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導游致謝詞范文1

[關鍵詞]甘草；愈傷組織；藥用次生代謝產物；HPLC；指紋圖譜；差異度

甘草是世界上最古老也是最常用草本藥材之一，大量使用和長期過度開發使得世界上的野生甘草資源面臨枯竭的危機。甘草植物細胞和組織培養是生產藥用材料尤其是其活性成分的一種有意義的技術。但是到目前為止，所有有關甘草細胞誘導和培養的研究報道只關注愈傷組織誘導條件對細胞中某類特定的次生代謝產物合成的影響[1-5]，未見關于不同誘導條件對甘草愈傷組織次生代謝產物多樣性影響的報道。盡管誘導培養獲得的細胞與野生或人工種植的甘草藥材含有相似的活性次生代謝產物，但是如果它們的次生代謝產物有顯著差異，它們的藥用價值是不相同的。同時，作為一個培養生產中藥植物藥用成分或組分的技術，合適的細胞株系建立和選擇與其次生代謝產物多樣性密切相關。因此，本實驗旨在利用一種簡單快速的方法來評價不同誘導培養條件對甘草愈傷組織次生代謝產物多樣性的影響，具體來說是結合對愈傷組織的總黃酮化學分析和HPLC指紋圖譜分析來定性定量評估不同誘導培養條件下甘草愈傷組織的次生代謝產物多樣性的差異以及甘草愈傷組織與道地種植的甘草藥材的差異，從而為高產藥用次生代謝產物以及植物細胞作為替代藥材的甘草細胞株系的篩選提供實驗依據。

1材料與方法

1.1樣品 甘草種子和三年生甘草根均購自新疆神農有限公司，經天津中醫藥大學李天祥教授鑒定為脹果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat.，GI）和光果甘草（G. glabra L.，GG）；乙腈（NO.100269，SK Chemicals，Korea）和冰乙酸（天津光復精細化工研究所）均為色譜級；實驗中所用到的其他的化學品除有特別說明外，均為分析級藥品。

1.2種子萌發 挑選充實飽滿的脹果甘草和光果甘草種子，用玻璃砂研磨去除表面蠟質種皮，自來水沖洗7～10遍，用75%的乙醇消毒20 s后，用無菌水沖洗5～7遍，接著用3.68 mmol?L-1HgCl2溶液消毒7～8 min，再用無菌水沖洗7～10遍，用無菌濾紙吸干種子表面水分后接種到MS0（不添加激素）瓊脂培養基上[6]，置于黑暗條件下，25 ℃培養。3 d后，種子萌發出新鮮的嫩芽。

1.3愈傷組織誘導和繼代 胚軸和子葉是文獻中最常用的甘草愈傷組織誘導的2種外植體，成功率較高[1-2，7]。本研究選擇這2種外植體進行研究，將萌發11 d后的無菌苗胚軸切成約0.5 cm的小段，子葉切成約0.5 cm2的小塊接種到誘導培養基上（MS基本培養基+激素+質量分數為3%的蔗糖+質量分數為0.7%的瓊脂），pH 5.8。根據文獻選擇的其他典型的愈傷組織誘導的激素組成和光照條件見表1[2，5，8]。25 ℃培養，8 d后，進行第1次繼代，繼代的愈傷組織的培養條件和培養基組成與愈傷組織誘導相同，繼代周期為21 d[9]。

1.4愈傷組織分析樣品的制備 不同誘導條件下獲得的甘草愈傷組織連續繼代4次，生長穩定后，取培養1個周期的愈傷組織，45 ℃干燥至恒重，然后將愈傷組織研磨成粉末，取0.2 g甘草愈傷組織粉末加入10 mL 70%乙醇，室溫下放置24 h，超聲提取30 min，放冷至室溫，補足溶液到刻度，取上清過0.45 μm濾膜備用。

1.5總黃酮含量的測定 準確量取2 mL樣品溶液，加入0.5 mL質量分數為10%KOH，渦旋混勻，室溫下放置5 min，加 70%乙醇到10 mL，渦旋混勻，室溫下放置90 min，以 70%乙醇為空白對照，在400 nm波長下測定樣品吸光度，以甘草苷為對照品繪制標準曲線。

1.6HPLC色譜分析條件 Agilent 1100高效液相色譜儀（配有G1314A紫外檢測器、G1311四元梯度泵、G1379A在線脫氣裝置、G1329B自動進樣器），Agilent 1100化學工作站；色譜柱為Apollo C18柱（4.6 mm×250 mm，粒徑5 μm）。檢測波長254 nm；流速為1 mL?min-1；檢測溫度為25 ℃；進樣量20 μL，流動相A乙腈，B 1%醋酸溶液，流動相梯度為0 min，90% B；15 min， 80% B；35 min， 70% B；45 min，50% B；50 min，40% B；55～65 min，30% B；70 min，50% B；75 min，70% B；80 min，90% B。

