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同義替換速率（dS）或非同義替換的速率（dN）是一年中或一個世代內(nèi)一個同義位點上發(fā)生同義替換的數(shù)目或一個非同義位點上發(fā)生非同義替換的數(shù)目。實際上，由于不知道2個序列的分歧時間，因此，習(xí)慣上總是考慮一對序列的平均每個同義位點上發(fā)生同義替換的數(shù)目或平均每個非同義位點上發(fā)生非同義替換的數(shù)目。dS等于dN時（即ω＝1），表明沒受到自然選擇；dS大于dN時（ω＜1）表明受到負選擇；dS小于dN時（ω＞1）表明受到正選擇［1］。光敏色素（Phy）是一類紅光／遠紅光受體，在植物整個生長發(fā)育過程中都起重要的調(diào)節(jié)作用［2－4］。Phy分子是由大約1100個氨基酸殘基的脫輔基蛋白和1個線性的四吡咯環(huán)生色團通過共價鍵鏈接構(gòu)成。其N端是光感受區(qū)，包括后色膽素裂解酶亞結(jié)構(gòu)域（Bilinlyasedomain，BLD）和光敏色素亞結(jié)構(gòu)域（Phytochromedomain，PHY），GAF（cGMP－specificphosphodiesterase／adenylatecyclases／formatehydrogenlyasetranscription）結(jié)構(gòu)域包含于BLD結(jié)構(gòu)域中，是發(fā)色團結(jié)合的部位，高度保守［5－6］；C端是光調(diào)節(jié)區(qū)，光調(diào)節(jié)區(qū)域含有2個PAS（Per／Arnt／Sim）同源重復(fù)序列和1個組氨酸激酶類作用區(qū)（Histidinekinaserelateddomain，HKRD）。研究表明，GAF結(jié)構(gòu)域某些位點發(fā)生突變，可能會嚴重影響脫輔基蛋白和發(fā)色團的結(jié)合［7］，從而影響光敏色素的生理功能。試驗的前期研究發(fā)現(xiàn)，在裸子植物PHY進化過程中，GAF結(jié)構(gòu)域中存在2個正選擇位點［8］，但是并未涉及C端的其它結(jié)構(gòu)域。PHYB存在于被子植物，和裸子植物中的phyp同為B類光敏色素基因。Yang等［9］和Mathews等［10］在對被子植物光敏色素A－C／F基因以及光敏色素B－D／E基因的分析中檢測到了正選擇。但是Yang等選用的基因序列有限，每個光敏色素類型只有1條基因序列。樣本的大小可能會影響檢測結(jié)果。因此，現(xiàn)在前期研究工作的基礎(chǔ)上，采用16條光敏色素基因序列，檢測了分別存在于裸子植物和被子植物中同為B類光敏色素的PHYP和phyb基因的光感受區(qū)，以期了解這2個基因的光感受區(qū)是否經(jīng)歷選擇壓力以及經(jīng)歷同樣的選擇壓力，從而深化對該區(qū)域功能的認識。   1材料與方法   1．1試驗材料   試驗采用了8條裸子植物的PHYP光感受區(qū)序列，8條被子植物的PHYB光感受區(qū)序列進行適應(yīng)性進化分析。其中被子植物的序列數(shù)據(jù)以及外類群風(fēng)兜地錢（MarchantiapaleaceaBertol．var．diptera（Mont．）Hatt．）的序列數(shù)據(jù)取自GenBank（序列名稱及登陸號見表1）；裸子植物序列由測序所得，植物材料均采自中國科學(xué)院武漢植物園。   1．2總DNA提取、PCR、克隆和測序   用于DNA提取的材料為新鮮的葉片，方法采用改進的CTAB法［11］。擴增PHYP光感受區(qū)序列采用的引物是根據(jù)王靜得到的南方紅豆杉PHYP序列（數(shù)據(jù)未發(fā)表）和歐洲赤松PHYP的cDNA序列（X96738）設(shè)計，引物為2對（表2），第1對擴增BLD結(jié)構(gòu)域的序列，第2對擴增了PHY－PAS1結(jié)構(gòu)域的序列。測序完成后，光感受區(qū)域序列由這2個部分通過Editseq軟件拼接而成。每25μLPCR反應(yīng)體系中包括：模板50ng，引物各8pmol，TaqDNA聚合酶2U（Takara，大連）和由Takara提供的10倍PCR緩沖液2．5μL及2．5mmol／LdNTPs0．5μL。聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）在BiometraPCR擴增儀上進行（Thermobio，德國）。PCR反應(yīng)程序為：94℃5min；94℃30s，55℃60s，72℃90s，35個循環(huán)；72℃10min。PCR產(chǎn)物在1．0％瓊脂糖凝膠、1×TAE電泳液中電泳35min（電壓為120V），切下目的片段，用QIAEXII（Qiagen，德國）柱式DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。回收所得產(chǎn)物與PMD19－T載體在4℃下連接16h，然后轉(zhuǎn)化導(dǎo)入由大腸桿菌DH－5α所制的感受態(tài)細胞。感受態(tài)細胞在含有X－Gal、IPTG和氨芐青霉素的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)12h，通過藍白斑篩選獲得陽性克隆。至少有3個陽性克隆送至英俊公司，用ABI377型自動測序儀測序，測序引物為M13＋／M13－。為了保證測序的準確性，對所得序列的正、反鏈進行測定并加以校準。   