂布于剛果紅篩選培養(yǎng)基，靜置30min后，28℃倒置培養(yǎng)，分離有明顯透明水解圈的菌落。若菌落重疊可劃線分離菌株。

1.2.2 菌株纖維素降解能力測(cè)定

將分離獲得的菌株，液體培養(yǎng)后，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5做系列稀釋后涂布于剛果紅篩選培養(yǎng)基，靜置30min后，28℃倒置培養(yǎng)，待菌落直徑1.0～5.0mm，取下培養(yǎng)基，于1%剛果紅溶液浸泡1h，棄去剛果紅溶液，于1mol/L NaCl溶液浸泡0.5h，棄去NaCl溶液，觀察并測(cè)量水解圈大小。

1.2.3 纖維素酶活力測(cè)定

采用DNS法（3，5-二硝基水楊酸法）測(cè)定纖維素酶活力 [2]。酶活力定義為：1min內(nèi)催化纖維素水解生成1μmol葡萄糖所需的酶量為1IU。

1.2.4 菌株表型特征鑒定

取無菌水一滴至于干凈玻片，接種環(huán)挑取少許菌絲涂布，風(fēng)干固定，顯微觀察菌株形態(tài)。

1.2.5 菌株的18S r DNA鑒定

CTAB法提取菌株基因組DNA，分析18S r DNA進(jìn)行軍中鑒定。PCR反應(yīng)體系（50μL）：dd H2O 34.0μL，10×buffer 5.0μL，d NTP4.0μL，F(xiàn)P2μL，RP2μL，Taq酶 1μL，模板DNA 2μL。引物序列：FP 5'-ATTGGAGGGCAAGTCTGGTG-3'；RP 3' CCCGATCCCTAGTCGGCATAG-5'。PCR反應(yīng)條件：94℃，5min；94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)； 72℃，10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，送至英濰捷基公司測(cè)序。序列于GeneBank由BLAST進(jìn)行序列同源性分析，確定菌種屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離和纖維素降解能力初步鑒定結(jié)果

由剛果紅篩選培養(yǎng)基水解圈初步判斷，實(shí)驗(yàn)分離得到多種具有纖維素降解能力的菌株。其中3種疑似真菌類菌株，具有較為明顯纖維素降解能力。

取這3種菌株，于剛果紅篩選培養(yǎng)，用1%剛果紅溶液浸泡后1mol/L NaCl溶液浸泡脫色，測(cè)量水解圈大小，結(jié)果見表1。由表1可知，1號(hào)菌水解圈直徑/菌落直徑為8.8，遠(yuǎn)高于2號(hào)菌和3號(hào)菌。初步表明，1號(hào)菌具有較明顯纖維素降解能力。

2.2 菌株的纖維素酶活力測(cè)定結(jié)果

取1號(hào)菌、2號(hào)菌、3號(hào)菌，DNS法測(cè)定纖維素酶活力，結(jié)果見圖1。由圖1可知，在3種菌株中，1號(hào)菌纖維素酶活力最高，為2.32IU/mL。將1號(hào)菌命名為JN510。由纖維素酶活力判斷，其具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

2.3 JN510菌株表型特征鑒定結(jié)果

JN510菌株于PDA培養(yǎng)基28℃下培養(yǎng)，生長快速。3d后呈白色絨毛狀氣生菌絲；繼續(xù)培養(yǎng)，菌落轉(zhuǎn)為綠褐色；繼而顏色逐漸加深。菌落毛絨狀。鏡檢結(jié)果見圖2。

2.4 18S rDNA序列分析結(jié)果

JN510菌株基因組 DNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，結(jié)果見圖3。由圖可知，引物對(duì)18S r DNA 序列擴(kuò)增效果良好，擴(kuò)增片段約500bp。

回收片段，送英濰捷基公司測(cè)序。獲得序列經(jīng)GeneBank比對(duì)，該菌種與序列號(hào)為EU368286.1的Uncultured Eurotiomycetes具有99%的親緣關(guān)系，結(jié)合文獻(xiàn)所列形態(tài)學(xué)特征的描述，將其鑒定為散囊菌綱（Uncultured Eurotiomycetes）[3，4]。

3 討論

吉林市左家地區(qū)林地腐殖質(zhì)表層土壤中存在大量可以降解纖維素的纖維素酶產(chǎn)生菌。其可應(yīng)用于生物化工過程，如秸稈發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇等工藝。這些菌對(duì)于富含纖維素的的轉(zhuǎn)化利用以及農(nóng)業(yè)秸稈回收利用具有重要意義。