1.7數據分析 本實驗中的所有數據都是采用至少3個重復，以±s表示。采用單因素方差法（One-Way ANOVA）分析不同誘導培養條件對甘草愈傷組織總黃酮含量的影響。采用中藥指紋圖譜相似度評價系統（2004，A版）分析愈傷組織次生代謝產物的多樣性的差異。

2結果與討論

2.1不同誘導培養條件對甘草愈傷組織總黃酮含量的影響 為考察不同誘導培養條件對甘草愈傷組織總黃酮含量的影響，分別選取了一些典型的誘導條件包括甘草種屬、外植體、光照條件和激素組合進行了5組試驗，見表1。其中，處理組A和B，C和D，A和C，D和E分別考察2種甘草種屬、光和暗條件、2種外植體、2種激素組合對甘草愈傷組織總黃酮含量的影響，結果見圖1。

在本研究中，采用甘草苷為對照品，以甘草苷的濃度C為橫坐標，以吸光度A為縱坐標，測得甘草苷對照品的回歸曲線為Y= 0.015 8X，R2=0.999 1，實驗表明對照品質量濃度在20～100 μg?L-1與吸光度A呈良好的線性關系。檢測栽培甘草根和甘草愈傷組織中總黃酮的含量，結果表明，5種誘導培養條件下獲得的愈傷組織中總黃酮的質量分數為15～60 mg?g-1干重，比相同種屬栽培甘草根中總黃酮的含量（GI為120 mg?g-1干重，GG為55 mg?g-1干重）要低很多。相同培養條件下，不同種屬的甘草誘導的愈傷組織中總黃酮的含量不同，脹果甘草誘導的愈傷組織（處理A）中總黃酮為25 mg?g-1干重，高于光果甘草誘導的愈傷組織（處理B）中總黃酮的15 mg?g-1干重；24 h連續光照條件下誘導培養的愈傷組織（處理D）總黃酮的質量分數（60 mg?g-1干重）要遠高于24 h黑暗條件下（處理C）培養的愈傷組織總黃酮（20 mg?g-1干重），這與楊世海等[9]利用烏拉爾甘草下胚軸為外植體在白色光照（熒光燈連續照射）和黑暗（24 h）培養愈傷組織進行有效成分分析時，得出的愈傷組織在光照條件下合成的黃酮類化合物的總量是黑暗條件下合成的化合物總量的2倍的結論一致。處理D，E的甘草愈傷組織中總黃酮含量都很高，但相差不大，見圖1。在選取考察的5個誘導培養條件中，脹果甘草的子葉為外植體在光照下誘導時選取的這2個激素都比較適合進行甘草愈傷組織總黃酮的生產。實驗結果采用單因素方差分析法（One-Way ANOVA）進行分析，甘草種屬、外植體和光照條件對甘草愈傷組織中總黃酮的含量具有極其顯著的影響，然而，激素組合對甘草愈傷組織中總黃酮的含量無顯著影響，見表2。植物細胞中黃酮類化合物的合成受誘導培養條件的影響，這與楊世海等[10]以烏拉爾甘草胚軸為外植體，以不同類型的培養基、不同培養基pH、培養基中添加不同激素等條件誘導并培養甘草愈傷組織，得到的愈傷組織中黃酮類化合物的含量不同的結論一致。

2.2甘草愈傷組織次生代謝產物的多樣性的差異 本文采用中藥指紋圖譜相似度評價系統（2004，A版）通過比較愈傷組織樣品HPLC圖中的峰面積、峰數量計算HPLC圖的相似度，從而獲得其差異度。5種典型誘導培養條件下甘草愈傷組織的次生代謝產物的多樣性組成的HPLC圖。用7種甘草黃酮及三萜類化合物作為對照品檢測誘導培養的甘草愈傷組織的化合物組成，結果顯示活性次生代謝產物甘草苷[11]、異甘草苷、甘草素[12]、甘草查爾酮A[13]、甘草酸以及異甘草素[14]都存在于本實驗中培養的甘草愈傷組織中，見圖2。

采用中藥指紋圖譜相似度評價系統計算不同誘導培養條件下的愈傷組織指紋圖譜間的相似度，差異度為1減去相似度值。首先，分析對甘草愈傷組織總黃酮含量具有極其顯著影響的誘導培養條件（甘草種屬、光照條件和外植體），結果顯示，甘草種屬（差異度=0.27）、光照條件（差異度=0.45）對甘草愈傷組織次生代謝產物的多樣性具有非常顯著的影響，誘導培養條件外植體（差異度=0.16）對甘草愈傷組織次生代謝產物的多樣性具有顯著的影響；接著，分析對甘草愈傷組織總黃酮含量無顯著影響的誘導培養條件（激素組合），結果表明，激素組合對甘草愈傷組織次生代謝產物的多樣性具有非常顯著影響（差異度=0.37），見表2。

