前言：中文期刊網(wǎng)精心挑選了藤野先生范文供你參考和學(xué)習(xí)，希望我們的參考范文能激發(fā)你的文章創(chuàng)作靈感，歡迎閱讀。

藤野先生范文1

本設(shè)計(jì)以話題為教學(xué)板塊，以主問題為教學(xué)主線，以追問層層深入，步步展開，從藤野先生和魯迅先生兩個(gè)角度引領(lǐng)學(xué)生分析人物形象，探索人物思想，體會(huì)人物精神，既完成了教學(xué)目標(biāo)，又落實(shí)了教學(xué)重點(diǎn)，突破了教學(xué)難點(diǎn)。

【教學(xué)目的】

通過抓重點(diǎn)語(yǔ)句，品關(guān)鍵字詞，了解藤野先生這一人物形象，體會(huì)作者對(duì)恩師的感激、懷念之情及深沉的愛國(guó)情懷。

【教學(xué)過程】

話題一：以藤野先生為核心

主問題：魯迅感念師恩，筆下情深。結(jié)合文章內(nèi)容，梳理：作者回憶了與藤野先生交往的幾件事？并評(píng)價(jià)藤野先生這一人物形象。

活動(dòng)1：梳理文章結(jié)構(gòu)。

預(yù)設(shè)：

①地點(diǎn)：在東京在仙臺(tái)在北京。

②在仙臺(tái)：初見藤野先生交往藤野先生告別藤野先生。

③交往四件事：添改講義改正解剖圖關(guān)心解剖實(shí)習(xí)詢問中國(guó)女人裹腳。

活動(dòng)2：分析藤野形象。

預(yù)設(shè)：

①“總要看一看才知道。究竟是怎么一回事呢？”

――從“總要”“究竟”兩詞中可見藤野先生熱愛醫(yī)學(xué)研究，且研究很務(wù)實(shí)。

②“冬天是一件舊外套，寒顫顫的。”

――可見藤野先生生活簡(jiǎn)樸，不拘小節(jié)。

③“原來我的講義已經(jīng)從頭到末……骨學(xué)，血管學(xué)，神經(jīng)學(xué)。”

――從“從頭到末”“都”“不但”“連”“直到”等詞可見藤野先生工作認(rèn)真，治學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)。

④“你看，你將這條血管移了一點(diǎn)位置了……我們沒法改換它。”

――可見先生嚴(yán)謹(jǐn)治學(xué)、循循善誘、和藹可親。

⑤“現(xiàn)在總算放心了，沒有這回事”。

――可見藤野先生對(duì)魯迅先生的關(guān)心與掛念。

⑥“希望中國(guó)有新的醫(yī)學(xué)。”“希望新的醫(yī)學(xué)傳到中國(guó)去”。

――可見藤野先生沒有狹隘的民族主義偏見。

活動(dòng)3：體會(huì)作者情感。

預(yù)設(shè)：

①你能體會(huì)當(dāng)時(shí)身在異國(guó)的青年魯迅拿到添改后的講義時(shí)的心情嗎？（明確：除了對(duì)藤野先生的敬佩，還有對(duì)藤野先生的感激。）

②“他嘆息說。”文中“嘆息”總共出現(xiàn)兩次，請(qǐng)找出兩次“嘆息”進(jìn)行品讀，體會(huì)兩次“嘆息”的不同情感。（明確：第一次“嘆息”在23段，遺憾于對(duì)裹腳的研究不能親眼看一看，為醫(yī)學(xué)研究而嘆息，讓魯迅先生敬佩；第二次“嘆息”為魯迅先生的離開，讓魯迅先生感激。）

③當(dāng)時(shí)的青年魯迅并不能完全理解藤野先生的苦心，但是時(shí)隔多年以后再想起這件事，他的心情會(huì)怎樣呢？（明確：要體會(huì)魯迅先生對(duì)藤野先生的這份敬重、感激與懷念，還要聯(lián)系當(dāng)時(shí)的魯迅先生生活的背景。）

話題二：以魯迅先生為核心

主問題：對(duì)“藤野先生”的感激與懷念是文章的明線，文章中還有一條暗線，那就是魯迅先生深沉的愛國(guó)情懷。瀏覽課文，概括能體現(xiàn)“我”愛國(guó)情懷的事情，并體會(huì)作者的不同情感。