纖維素酶包括β-葡萄糖苷酶、內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶。3者協(xié)同作用降解纖維素生成葡萄糖。不同菌種產(chǎn)生上述3種酶的濃度與活力不同。雖然自然界中纖維素降解菌種類較多，但是秸稈等生物質(zhì)中的纖維素往往與木質(zhì)素、脂質(zhì)等交聯(lián)存在。使得自然界中纖維素降解菌的降解能力不理想，降低了秸稈等富含纖維素生物質(zhì)的開發(fā)利用。因此可以考慮構(gòu)建不同纖維素降解菌，以及纖維素降解菌與木質(zhì)素降解菌等降解菌的混合菌系。以此來轉(zhuǎn)化纖維素，提高降解效率。

本實(shí)驗(yàn)獲得的纖維素降解菌JN510具有較強(qiáng)纖維素降解能力，具有良好的開發(fā)前景，值得進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

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纖維素水解范文6

1木質(zhì)生物質(zhì)及水解液糖類組分

按照聚合度來分，糖類物質(zhì)可分為：?jiǎn)翁恰⒐丫厶呛投嗑厶恰０凑仗撬墓δ芑鶊F(tuán)來分，可分為醛、酮、醇和它們的氧化還原衍生物，以及由糖苷鍵連接此類化合物的聚體。在植物中糖類物質(zhì)主要是纖維素和半纖維素。纖維素糖類組分較為單一，本論文要點(diǎn)主要針對(duì)生物質(zhì)精煉過程中的組分更為復(fù)雜的半纖維素。研究表明，半纖維素是由多種糖單元組成的，常見的有木糖基、葡萄糖基、甘露糖基、半乳糖基、阿拉伯糖基、鼠李糖基等；并且半纖維素分子中還含有糖醛酸基（如半乳糖醛酸基、葡萄糖醛酸基等）和乙酰基；分子中還常有數(shù)量不等的支鏈。由此可見，半纖維素是由多種糖基、糖醛酸基所組成的，并且分子中往往帶有支鏈的復(fù)合聚糖的總稱[3]。一般針葉木中半纖維素含量為15％～20％，以聚葡萄糖甘露糖為主，同時(shí)還有少量聚木糖；而闊葉木中的半纖維素一般占木材的20％～25％，也有的高達(dá)35％，主要是聚木糖類，同時(shí)還伴隨有少量的聚葡萄糖甘露糖和聚鼠李糖半乳糖醛酸木糖，其中聚木糖類主要是聚O-乙酰基-(4-O-甲基葡萄糖醛酸)木糖。不同原料的半纖維素含量及組成不同。同時(shí)不同的生物質(zhì)精煉過程中分離半纖維素的水解液組分也有很大差異，并且由于水解程度的不同而形成了復(fù)雜體系。但就單糖分析而言主要針對(duì)葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖的定量檢測(cè)。

2生物質(zhì)精煉過程糖類傳統(tǒng)分析方法

復(fù)雜體系糖類分析在生物質(zhì)精煉過程中具有重要意義。在生物質(zhì)精煉的半纖維素利用過程中，由于半纖維素本身糖基和糖醛酸基種類的多樣化，使得對(duì)于半纖維素利用技術(shù)的機(jī)理研究在很大程度上依賴于多種低聚糖、寡糖及單糖的定性和定量分析。傳統(tǒng)方法由于不能對(duì)復(fù)雜體系的糖類物質(zhì)進(jìn)行分離而難以準(zhǔn)確分析。傳統(tǒng)的菲林法、DNS等化學(xué)分析方法只是對(duì)還原糖等給出定量分析。在制漿造紙檢測(cè)分析中，傳統(tǒng)化學(xué)分析的聚戊糖含量也是通過鹽酸水解成戊糖并進(jìn)一步脫水形成糠醛，通過糠醛含量的測(cè)定來間接表達(dá)半纖維素中的五碳糖高聚物[4]。但這些方法對(duì)于生物質(zhì)精煉半纖維素水解的機(jī)理研究和產(chǎn)品開發(fā)不能提供更實(shí)質(zhì)性的幫助。早期采用的酶分析法、紙色譜法、薄層色譜法及柱層析法等經(jīng)典方法可以進(jìn)行混合糖的分析，但分辨率低、時(shí)間長、定量測(cè)定困難，使得這些具有初步分離效果的傳統(tǒng)方法也受到了限制。隨著現(xiàn)代儀器分析技術(shù)的發(fā)展，混合體系的糖類分析也隨之產(chǎn)生了新的分析方法。