采用中藥指紋圖譜相似度評價系統還可以得出甘草愈傷組織指紋圖譜之間的共有峰和非共有峰。分析對甘草愈傷組織次生代謝產物多樣性具有顯著影響的誘導培養條件，結果顯示不同的誘導培養條件下的甘草愈傷組織指紋圖譜間共有峰及非共有峰的數量并沒有顯著的差別（A和B，A和C，C和D，D和E）。

進一步對甘草愈傷組織中的峰面積占總峰面積百分比大于5%的色譜峰進行分析，可以看出相同色譜峰在不同指紋圖譜中的峰面積是不同的，即同一化合物在不同的愈傷組織中含量是不同的，例如化合物3和化合物6分別在誘導培養條件C，D中含量最高，每個指紋圖譜中出現在38.17 min的化合物的峰面積都遠遠高于其他4種化合物的峰面積。分別將每個指紋圖譜中5個化合物的峰面積相加在一起進行分析，結果顯示對甘草愈傷組織中5種主要化合物的總含量影響由大到小依次為光照條件、激素組成、外植體和甘草種屬。

綜上所述，對甘草愈傷組織中總黃酮的含量具有顯著影響的誘導培養條件對次生代謝產物的多樣性也具有顯著的影響[15]，對甘草愈傷組織中總黃酮含量影響小的誘導培養條件對次生代謝產物的多樣性也有可能會有顯著影響（表2），這是因為甘草愈傷組織中的次生代謝產物除黃酮外，還有許多其他的化合物。在這4種誘導培養條件中，光照條件對愈傷組織次生代謝產物的多樣性的影響最顯著（差異度=0.45），這可能是因為一些甘草次生代謝產物的基因只有在光照條件下才能表達，黑暗條件下這些基因不表達或黑暗條件抑制這些基因的表達[16]。

2.3甘草愈傷組織與人工栽培的甘草藥材次生代謝產物多樣性的比較 三年生脹果甘草和光果甘草中許多次生代謝產物的含量都高于甘草愈傷組織，然而，甘草愈傷組織中也有部分次生代謝產物的含量高于人工種植的甘草，如異甘草苷和甘草素見圖2，3。以人工種植的脹果甘草的指紋圖譜為對照圖譜，計算典型誘導培養下的甘草愈傷組織指紋圖譜與同種屬的人工種植的脹果甘草根指紋圖譜的相似度，進而計算差異度，結果處理A，C，D，E中的甘草愈傷組織與人工種植的脹果甘草的指紋圖譜差異度分別為0.90，0.95，0.94，0.86；以人工種植的光果甘草的指紋圖譜為對照圖譜，處理B與它的指紋圖譜差異度為0.92，可以看出甘草愈傷組織次生代謝產物的多樣性與人工種植的甘草藥材之間差別極其顯著。

3結論

本實驗采用總黃酮化學分析和HPLC指紋圖譜分析相結合的方法成功評價了典型誘導培養條件對甘草愈傷組織次生代謝產物多樣性的影響，不同誘導培養條件下的愈傷組織次生代謝產物的多樣性也明顯不同，光照條件（差異度=0.45）和激素組成（差異度=0.37）對愈傷組織次生代謝產物的多樣性影響最大。比較甘草愈傷組織的指紋圖譜和人工種植的甘草根的指紋圖譜，可以發現一些新的色譜峰，至于這些色譜峰所對應的化合物是不是新的化合物，需要結合HPLC-MS-NMR等方法進一步分析，如果產生系列新的化合物可以進一步建立一個新的化合物庫，為藥用植物資源的深度開發提供來新的資源。

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Significant impact of different induction conditions on metabolic

diversity of callus cell lines of Glycyrrhiza sp.

LIU Feng-cai1， LV Jian-ming2， WU Xiu-zhen1，2， ZHANG Wei1，2*

（1.Department of Biochemical Engineering， School of Chemical Engineering， Tianjin University， Tianjin 300072， China；

2.Tianjin Acelbio Biotechnology Co.， Ltd.， Tianjin International Joint Academy of Biotechnology and Medicine，

Tianjin 300457， China）

[Abstract] The purpose of this study was to evaluate the impact of callus induction and culture conditions on secondary metabolic diversity of the callus cell lines of traditional Chinese medicinal plant Glycyrrhiza sp. （Glycyrrhiza） by combined chemical analysis and HPLC fingerprint. These callus induction conditions included two Glycyrrhiza species， two types of explants， light and dark conditions， and two combinations of hormones. The evaluation was firstly based on the contents of total flavonoids in the callus by chemical analysis and one way ANOVA. The content of total flavonoids in callus was significantly （P