活動(dòng)4：概括背景內(nèi)容。

預(yù)設(shè)：

①諷刺清國(guó)留學(xué)生；②地名“水戶”“日暮里”； ③匿名信事件；④看電影事件；⑤深夜寫文。

活動(dòng)5：分析愛國(guó)情感。

預(yù)設(shè)：

①諷刺清國(guó)留學(xué)生：“上野的櫻花……實(shí)在標(biāo)致極了。”――品析關(guān)鍵詞“速成班”“油光可鑒”“扭幾扭”“標(biāo)志”，體會(huì)清國(guó)留學(xué)生不以為恥反以為榮的丑態(tài)。

②地名：“日暮里”――“日暮鄉(xiāng)關(guān)何處是”；“水戶”――明朝遺民，對(duì)祖國(guó)的思念之情。

③匿名信事件：“中國(guó)是弱國(guó)，所以中國(guó)人當(dāng)然是低能兒。”――這是誰(shuí)的觀點(diǎn)，這觀點(diǎn)成立嗎？

引導(dǎo)：“因?yàn)?15男寢扣分，所以515寢室所有男生都是問題學(xué)生。”――體會(huì)魯迅先生當(dāng)時(shí)作為弱國(guó)國(guó)民的辛酸與憤懣。

④看電影事件：“這種歡呼，是每看一片都有的……我的意見卻變化了。”――品讀“歡呼”“酒醉似的喝彩”，體會(huì)國(guó)民的麻木、愚昧、落后。

⑤深夜寫文：“每當(dāng)夜間疲倦，正想偷懶時(shí)……再繼續(xù)寫些為‘正人君子’之流所深惡痛疾的文字。”――關(guān)鍵詞：“夜間”“良心發(fā)現(xiàn)”“正人君子”。（明確：“夜間”寫作時(shí)，社會(huì)環(huán)境黑暗；“良心發(fā)現(xiàn)”體現(xiàn)作者對(duì)國(guó)家民族的責(zé)任感；“正人君子”反語(yǔ)，諷刺軍閥政客的御用文人。）

藤野先生范文2

1.品味語(yǔ)言，理解藤野先生的高尚品質(zhì)。

2.學(xué)習(xí)襯托的寫作手法。

【教學(xué)重難點(diǎn)】：圍繞文章如何塑造藤野先生這一“偉大”形象梳理課文，體會(huì)散文形散神聚的特點(diǎn)。

【課時(shí)安排】：一課時(shí)

【教學(xué)設(shè)想】：

1.本文篇幅較長(zhǎng)，是用早期白話寫成的，又有很多含義深刻的語(yǔ)句，理解起來有一定的難度。所以要求學(xué)生課前要做好預(yù)習(xí)，要多讀課文。課上時(shí)間不可能通讀，只能是有重點(diǎn)地朗讀。

2.本文知識(shí)點(diǎn)眾多，學(xué)習(xí)時(shí)不求面面俱到，但重點(diǎn)是必須完成的，難點(diǎn)是必須要突破的，通過研討學(xué)習(xí)一定要讓學(xué)生情感上有觸動(dòng)、思想上有收獲、語(yǔ)文能力上有提高。

【教學(xué)步驟】：

一、情境導(dǎo)入：

魯迅先生在他諸多的老師中，只寫過三位：一位是他的私塾老師壽鏡吾先生；一位是他的日本老師藤野先生；還有一位就是他青年時(shí)期的老師章太炎先生。在這三位中魯迅最傾注深情的就是藤野先生了，今天我們就來學(xué)習(xí)這篇《藤野先生》。

二、整體把握:

在闊別20年后魯迅曾這樣飽含深情的評(píng)價(jià)藤野先生，課本37段，我來讀一下。（ppt顯示）

但不知怎地，我總還時(shí)時(shí)記起他，在我所認(rèn)為我?guī)煹闹校亲钍刮腋屑ぃo我鼓勵(lì)的一個(gè)。有時(shí)我常常想：他的對(duì)于我的熱心的希望，不倦的教誨，小而言之，是為中國(guó)，就是希望中國(guó)有新的醫(yī)學(xué)；大而言之，是為學(xué)術(shù)，就是希望新的醫(yī)學(xué)傳到中國(guó)去。他的性格，在我的眼里和心里是偉大的，雖然他的姓名并不為許多人所知道。