3混合糖類組成分析方法

3.1離子色譜法(IC)應(yīng)用離子色譜法是將改進(jìn)后的電導(dǎo)檢測(cè)器安裝在離子交換樹脂柱后，以連續(xù)檢測(cè)色譜分離的離子的方法。1975年H．斯莫爾等人將經(jīng)典的離子交換色譜與高效液相色譜技術(shù)相結(jié)合，創(chuàng)造了使用連續(xù)電導(dǎo)檢測(cè)器的現(xiàn)代離子色譜法，現(xiàn)代離子色譜使用小粒度和低交換容量的樹脂及小柱徑的分離柱以及進(jìn)樣閥進(jìn)樣，泵輸送洗脫液，具有迅速、連續(xù)、高效、靈敏、可同時(shí)測(cè)定多組分、不需要預(yù)先衍生化等優(yōu)點(diǎn)，可用于分析幾乎所有的單糖、大部分的寡糖及低聚糖。彭云云等[5]采用離子色譜法分析甘蔗渣半纖維素中各種糖基及糖醛酸，水解液經(jīng)中和、過濾、稀釋即可測(cè)定，采用色譜條件：色譜柱：淋洗液：0.001molNaOH-0.05molNaAC；CarboPaePAl(2×250mm)，保護(hù)柱：CarboPacPAl(2×50mm)；柱溫：30℃；體積流量：0.650ml/min；進(jìn)樣體積：10μL；檢測(cè)器：脈沖安培檢測(cè)器，金電極。結(jié)果表明氫氧化鈉和醋酸鈉淋洗液梯度洗脫可以分析糖醛酸及單糖組成，靈敏度高、重現(xiàn)性好、結(jié)果準(zhǔn)確。

3.2高效液相色譜法(HPLC)應(yīng)用高效液相色譜(HPLC)采用高壓液相泵、高效固定相和高靈敏度檢測(cè)器，具有分辨率高、分離速度快、分離效果好、不破壞樣品、重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)。單糖檢測(cè)器有紅外檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器、光散射檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器和紫外檢測(cè)器。由于糖類本身沒有紫外吸收，若不進(jìn)行衍生化只能采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)或示差折光檢測(cè)器(RI)。將糖類物通過衍生化轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂凶贤馕栈蚩僧a(chǎn)生熒光的物質(zhì)可實(shí)現(xiàn)高靈敏度檢測(cè)和痕量分析，但操作復(fù)雜。方宏等[6]用高效液相色譜法測(cè)定甘蔗渣半纖維素水解物中的單糖含量。以HypersilNH2柱為色譜分析柱，用示差折光檢測(cè)器檢測(cè)，流動(dòng)相是乙腈∶水(8∶20)。在此色譜條件下，甘蔗渣半纖維素水解物分離成：木糖、阿拉伯糖、果糖和葡萄糖。各單糖呈良好的線性關(guān)系。加樣回收率的平均值為97.3%～98.7%，此方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，適合檢測(cè)下限要求不高的生物質(zhì)半纖維素水解糖液。AloiaRomaní等[7]對(duì)桉木生物質(zhì)精煉過程中自催化半纖維素糖液中葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、糠醛、羧甲基糠醛等進(jìn)行了高效液相色譜一次性分析，而低聚糖則采用4%硫酸水解后二次測(cè)定單糖增加量的方法，作為實(shí)驗(yàn)過程中的常規(guī)檢測(cè)操作快捷、重現(xiàn)性好。利用HPLC測(cè)糖，要根據(jù)樣品中的糖的種類、含量和純度來選擇合適的檢測(cè)器，同時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體需要決定是否需要較為復(fù)雜的衍生化過程及昂貴的專用糖柱。

