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酒駕擔保書范文1

【摘要】 目的 構建銅綠假單胞菌發光菌株，建立銅綠假單胞菌生物膜(biofilm，BF)模型，研究鹽酸氨溴索對銅綠假單胞菌成熟BF的影響及與環丙沙星合用是否具有協同殺菌作用。方法 將攜帶綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的質粒轉染銅綠假單胞菌，平板培養法培養銅綠假單胞菌BF，建立銅綠假單胞菌BF體外模型，經鹽酸氨溴索作用后，掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)觀察鹽酸氨溴索對BF形態結構的影響，熒光顯微鏡定性觀察鹽酸氨溴索對BF內活菌的作用，通過發光菌株熒光強度定量分析鹽酸氨溴索單獨作用以及與環丙沙星聯用后BF內活菌量。結果 鹽酸氨溴索作用后電鏡觀察可見黏液樣物變稀疏，不規則。鹽酸氨溴索濃度大于0.49mg/mlBF內活菌數減少(F=18，P

【關鍵詞】 鹽酸氨溴索； 環丙沙星； 銅綠假單胞菌； 生物膜

ABSTRACT Objective To establish a biofilm model of Pseudomonas aeruginosa in vitro and observe the effect of ambroxol on biofilm of Pseudomonas aeruginosa， and study the synergistic effect with ciprofloxacin on tested specimens. Method Plasmids carried with green fluorescent protein (GFP) was tansfected to the strain of Pseudomonas aeruginosa. Plate culture method was used to establish biofilm model of Pseudomonas aeruginosa in vitro. After ambroxol was added to the biofilm， the appearance of the biofilm was detected by scanning electron microscope (SEM)， and the viable counts of bacterial in biofilm after treated by ambroxol alone and together with ciprofloxacin were determined by bio-fluorescence method. Result After adding ambroxol， the biofilm was thin and abnormal compared with the control by SEM detection. Further detection with fluorescence microscope showed the viable bacteria in biofilm was reduced significantly (F=18， P

KEY WORDS Ambroxol; Ciprofloxacin; Pseudomonas aeruginosa; Biofilm

生物膜(biofilm，BF)是細菌黏附在物體表面上形成的一種具有高度結構性的膜狀復合物，其主要成分是細菌分泌的胞外基質和細菌菌體［1］。BF可使細菌具有抵御宿主免疫系統和抗菌藥物殺傷作用，產生對抗菌藥物的高度耐藥性(可達到浮游狀態的10～1000倍)，導致感染難以治愈［2］。銅綠假單胞菌是常見細菌生物膜相關感染病原菌之一，銅綠假單胞菌生物膜的形成是呼吸機相關性感染難以控制的重要原因。作者曾研究氨溴索可顯著促進環丙沙星對細菌生物膜的透過［3］，本研究發現鹽酸氨溴索對銅綠假單胞菌BF有抑制作用，且與環丙沙星聯用后具有協同作用，增強殺菌活性，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株PAO1(購自四川大學微生物實驗室)，Luria-Bertani培養基(LB，上海升博生物技術公司)，鹽酸氨溴索標準品(德國Boehringer Ingelheim)；環丙沙星標準品(重慶市藥品檢定所)，比濁儀(德國Siemens公司)，多功能酶標儀(美國BIORAD UV-3350型)，熒光顯微鏡(德國Leica公司)，SEM(美國Amary公司)，24及96孔培養板(美國Coring公司)。

1.2 方法

(1)構建GFP標記的PAO1菌株 采取電轉化對PAO1進行GFP)標記。首先制備感受態PAO1，然后進行菌株pGFPuv質粒轉化和轉化菌株篩選，提取轉化菌株中質粒和轉化菌株中質粒雙酶切電泳鑒定，檢測轉化菌株中質粒穩定性。本實驗獲得較穩定遺傳的GFP標記的PAO1菌株。

(2)環丙沙星最低抑菌濃度(MIC)的測定 采用微量稀釋法測定環丙沙星對銅綠假單胞菌的MIC，質控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853。