如果用一個(gè)詞概括藤野先生在魯迅心中的地位，就應(yīng)該是――生答“偉大”。一個(gè)普通日本教師何以受得起魯迅先生這么高的評(píng)價(jià)呢？這是我們這節(jié)課要集中探討的問題。

三、請(qǐng)大家自讀6―23段，結(jié)合具體的語(yǔ)句做批注：你讀出了一個(gè)怎樣的藤野先生？

（ppt顯示）

示例：原來我的講義已經(jīng)從頭到末，都用紅筆添改過了，不但增加了許多脫漏的地方，連文法的錯(cuò)誤，也都一一訂正。這樣一直繼續(xù)到教完了他所擔(dān)任的功課：骨學(xué)、血管學(xué)、神經(jīng)學(xué)。

“從頭到末”“不但……連……也都……”“一一”“一直”這些加點(diǎn)詞看出藤野先生是真正關(guān)心我，他為我修改講義，不是心血來潮，而是自始至終的認(rèn)真，直到為我改完了三科。并且取得了“在中間”這一對(duì)外國(guó)留學(xué)生來說很不錯(cuò)的的成績(jī)。平淡的敘述下是對(duì)藤野先生強(qiáng)烈的感激與崇敬，讀此段除了重讀加點(diǎn)詞外，還要讀出舉重若輕的感覺。

小結(jié)：文章選取了6件典型事例，從不同的側(cè)面表現(xiàn)了藤野先生的高貴品質(zhì)。但在我們看來藤野先生做的這些都是教師的本分啊，怎么就“偉大”了呢？

四、請(qǐng)大家注意，文章題為藤野先生，但有一半以上的篇幅沒有寫藤野先生，文中還寫了哪些人哪些事呢？這與藤野先生有什么聯(lián)系？跳讀課文其他段落做批注。

清國(guó)留學(xué)生賞櫻花學(xué)跳舞――見到藤野先生的原由；

途經(jīng)日暮里水戶――作者學(xué)醫(yī)的主要?jiǎng)訖C(jī)；

初到仙臺(tái)受優(yōu)待――正面襯托；

匿名信事件――反面襯托；

看電影事件――告別的直接原因。

（ppt顯示）

助讀資料：

魯迅到日本去的時(shí)候，日本的國(guó)力正是逐漸強(qiáng)盛，獨(dú)霸東亞的野心也日漸膨脹，又剛剛在中殲滅了中國(guó)的北洋水師，舉國(guó)上下都彌漫著一股鄙視中國(guó)人的風(fēng)氣。有的報(bào)紙就公開宣稱：“西洋人視中國(guó)人為動(dòng)物，實(shí)際確乎不得不產(chǎn)生動(dòng)物、下等動(dòng)物的感覺，因此，他們（指中國(guó)人）在生理上已失去人類的資格。”因此，魯迅在這個(gè)時(shí)候去日本留學(xué)，便不可避免地受到種種歧視和輕蔑。

藤野先生在日本并非著名學(xué)者，其言其行也許并非楷模，但是，在對(duì)待魯迅，其實(shí)也是對(duì)待中國(guó)人的態(tài)度上，確實(shí)難能可貴！須知，那是在中國(guó)在慘敗之時(shí)；是在日本獨(dú)霸東亞的野心日漸膨脹，舉國(guó)上下都彌漫著一股鄙視中國(guó)人的風(fēng)氣之時(shí)；是在日本人視中國(guó)人為“豬頭三”、“下等動(dòng)物”之時(shí)。

（ppt顯示）

課中微型講座

襯托，烘云托月

襯托是一種寫作手法。

正襯：用類似的事物襯托所描繪的事物。

反襯：用相反或相異的事物襯托所描繪的事物。

襯托的作用：能突出主體或渲染主體，使之形象鮮明，給人以深刻的感受。

小結(jié)：表面上看似游離的成分實(shí)際是緊扣主題的，體現(xiàn)了散文形散神聚的特點(diǎn)。正因?yàn)橛辛诉@些背景的襯托，有了這抹心靈的底色，在魯迅心中藤野先生的形象才像黑暗中的蠟燭一樣閃耀著“偉大”光芒。