3.3高效陰離子交換-脈沖安培檢測(cè)法（HPAE-PAD）應(yīng)用高效陰離子交換-脈沖安培檢測(cè)法（HPAE-PAD）是一種陰離子交換色譜與脈沖安培檢測(cè)器結(jié)合的新的液相色譜法，檢測(cè)限量可達(dá)到幾十個(gè)ug/L水平。糖類化合物是一種多羥基醛或酮，可分為單糖、低聚糖和多糖，低聚糖由2～10個(gè)單糖分子失水而成，多糖是由10個(gè)以上單糖分子失水而得，低聚糖和多糖水解后即得單糖。中性糖類為Pka在12～14之間的弱酸。在高pH值的淋洗液中，例如10～20mmol/LNaOH中，它們會(huì)部分或全部以陰離子形式存在，能在陰離子交換柱上保留并得到分離。梁立娜等[8]利用高效陰離子交換-脈沖安培檢測(cè)（HPAE-PAD）同時(shí)分離測(cè)定8種單糖和2種糖醛酸。以CarboPacPA20陰離子交換柱為分離柱，以2mmol/LNaOH溶液將8種單糖從分離柱上洗脫，而后用NaAc（50～200mmol/L）梯度淋洗2種糖醛酸，淋洗液流速0.5ml/min，分析時(shí)間30min。8種單糖和2種糖醛酸的檢出限為2.5～14.4μg/L。5mg/L的10種化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)7次進(jìn)樣，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.3%～1.5%。用所建立的方法測(cè)定了多糖水解液和木材半纖維素水解液中的單糖和糖醛酸含量。劉婷[9]利用高效陰離子交換分離-脈沖安培檢測(cè)分析不同茶葉多糖中的葡萄糖、半乳糖、甘露糖和果糖。陰離子交換柱：METROSEPCARB(150×4.0mm)；淋洗液：6.0mmol/LNaOH溶液；柱溫：32℃；淋洗液流速：1.0ml/min；分析時(shí)間：45min；進(jìn)樣體積：20μl。優(yōu)化條件下4種單糖的檢出限為0.125～2.0mg/L。樣品測(cè)定的回收率為91.8％～99.3％。所建立的方法分析4種常見茶葉多糖快速、有效。高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)(HPAEC-PAD)的一大優(yōu)點(diǎn)是不需要衍生化就能分析單糖、大部分的寡糖及低聚糖，節(jié)約時(shí)間和資金，避免了有毒衍生試劑的使用，對(duì)于組成結(jié)構(gòu)大小上非常相近的單糖也有很好的分離效果。

3.4氣相色譜法(GC)應(yīng)用氣相色譜是多糖結(jié)構(gòu)分析中最重要的手段之一，它與質(zhì)譜聯(lián)用可以得出有關(guān)單糖殘基類型、鍵的連接方式、糖的序列和糖環(huán)形式、聚合度等多種結(jié)構(gòu)信息。此外，由于大量的固定液和不同的檢測(cè)器適用于糖的氣相色譜分析，因而用氣相色譜法測(cè)定糖類具有樣品用量少、選擇性好、分辨率強(qiáng)、靈敏度高以及可用于定性及定量分析等優(yōu)點(diǎn)。康學(xué)軍等[10]以三氟乙酸水解白芷多糖，水解產(chǎn)物中加入鹽酸羥胺、吡啶和醋酸酐，衍生化反應(yīng)生成糖腈乙酸酯衍生物，采用氣相色譜法測(cè)定白芷多糖的單糖組成。用OV-101毛細(xì)管色譜柱；進(jìn)樣溫度為210℃；檢測(cè)器溫度為240℃；柱溫為程序升溫：初始柱溫110℃，維持5min，以5℃/min的升溫速率升高到190℃，維持4min，以3℃/min的升溫速率升高到210℃，維持20min。白芷多糖中含有木糖、甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖和半乳糖等7種單糖成分，并測(cè)定計(jì)算出已知6種單糖：鼠李糖-阿拉伯糖-木糖-甘露糖-葡萄糖-半乳糖的摩爾構(gòu)成比1.19∶1.19∶0.765∶1∶8.08∶3.34。氣相色譜法（GC）分析糖類，主要困難在于糖類沒有足夠的揮發(fā)性，須在色譜分析之前預(yù)先轉(zhuǎn)化成對(duì)熱較穩(wěn)定的、易揮發(fā)的衍生物。但在衍生物的制備過程中，由于糖的異構(gòu)化會(huì)產(chǎn)生衍生物的異構(gòu)體，使色譜分析時(shí)每種糖產(chǎn)生幾個(gè)峰，從而影響了組分的分離和定量。