(3)銅綠假單胞菌BF體外模型的建立 用平板法培養銅綠假單胞菌BF［4］。取隔夜培養的含有銅綠假單胞菌的LB培養液，調至1.5×108CFU/ml。分別吸取菌液1ml加入24孔板(其內放8mm×8mm玻片)，0.1ml加入96孔板。37℃培養，每48h換液一次，連續培養7d，即可形成穩定成熟的BF［5］。

(4)銅綠假單胞菌BF形態的SEM檢測 本部分實驗分為兩組［對照組和鹽酸氨溴索組(濃度3.75mg/ml)］。兩組用平板法培養細菌7d，在24孔板內分別加入1ml LB培養基和鹽酸氨溴索，37℃孵育24h后取出，用磷酸緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)反復清洗，去除浮游菌。立即用2．5%戊二醛PBS溶液中固定2h，再經0.1mol PBS沖洗2次(pH7.2)，30%～100%系列濃度乙醇脫水，經50%～100%叔丁醇置換，干燥、離子濺射儀噴金，經過SEM觀察銅綠假單胞菌BF微觀形態。

(5)熒光顯微鏡定性觀察細菌BF內活菌數 本部分實驗分為6組［空白對照組，不同濃度的鹽酸氨溴索作用組(濃度依次為3.75、1.875、0.95、0.49和0.25mg/ml)］。在24孔板加入1ml菌液，平板法培養7d，分別加入1ml上述濃度的鹽酸氨溴索和LB培養基，37℃孵育24h取出，用PBS反復清洗，去除浮游菌，取出玻片，置熒光顯微鏡下觀察。

(6)多功能酶標儀定量分析鹽酸氨溴索與環丙沙星合用后細菌BF內活菌數 細菌培養7d，棋盤法在96孔板內分別加入0.1ml不同濃度的鹽酸氨溴索(濃度依次為3.75、1.875、0.95、0.49、0.25和0mg/ml)和環丙沙星(濃度依次為4、2、1、1/2、1/4和0MIC)，37℃孵育24h取出，用PBS反復清洗，去除浮游菌，用多功能酶標儀檢測各孔熒光強度。

(7)統計學分析 所有數據輸入SPSS11.5統計軟件包，并行正態性分布檢驗，均符合正態性分布，后進行方差分析，顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 環丙沙星的MIC測定

環丙沙星的MIC為1μg/ml。

2.2 SEM觀察銅綠假單胞菌BF形態

經過各組處理后銅綠假單胞菌BF進行SEM觀察可以看出，細菌培養7d后形成成熟的BF。對照組BF在載體表面形成片狀物，周圍有厚薄不均的黏液狀物質連接成一大片，其內包裹大量細菌;鹽酸氨溴索處理組銅綠假單胞菌BF變得稀疏，結構簡單，僅見少量散在細菌。

2.3 熒光顯微鏡觀察鹽酸氨溴索對成熟BF的影響

預置8mm×8mm玻片的24孔板內接種等量的細菌，培養7d后加入不同濃度的鹽酸氨溴索作用24h后取出玻片，洗去浮游菌，振蕩破壞BF，使其內細菌游出，置熒光顯微鏡下觀察(×200)，取隨機視野，結果顯示，隨著濃度的升高，細菌減少；當濃度達到0.5mg/ml時，與生理鹽水對照組大致相當。

2.4 多功能酶標儀定量檢測BF內活菌熒光強度

隨著鹽酸氨溴索濃度的升高，培養板內細菌的熒光強度下降，說明BF內活菌減少，統計分析顯示當鹽酸氨溴索濃度達到0.49mg/ml時，與對照組存在差異(單因素方差分析，P