藤野先生范文3

1、好詞：物以希為貴、無非、何嘗、 詰責(zé)、托辭、寒顫顫、無從說起、杳無消息。

2、好句：東京也無非是這樣。上野的櫻花爛熳的時(shí)節(jié)，望去確也象緋紅的輕云，但花下也缺不了成群結(jié)隊(duì)的“清國(guó)留學(xué)生”的速成班，頭頂上盤著大辮子，頂?shù)脤W(xué)生制帽的頂上高高聳起，形成一座富士山。也有解散辮子，盤得平的，除下帽來，油光可鑒，宛如小姑娘的發(fā)髻一般，還要將脖子扭幾扭。實(shí)在標(biāo)致極了。

3、每當(dāng)夜間疲倦，正想偷懶時(shí)，仰面在燈光中瞥見他黑瘦的面貌，似乎正要說出抑揚(yáng)頓挫的話來，便使我忽又良心發(fā)現(xiàn)，而且增加勇氣了，于是點(diǎn)上一枝煙，再繼續(xù)寫些為“正人君子”之流所深惡痛疾的文字。

4、上野的櫻花爛熳的時(shí)節(jié)，望去確也象緋紅的輕云，但花下也缺不了成群結(jié)隊(duì)的“清國(guó)留學(xué)生”的速成班，頭頂上盤著大辮子，頂?shù)脤W(xué)生制帽的頂上高高聳起，形成一座富士山。

（來源：文章屋網(wǎng) ）

藤野先生范文4

您可還好？

掐指算算，這已是學(xué)生與您分別的第二十個(gè)春秋了。

您的身體是否安好，學(xué)術(shù)方面又是否有了新的突破？現(xiàn)在給您寫的這封信，怕是晚了很久吧，您可怪我？

分別的時(shí)候您特地叮囑我要寄張相片給您，可我離開仙臺(tái)之后就多年未照相了，應(yīng)允您的照片就耽擱了。多年未曾聯(lián)系，不期您能原諒，只望能得到您的消息，以至于心中不再那么愧疚。

二十年前，學(xué)生曾對(duì)您說要去學(xué)生物學(xué)，請(qǐng)?jiān)彯?dāng)時(shí)對(duì)您撒的謊——其實(shí)學(xué)生從二十年前起就已經(jīng)棄醫(yī)從文了。

學(xué)生曾以為，中國(guó)之所以是弱國(guó)，是“東亞病夫”，是因?yàn)閲?guó)人身體素質(zhì)的原因。再加上我父親是因病去世，于是我便去留學(xué)學(xué)醫(yī)，想要救活像我父親似的被誤的病人的疾苦，戰(zhàn)爭(zhēng)時(shí)候便去當(dāng)醫(yī)。

但是我錯(cuò)了，原來“東亞病夫”的“病”不在身上，而在精神上，思想上！

在仙臺(tái)學(xué)醫(yī)時(shí)，曾看過一部反應(yīng)日戰(zhàn)的片子，片中的中國(guó)人被殺，周圍的同胞卻在看熱鬧，在拍手叫好！

學(xué)生突然感覺學(xué)醫(yī)好像并不是一件很要緊的事情了。學(xué)生想，自己是不是該放棄了？

即使這樣，學(xué)生依然對(duì)您對(duì)學(xué)生的種種謹(jǐn)記于心。您曾改整過的講義，學(xué)生訂了三大厚本收藏著，這包含了您給予給學(xué)生的許多——不僅僅是學(xué)術(shù)上，更是精神上。

你會(huì)支持學(xué)生的從文嗎？

先生，也許學(xué)生此生都不會(huì)再見到您了，但您的教導(dǎo)，您的鼓勵(lì)，學(xué)生此生都不會(huì)忘懷。

望一切平安

藤野先生范文5

您好！

離開仙臺(tái)已有20多年了，您還好嗎？十分抱歉，因總感事業(yè)無成，所以也就沒有給您寫過一封信，您不會(huì)怪我吧？

當(dāng)年，我因?yàn)橛X得中國(guó)是個(gè)弱國(guó)，振奮民族精神勢(shì)在燃眉，所以我棄醫(yī)從了文，記得那時(shí)，我對(duì)您說我去學(xué)生物，其實(shí)是在騙您的，為的就是不想讓您難過，不過，我相信，您一定能理解我這顆愛國(guó)之心的對(duì)吧？