3.5薄層色譜法(TLC)應(yīng)用薄層色譜法(TLC)是一種微量、快速、簡(jiǎn)便、有效的定性的半定量和定量分析方法。薄層色譜的特點(diǎn)是可以同時(shí)分離多個(gè)樣品，分析成本低，對(duì)樣品預(yù)處理要求低，對(duì)固定相、展開劑的選擇自由度大，適用于含有不易從分離介質(zhì)脫附或含有懸浮微粒或需要色譜后衍生化處理的樣品分析。而最新的高效薄層色譜(HPTLC)采用更細(xì)、更均勻的改性硅膠和纖維素為固定相，對(duì)吸附劑進(jìn)行疏水和親水改性,可以實(shí)現(xiàn)正相和反相薄層色譜分離，提高了色譜的選擇性。焦廣玲等[11]建立了不同展開體系中薄層色譜分析單糖或寡糖的有效方法。以淀粉寡糖、右旋糖酐寡糖以及古羅糖醛酸寡糖3個(gè)系列寡糖和半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、巖藻糖、木糖和鼠李糖9種單糖為研究對(duì)象，探討其在不同展開體系下的薄層色譜行為。在各種糖TLC分析中，若供試品中主要含有酸性寡糖，則選擇甲酸展開體系；若供試品含有不同連接方式的中性寡糖，則選擇氨水展開體系進(jìn)行二次展開；若只對(duì)單糖進(jìn)行分離鑒別，應(yīng)采用三乙胺展開體系，并采用苯胺一二苯胺顯色劑，根據(jù)Rf值和顯色的不同，區(qū)別單糖的類型。于立芹[12]等測(cè)定紅薯葉中多糖，經(jīng)Sephadex-G100凝膠層析法純化后，利用薄層色譜法結(jié)合酸水解，糖腈乙酰化氣相色譜分析法測(cè)定紅薯葉多糖的單糖組成和各組成的物質(zhì)的量比。紅薯葉多糖的單糖組分有木糖、甘露糖、葡萄糖，其量的比為0.47∶0.35∶0.18。糖腈乙酸酯衍生化方法能較好地實(shí)施紅薯葉多糖水解產(chǎn)物的衍生化。衍生產(chǎn)物經(jīng)干燥沒有發(fā)現(xiàn)色譜峰明顯拖尾現(xiàn)象，適于單糖衍生化產(chǎn)物GC分析前的處理。

3.6高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)應(yīng)用高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)是近年來發(fā)展最快的分析方法之一。是以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異實(shí)現(xiàn)分離測(cè)定的液相分離方法[13]。毛細(xì)管電泳技術(shù)分離糖必須解決電荷問題，除氨基糖、糖醛酸及一些硫酸化糖外，天然糖分子都呈電中性，不能在電場(chǎng)中遷移。因此糖的毛細(xì)管分離分析中要采用解離、絡(luò)合、衍生技術(shù)使糖帶電。汲晨鋒等[14]采用水提醇沉法從新鮮蘆筍中提取粗多糖，采用高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定單糖組成，可以實(shí)現(xiàn)蘆筍粗多糖中的木糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖的分離測(cè)定，得到其百分比分別為3.44％、7.92％、10.52％、17.15％、41.85％。研究發(fā)現(xiàn)其緩沖鹽濃度和pH值對(duì)單糖組分的分離度影響較大，文章通過比較發(fā)現(xiàn)緩沖鹽濃度為75mmol/L、pH10.5時(shí)，分離度最好。通過蘆筍多糖和混合單糖的的毛細(xì)管電泳圖譜比較，可鑒別出大部分單糖。該技術(shù)分離效果清晰、定量準(zhǔn)確、時(shí)間短、進(jìn)樣量少，獲得了較好的結(jié)果。汪紅等[15]采用苯酚-硫酸比色法測(cè)定了丹參藥材中總多糖的含量，檢測(cè)波長為490nm，丹參總多糖在0.1122～0.561mg范圍內(nèi)其濃度與吸光度線性關(guān)系良好(r=0.9998)；以毛細(xì)管電泳法測(cè)定丹參粗多糖組成，檢測(cè)波長206nm，結(jié)果顯示，丹參粗多糖由鼠李糖∶木糖∶核糖∶葡萄糖∶甘露糖∶阿拉伯糖∶半乳糖以2.8∶1.0∶8.5∶12.7∶4.2∶15.3∶58.8的摩爾比組成。