1．3數(shù)據(jù)分析   根據(jù)文獻［12］，對PHYP和PHYB的分析是以地錢類風(fēng)兜地錢為外類群。序列經(jīng)ClustalX1．81［13］軟件比對，個別位點進行適當人工校正。采用最大簡約法（MaximumParsimony，MP）構(gòu)建分子系統(tǒng)樹。空位（Gap）被編碼為缺失（Missing）。MP分析使用PAUP［14］軟件進行，采用如下選項：樹二組重新連接（TreeBisection－reconnection，TBR）、啟發(fā)式搜索（Heuristicsearch）、多重性選擇（MULTREESoption）、ACCTRAN優(yōu)化和100次隨機附加的重復(fù)。利用自展分析（Bootstrap，1000次重復(fù)）檢驗各分支的置信度。在該研究中，采用PAML4［15］分析方法中的3個模型：分支模型［16］、位點模型［17－18］以及分支－位點模型［19－20］進行分析。采用系統(tǒng)發(fā)育分析得到的MP樹文件，以及該分析中的密碼子矩陣。目的分支在圖1中以字母標出，ω0是背景比率。整個分析采用PAML4軟件包中的Codeml程序完成。   2結(jié)果與分析   2．1構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹   圖1是基于裸子植物PHYP和被子植物PHYB光感受區(qū)序列構(gòu)建的MP樹，這2個類型的光敏色素分別聚在不同的2個分支。在PHYP分支中，紅豆杉＋白豆杉與香榧＋穗花杉形成姊妹群（bootstrap＝83），然后和三尖杉聚在一起（bootstrap＝95），池杉和柳杉＋日本柳杉形成一個分支且得到有力支持（bootstrap＝100），該分支同紅豆杉科和三尖杉科聚在一起（bootstrap＝100），共同構(gòu)成歐洲赤松的姊妹群（bootstrap＝100）。在PHYB分支中，單子葉植物水稻（OryzasativaJaponica）＋高粱（Sorghumbicolor）形成一個分支，雙子葉植物馬鈴薯（Solanumtuberosum）、煙草（Nicotianatabacum）、番茄（Lycopersiconesculentum，tomato）、楊（Populustremula）、擬南芥（Arabidopsisthaliana）形成另外一個分支，支持率很高（bootstrap＝100）。#p#分頁標題#e#   2．2選擇壓力的分析   由表3可知，裸子植物PHYP和被子植物PHYB光感受區(qū)不同模型下的似然值以及參數(shù)估計。單比率模型包括35個參數(shù)，在該模型下，似然值l0＝－10535．68，ω0＝0．051。三比率模型假定3個不同的ω，即ωP、ωB以及ω0，分別表示P、B分支以及背景分支上的ω值（圖1），這2個模型相互比較時，自由度是2，2Δl＝2（－10529．55－（－10535．68））＝12．26，χ2測驗顯示P＜0．01。該結(jié)果表明，這2個分支的確有不同的ω。自由比率模型假定每個分支都有自己的ω。在該模型中，大部分分支的ω小于1，所以它們處于加強的負選擇下（圖1）。但是分支a、b、c、d可能處于減輕的負選擇甚至正選擇下，因為它們的ω大于1（表3）。不過，分支a的ω無窮大是源于缺乏同義替換。在該分析中，自由模型下的似然值l1＝－10471．25（表3），該模型共有67個參數(shù)，和單比率模型比較，2倍的似然值差異為2Δl＝128．86。依χ2分布，自由度df＝32檢驗顯著性，結(jié)果表明，該模型顯著優(yōu)于單比率模型。位點模型假定位點間的選擇壓力在變化而分支間的壓力不變化，而分支－位點模型認為選擇壓力在位點間和分支間都改變。運用這2個模型可以檢測那些受到正選擇的位點。位點模型從分支P和B上都沒有檢測到受到正選擇的位點，但是分支－位點模型從分支B上檢測到了正選擇位點（P＞95％：320R、22G、93C、244S、261G、265W），而在分支P上沒有檢測到（表3）。   3結(jié)論與討論   裸子植物的PHYP和被子植物中的PHYB同為B類光敏色素［21］，試驗對這2個類型PHY基因的光感受區(qū)研究發(fā)現(xiàn)，被子植物PHYB的分支中在P＞95％的水平上有6個正選擇位點的出現(xiàn)（表3），該研究結(jié)果和Yang［9］在對被子植物光敏色素B－D／E的研究中檢測到了正選擇位點的結(jié)果保持一致。這說明，樣本的大小對研究結(jié)果影響不大。在該區(qū)域構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，強烈的正選擇壓力趨向于發(fā)生在裸子植物近期分化的屬內(nèi)種間的譜系中，而在相對距離較遠的古老譜系中缺少這種壓力（圖1），并且，盡管在少數(shù)較近的PHYP分支（Recentlineages）中檢測到有正選擇的發(fā)生，但是沒有檢測到正選擇位點，該結(jié)果與試驗前期研究裸子植物PHYP的PHY－PAS1結(jié)構(gòu)域適應(yīng)性進化的結(jié)果類似［22］。裸子植物PHYP和被子植物PHYB基因的這種差異可能是由光敏色素的進化速率不同引起的。據(jù)Schneider－Poetsch等［21］報道，裸子植物光敏色素的進化速率要低于被子植物光敏色素。因此，裸子植物和低等植物的光敏色素進化距離要小于被子植物的光敏色素。所以，即使裸子植物PHYP的光感受區(qū)發(fā)生過正選擇（圖1，分支a，b，c，d），但是可能目前的模型還不夠靈敏，不能準確鑒定出該區(qū)域中的正選擇位點。