現(xiàn)在，我想我應(yīng)該做的便是用文學(xué)來挽救那些已經(jīng)麻木的中國(guó)人，作為青年應(yīng)該放責(zé)任在自己身上，向前走，把革命的偉大擴(kuò)大。我十分感謝您對(duì)我的栽培之恩，要不是您，我可能不會(huì)有此抱負(fù)，更不會(huì)知道關(guān)愛是無國(guó)界的。

轉(zhuǎn)眼二十載，無數(shù)話言之不盡，只愿您能永遠(yuǎn)健健康康，開開心心地度過每一天！

此致

敬禮

您永遠(yuǎn)的學(xué)生：周樹人

藤野先生范文6

關(guān)鍵詞靶向親和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)； 黃藤總生物堿； 乙酰膽堿酯酶； 抑制劑

1引 言

阿爾茨海默病 （Alzheimer's disease， AD） 是以大腦中β淀粉樣蛋白老年斑 （SPs） 沉積、神經(jīng)纖維纏結(jié) （Neurofibrillary tangles， NFTs） 和突觸及神經(jīng)元缺失為特征的一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，已成為威脅現(xiàn)代社會(huì)老年人健康的重大疾病之一[1]。針對(duì)AD的病理特征及病因所研發(fā)的藥物中， 乙酰膽堿酯酶抑制劑（AChEI）已廣泛用于臨床治療AD。AchEI通過抑制體內(nèi)AChE活性，減少乙酰膽堿分解，緩解AD對(duì)生活能力和認(rèn)知能力的損害[2]。但已上市的AChEI如他克林、利斯的明等雖然有一定效果，但存在活性不強(qiáng)、副作用較大的缺點(diǎn)[3]。目前，從中藥中尋找具有選擇性強(qiáng)、副作用小的AChEI成為醫(yī)藥研究的熱點(diǎn)[4～6]，同時(shí)也是治療AD的研究中最活躍的領(lǐng)域。

黃藤為防己科天仙藤屬植物黃藤（Fibraurea recisa Pierre.）的藤莖，收載于2015年版藥典，具有清熱解毒、瀉火通便的功效，主要含有異喹啉類生物堿，具有抗真菌[7]、抗炎、抗腫瘤[8]等藥理作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[9]，黃藤總生物堿主要成分為黃藤素， 具有顯著抑制AChE活性的作用。

靶向親和技術(shù)主要利用親和原理，將待測(cè)的具有潛在活性的小分子混合物與生物活性受體（主要是酶類）在接近生理?xiàng)l件下的緩沖液中混合，得到受體配體復(fù)合物和未結(jié)合的小分子化合物，通過超濾除去未結(jié)合的小分子，復(fù)合物經(jīng)有機(jī)溶劑處理，將小分子配體釋放出來，再通過LCMS技術(shù)，直接或者間接檢測(cè)解離的復(fù)合物[10，11]。與傳統(tǒng)生物活性篩選方法即在化合物庫(kù)中逐一的篩選相比，此方法靈敏、快速，且不改變蛋白結(jié)構(gòu)， 可以高通量地篩選出活性化合物[12，13]， 已廣泛用于篩選與靶蛋白結(jié)合的藥物中[14]，成為藥物篩選的重要工具[6，15，16]。本研究采用靶向親和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)篩選黃藤中能夠抑制乙酰膽堿酯酶的活性成分，篩選出12種具有潛在抑制乙酰膽堿酯酶的活性成分，并鑒定了其中6種化合物，為建立中藥中乙酰膽堿酯酶抑制劑的快速篩選提供了科學(xué)依據(jù)。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

Agilent 1100 series LCMSD液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent公司），包括：Agilent SL型多級(jí)離子阱質(zhì)譜儀、低壓四元梯度泵、二極管陣列檢測(cè)器（DAD）、自動(dòng)進(jìn)樣、柱溫箱、Chemistation化學(xué)工作站等； BS124S電子天平（美國(guó)賽多利斯公司）； MR96A自動(dòng)酶標(biāo)儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）； XL90超速離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）； 旋D式恒溫振蕩器（蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）； 尤尼柯UV2800紫外可見分光光度計(jì)（尤尼柯（上海）儀器有限公司）； RE5298型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