3.7質(zhì)譜及質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)由于組成單糖種類與數(shù)目等的不同，糖的結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，要完全闡明一個(gè)糖的結(jié)構(gòu)，需要提供以下幾方面的信息：（1）分子量及組成單糖的種類與摩爾比；（2）各糖環(huán)的構(gòu)象（呋喃型或吡喃型）與異頭碳的構(gòu)型；（3）各糖殘基間的連接方式；（4）糖殘基的連接順序；（5）二級(jí)結(jié)構(gòu)及空間構(gòu)象等。質(zhì)譜，尤其是GC-MS（EI或CI方式）用于單糖分析已有幾十年的歷史，現(xiàn)已廣泛用于糖組成分析及甲基化分析以確定糖殘基的連接方式。徐正華等[16]建立了氣相色譜-質(zhì)譜(GDMS)法同時(shí)測(cè)定乳酸和葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、果糖、半乳糖、乳糖、1,5-脫水山梨醇、山梨醇7種糖的方法。選擇核糖醇為內(nèi)標(biāo)，進(jìn)樣前先進(jìn)行肟化反應(yīng)再進(jìn)行硅烷化反應(yīng)。采用DB-5熔融石英毛細(xì)管柱，升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0℃，保持4min，以8℃/min的速率升至300℃，保持3min。在優(yōu)化測(cè)定條件下各對(duì)照品得到良好分離，且在測(cè)定范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系(r2>0.983)，平均加標(biāo)回收率為74.5％～104.2％，該方法簡(jiǎn)便、靈敏度高。孫多志等[17]在秸稈兩步稀酸水解工藝中，用氣相色譜／質(zhì)譜(GC/MS)法對(duì)其水解液中的單糖成分進(jìn)行測(cè)定，采用2％硼氫化鈉的氨溶液將稀酸水解液中的單糖還原成糖醇，然后在甲基咪唑催化劑的作用下和乙酸酐在水相中直接反應(yīng)生成乙酰化的糖醇，用二氯甲烷萃取后進(jìn)行GC/MS測(cè)定。研究結(jié)果表明：秸稈稀酸水解液中有五種單糖，主要是木糖和葡萄糖，其次是阿拉伯糖、半乳糖和少量的甘露糖；利用此方法測(cè)定了一批秸稈稀酸水解液，得到了該秸稈稀酸水解過程的最佳的反應(yīng)時(shí)間。該方法可快速、準(zhǔn)確測(cè)定秸稈稀酸水解液中單糖的濃度，為水解工藝的研究提供了一種有效的分析方法。

4多糖結(jié)構(gòu)分析

在生物質(zhì)精煉過程中伴隨著多聚糖的化學(xué)變化，研究多糖結(jié)構(gòu)變化對(duì)于糖平臺(tái)化合物的理論研究和產(chǎn)品開發(fā)具有重要意義。據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研表明，目前該方法研究還處在起步階段，需要借鑒其他領(lǐng)域的現(xiàn)代分析方法，并且應(yīng)用到相關(guān)的基礎(chǔ)研究工作中去，從而積累更多分析經(jīng)驗(yàn)和方法創(chuàng)新。近年來多糖的結(jié)構(gòu)分析的儀器設(shè)備、分析方法都有了很大的提高。目前已有應(yīng)用的方法包括紫外光譜法、紅外光譜法和核磁共振分析法等。例如應(yīng)用1HNMR可以鑒別多糖中糖苷鍵位置，并進(jìn)一步確認(rèn)多糖結(jié)構(gòu)。AshutoshMittal等[18]通過核磁共振氫譜的測(cè)定方法分析在不同溫度和時(shí)間下闊葉木自催化水解半纖維素溶出物，從而評(píng)估該過程的反應(yīng)機(jī)理。對(duì)殘留的聚木糖、低聚木糖、木糖、葡萄糖及糖類次級(jí)衍生產(chǎn)品，例如糠醛、羧甲基糠醛，進(jìn)行了測(cè)定分析。單糖和低聚物則采用最新的高分辨率核磁共振氫譜光譜分析法。該方法能精確定量分析水解抽提后的木料上殘余的聚木糖和纖維素殘留以及水解產(chǎn)物中的木糖和葡萄糖。研究表明，該方法具有良好的再現(xiàn)性并為分析碳水化合物的組成結(jié)構(gòu)提供了與以往報(bào)道方法結(jié)果可比擬的新方法。Xue-MingZhang等[19]采用傅里葉紅外變換、1H,13C以及2D-HSQCNMR核磁共振的分析方法，對(duì)有機(jī)溶劑提取的某白楊木品種半纖維素糖液進(jìn)行全面定性和定量分析，研究了木糖、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖及各種糖醛酸的組成，并通過核磁共振的方法研究了特定品種半纖維素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，包括乙酰化半纖維素與葡萄糖醛酸、葡萄糖甘露聚糖的鍵合方式等，為進(jìn)一步發(fā)酵特定產(chǎn)品的機(jī)理研究提供了重要參考。