鹽酸氨溴索單獨以及與環丙沙星聯用后BF內細菌熒光強度圖1中6條曲線代表不同濃度的鹽酸氨溴索作用下，在環丙沙星濃度從0～8MIC變化時熒光強度的變化趨勢。從圖中可以看出，鹽酸氨溴索與環丙沙星存在協同作用(隨著鹽酸氨溴索濃度升高，在同一環丙沙星濃度所對應的熒光強度，隨之降低)，且隨著鹽酸氨溴索濃度升高，協同作用增強。

3 討論

近年來由呼吸機輔助通氣的使用增加，導管相關性感染問題日益突出。銅綠假單胞菌是常見的形成BF菌類之一，形成BF后，由于其滲透限制作用［1］，以及其內細菌所處的微環境改變［5］等原因，導致細菌耐藥性增強，難以清除。盡管國外有報道鹵代呋喃唑酮［6］及藻酸鹽抗體［7］等有破壞BF的作用，但尚未應用于臨床治療，因此，尋找一種有效可行抗銅綠假單胞菌BF的臨床用藥具有極為重要的意義。國外報道，化痰藥N-乙酰半胱氨酸干擾生物膜形成［8］，鹽酸氨溴索作為一種臨床常用的化痰藥與N-乙酰半胱氨酸作用機制上有一定的相似性，推測鹽酸氨溴索可能具有抗BF作用。本文將攜帶GFP的質粒轉染PAO1，構建銅綠假單胞菌發光菌株，采用平板培養法，7d后得到成熟的BF。SEM觀察顯示，在鹽酸氨溴索的作用下，成熟的BF變得稀疏，不規則，說明一定濃度的鹽酸氨溴索可影響BF的形態，破壞其結構的完整性。同時采用生物發光法直觀地觀察鹽酸氨溴索對銅綠假單胞菌BF內活菌的影響，結果發現隨著鹽酸氨溴索濃度的升高，BF內黏附的活菌減少，說明鹽酸氨溴索對銅綠假單胞菌BF有破壞作用。臨床上常用抗生素如環丙沙星對BF狀態的銅綠假單胞菌的殺滅作用不強。用多功能酶標儀檢測不同濃度環丙沙星與鹽酸氨溴索聯合應用的對細菌的作用，結果顯示它們具有協同抑制作用，且隨著鹽酸氨溴索濃度升高，協同作用增強，BF內活菌進一步減少，環丙沙星的殺菌活性增強。這可能與鹽酸氨溴索破壞BF結構的完整性，增強了環丙沙星對BF的穿透能力，提高了環丙沙星對BF中細菌的殺滅能力。由此認為，鹽酸氨溴索對銅綠假單胞菌BF有破壞作用，與其他抗生素聯用可以提高其殺菌能力，為鹽酸氨溴索的抗BF應用提供了理論基礎，為新生兒難治性銅綠假單胞菌感染的臨床治療提供新的思路。對于鹽酸氨溴索抗BF的作用推測可能與其對BF胞外基質的合成和結構維持的影響有關，具體機制還有待進一步研究。

參考文獻

［1］ Costerton J W， Lewandowski Z， Caldwell D E， et a1， Microbial biofilm ［J］. Annu Rev Microbiol，1995，49:711

［2］ Nickel J C， Costerton J W. Bacterial biofilms and catheters: A key to understanding bacterial strategies in catheter associated urinary tract infections ［J］. Can J Infect Dis，1992，3(5):261

［3］ 楊華，余加林，劉官信，等. 氨澳索對環丙沙星透過銅綠假單胞菌生物膜的影響［J］. 中國抗生素雜志，2007，32(4)：221

［4］ Ashby M J， Neale J E， Knott S J， et al. Effect of antibiotics on non-growing planktonic cells and biofilms of Escherichia coli ［J］. J Antimicrob Chemother，1994，33(3):443

［5］ Stewart P S， Costerton J W. Antibiotic resistance of bacteria in biofilms ［J］. Lancet，2001，358(9276):135

［6］ Pappas K M， Weingart C L， Winans S C. Chemical communication in proteobacteria: biochemical and structural studies on signal synthases and receptors required for intracellular signalling ［J］. Mol Microbiol，2004，53(3):755