黃藤藥材購(gòu)于安國(guó)市瑞泰堂藥材行，經(jīng)吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院趙全成研究員鑒定為防己科天仙藤屬植物黃藤（Fibraurea recisa Pierre.）的干燥藤莖； 黃藤素、鹽酸藥根堿、鹽酸小檗堿均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院（批號(hào)分別為：0732200005、110733201007、110713200609）； 巴馬汀紅堿、7，8二氫8羥基小檗堿、Groenlandicine（自制，純度≥98%）。乙酰膽堿酯酶（來源于蒼蠅頭部， 上海源葉生物科技有限公司）； 碘化硫代乙酰膽堿（ATCI）、5，5二硫雙（2硝基苯甲酸）（DTNB）（美國(guó)Sigma公司）； 鹽酸多奈哌齊（衛(wèi)材（中國(guó)）藥業(yè)有限公司）； YM30離心超濾管（美國(guó)Millipore公司）； 24孔板，96孔板（美國(guó)Corning公司）； 乙睛、甲醇和甲酸均為色譜純（美國(guó)Fisher公司）； 實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水； 其余試劑均為分析純。

2.2黃藤總生物堿樣品的制備

取黃藤藥材2 kg，用10倍量的60%乙醇回流提取2次，每次2 h，濾過，合并濾液，減壓濃縮得浸膏228.3 g。將浸膏加水溶解，通過預(yù)先處理好的D101大孔樹脂柱（Φ100×10 cm），先用3倍柱體積水洗，再用8倍柱體積40%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇，干燥，得黃藤總生物堿50.6 g。

取黃藤總生物堿適量，加0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 8.0）溶解，制成1.0 mg/mL的溶液，用于超濾實(shí)驗(yàn)和活性實(shí)驗(yàn)分析。取黃藤總生物堿適量，加甲醇溶解并配制成0.1 mg/mL溶液，用于液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析； 黃藤素、鹽酸藥根堿、鹽酸小檗堿、巴馬汀紅堿、7，8二氫8羥基小檗堿、Groenlandicine對(duì)照品用上述的0.1 mol/L PBS溶液配成1.0 mg/mL溶液，用于活性實(shí)驗(yàn)分析。

2.3乙酰膽堿酯酶（AChE）活性抑制實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[17]方法并做適當(dāng)調(diào)整，在96孔板中加入0. 1 mol/L PBS緩沖液（pH 8.0） 140 μL，待測(cè)樣品溶液20 μL和0.5 U/mL酶溶液15 μL，混勻，在4℃放置20 min。加入2 mmol/L DTNB 10 μL和15 mmol/L ATCI 10 μL，37℃反應(yīng)20 min，立刻測(cè)定405 nm處吸光度值。同時(shí)設(shè)立背景對(duì)照組和空白對(duì)照組。按下式計(jì)算酶活性抑制率（Enzyme activity inhibition ratio， EAIR）。

EAIR（%）=Ablank-（Asample-Abackground）Ablank×100%（1）

其中， Ablank表示不加樣品體系的吸光度值； Asample表示為加入樣品和酶的體系吸光度值； Abackground表示為不加酶的體系吸光度值。

樣品組設(shè)定5個(gè)等梯度濃度，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。以樣品濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以AChE抑制率為縱坐標(biāo)，繪制曲線，計(jì)算IC50。

2.4離心超濾篩選方法

參照文獻(xiàn)[15，18]的方法，在24孔板中加入0.1 mol/L PBS緩沖液（pH 8.0）300 μL、1 mg/mL黃藤總生物堿溶液100 μL、0.5 U/mL乙酰膽堿酯酶的酶液100 μL，37℃孵育30 min，轉(zhuǎn)移至離心超濾管（YM30）中。12000 r/min離心20 min，加PBS緩沖液重復(fù)3次，每次500 μL，棄去離心液，再向超濾管中加入90%（V/V）甲醇500 μL，室溫放置10 min后，離心15 min，重復(fù)3次，合并離心液，冷凍干燥后加40 μL甲醇/水（50∶50， V/V）溶解，用于LCMS/MS分析。同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組。

同時(shí)，為了考察酶與底物的相互作用強(qiáng)度，設(shè)置了滅活酶的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。AChE經(jīng)100℃熱滅活后，通過AChE的抑制率實(shí)驗(yàn)確定酶已失活。并稱取等量的滅活酶同法處理進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，求出結(jié)合率（Binding degree， BD）[19]。

BD（%）= （Ab-Ac） /Aa×100%（2）

其中， Aa表示親和離心超濾篩選前黃藤總生物堿溶液各化合物色譜峰面積； Ab表示親和作用后活性酶結(jié)合的各相對(duì)應(yīng)化合物的色譜峰面積； Ac表示變性失活酶結(jié)合的各相對(duì)應(yīng)化合物的色譜峰面積。

2.5色譜與質(zhì)譜條件

液相色譜條件： ACE C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm， 5 μm）； 流動(dòng)相： 乙腈0.1% H2PO4（每100 mL中加0.1 g 十二烷基硫酸鈉）=36∶64（V/V）； 流速： 1 mL/min； 檢測(cè)波長(zhǎng)： 345 nm； 柱溫： 30℃； 進(jìn)樣量： 10 μL。

質(zhì)譜條件： 電噴霧離子源（ESI）； 正離子模式同時(shí)采集； 掃描范圍m/z 50～1200； 目標(biāo)分子量： 350 Da； 干燥氣溫度： 350℃； 干燥氣流量： 10.0 L/min； 霧化氣壓強(qiáng)： 0.24 MPa； 毛細(xì)管電壓： 4 kV。

3結(jié)果與討論

3.1黃藤總生物堿的含量測(cè)定結(jié)果

參照文獻(xiàn)[20]中總生物堿的測(cè)定方法，以黃藤素為對(duì)照品，采用0.05%溴甲酚綠為酸性染料進(jìn)行染色，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，最終選擇在345 nm測(cè)得2.2項(xiàng)下制備的樣品中總生物堿的含量為97.5%。說明制備的樣品主要成分為生物堿類成分，本研究所建立的提取方法可以作為黃藤總生物堿的提取方法。

3.2黃藤總生物堿的靶向親和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析

黃藤總生物堿經(jīng)親和超濾實(shí)驗(yàn)共篩選出12種可能的AChE抑制劑（見圖1A）。與黃藤總生物堿原溶液的HPLC色譜圖（圖1B）相比，在超濾實(shí)驗(yàn)條件下黃藤總生物堿中只有部分化合物能夠與乙酰膽堿酯酶結(jié)合。并且與不加酶的空白對(duì)照試驗(yàn)的HPLC色譜圖相比，說明本方法可以有效地避免由小分子化合物吸附到超濾膜上而造成假陽(yáng)性（圖1C）。 進(jìn)行了黃藤總生物堿與滅活的乙酰膽堿酯酶的結(jié)合實(shí)驗(yàn)，依據(jù)色譜峰的峰面積與其在緩沖溶液中的濃度成正比，利用圖1B和1D的HPLC色譜圖中峰面積的變化情況來反映其對(duì)應(yīng)的化合物與AChE的結(jié)合率[12]，求出各化合物與AChE的結(jié)合率均大于13.00%，這表明黃藤總生物堿中的活性成分能夠與AChE有效結(jié)合（圖1D）。對(duì)陽(yáng)性對(duì)照藥鹽酸多奈哌齊進(jìn)行了超濾實(shí)驗(yàn)（見圖1E），結(jié)果表明， 超濾實(shí)驗(yàn)方法可行，具有較強(qiáng)的準(zhǔn)確性。

采用HPLCDADESIMS2聯(lián)用技術(shù)，在正離子模式下，通過自動(dòng)二級(jí)質(zhì)譜方式同時(shí)獲取樣品中生物堿類成分的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖，根據(jù)每一成分的色V保留時(shí)間、準(zhǔn)分子離子峰和二級(jí)質(zhì)譜碎片信息，參照ESIMSn數(shù)據(jù)、標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品及文獻(xiàn)[7，21～23]數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，確定了黃藤總生物堿中12種可能的AChE抑制劑，并且鑒定了其中6種化合物的的結(jié)構(gòu)，分析結(jié)果見表1。