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酒席致謝詞范文1

[關(guān)鍵詞] 歐洲花楸懸浮細(xì)胞；酵母提取物；次生代謝產(chǎn)物；機(jī)制

[收稿日期] 2013-12-20

[基金項(xiàng)目] 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81130070，81072989）； 國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAI29B02，2012BAI28B002）

[通信作者] 郭蘭萍，Tel：（010） 64011944，E-mail： glp01@126. com

[作者簡(jiǎn)介] 黃蕾，E-mail：

歐洲花楸Sorbus aucuparia L.為薔薇科蘋果亞科花楸屬落葉喬木或小喬木，原產(chǎn)歐洲和亞洲西部溫帶高山區(qū)域[1]，其干燥成熟果實(shí)可食用和入藥[2]。我國花楸屬植物50余種，資源豐富，供藥用者約6種[2]。目前研究發(fā)現(xiàn)，蘋果亞科植物受到外界病原菌侵害時(shí)特異性地產(chǎn)生聯(lián)苯類化合物作為植保素[3]，Kokubun T等使用銅離子處理歐洲花楸葉片后，可以從葉片中分離出歐花楸素[4]，這種聯(lián)苯類化合物在健康的植株中并不存在，且其具有廣泛的生物活性。歐洲花楸是集藥用、食用、園林和生態(tài)價(jià)值于一身的珍貴樹種。

歐洲花楸懸浮細(xì)胞（SASC）生長(zhǎng)速度快、周期短，可作為很好的研究材料[5]，已有研究發(fā)現(xiàn)用酵母提取物（YE）作為誘導(dǎo)子處理可使SASC迅速合成聯(lián)苯類化合物[6]。但是，目前這類具有植保素作用的化合物合成機(jī)制尚不明確，還有待進(jìn)一步的研究。

本實(shí)驗(yàn)以SASC為材料，通過檢測(cè)YE處理后SASC次生代謝產(chǎn)物的變化及其細(xì)胞培養(yǎng)液中pH、可溶性蛋白含量、細(xì)胞外Ca2+流等生理生化指標(biāo)的變化，初步探究YE誘導(dǎo)SASC合成次生代謝產(chǎn)物的機(jī)制，尤其是從可溶性蛋白和鈣離子2個(gè)方面為機(jī)制研究提供了很好的思路和方向，為更深層次地研究打下基礎(chǔ)。

1 材料

歐洲花楸懸浮細(xì)胞系由中國科學(xué)院植物研究所葉和春研究員贈(zèng)送。

培養(yǎng)箱（Conviron Adaptis CMP6010）；超大型搖床（ZYSA0351）；電子天平（Sartorius BS 2202S）；超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)）；分析型酸度計(jì)（JENWAY3510）；高效液相儀（Waters 2695_2996）；UV檢測(cè)器（T6新世紀(jì)19-1650-01-1169）；液質(zhì)聯(lián)用儀（Agilent 6320 Ion Trap）；其他常規(guī)設(shè)備。

牛血清蛋白為美國MP公司產(chǎn)品；Yeast extract為OXOID公司產(chǎn)品；其他試劑均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的建立 誘導(dǎo)出的歐洲花楸愈傷組織接種于含50 mL MS固體培養(yǎng)基的400 mL廣口瓶中，愈傷組織每 14 d 繼代1次，經(jīng)過3～5次繼代后，選擇疏松的愈傷組織轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每 250 mL 三角瓶中分裝 50 mL 的液體培養(yǎng)基，置于25 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。懸浮細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)速設(shè)定為 120 r?min-1。實(shí)驗(yàn)中使用的歐洲花楸懸浮細(xì)胞是將減壓過濾后的 1.4 g細(xì)胞接種于含有 20 mL MS液體培養(yǎng)基的100 mL 三角瓶中。

2.2 YE誘導(dǎo)子的配制及處理 用蒸餾水溶解酵母提取物，配制60 g?L-1的母液，高壓滅菌。參照Liu B等處理方法[6]，處理終濃度為3 g?L-1。

2.3 歐洲花楸懸浮細(xì)胞中次生代謝產(chǎn)物的提取和檢測(cè) 將收獲的細(xì)胞用15 mL甲醇在研缽中研碎，使用濾紙和漏斗將濾液過濾到雞心瓶中，過濾后的細(xì)胞殘?jiān)儆?0 mL甲醇提取1次，合并濾液，將雞心瓶置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至干。培養(yǎng)基用15 mL乙酸乙酯萃取2次，用分液漏斗分離，將乙酸乙酯層倒入提取細(xì)胞后的雞心瓶中，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至干。用1 mL的乙酸乙酯定容。

將提取液中的乙酸乙酯溶液揮干，用500 μL的色譜甲醇溶解，過0.22 μm的有機(jī)濾膜后用于HPLC檢測(cè)。

HPLC測(cè)定條件為：液相色譜柱為Waters Symmetry C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水-甲醇（50∶50）流速0.7 mL?min-1；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。

質(zhì)譜條件為：離子源為ESI；正離子模式；霧化氣壓力206.85 kPa；干燥氣為氮?dú)猓稍餁鉁囟?00 ℃，流速10 L?min-1；毛細(xì)管電壓4 000 V；相對(duì)分子質(zhì)量掃描范圍100～600；柱尾分流 2∶1。

2.4 歐洲花楸懸浮細(xì)胞生物量測(cè)定 將培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞真空抽濾至不滴水后，直接稱量細(xì)胞鮮重即為生物量，用鮮重（FW）表示，每個(gè)處理設(shè)置4個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

2.5 細(xì)胞懸浮液pH測(cè)定 采用分析型酸度計(jì)直接測(cè)定培養(yǎng)基中的pH，每個(gè)處理設(shè)置4個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

2.6 細(xì)胞中可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定[7]，以牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，單位為mg?g-1（鮮重），每個(gè)處理設(shè)置4個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

2.7 細(xì)胞外Ca2+流變化的測(cè)定 采用非損傷微測(cè)技術(shù)（NMT）[8]，用多聚賴氨酸玻片固定細(xì)胞，加入測(cè)試液穩(wěn)定15 min，在顯微鏡下找到直徑約200 μm的細(xì)胞簇，測(cè)定時(shí)間為10 min，每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 酵母提取物對(duì)歐洲花楸懸浮細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物的影響 細(xì)胞經(jīng)YE處理后，在其細(xì)胞提取物中檢測(cè)到5種聯(lián)苯類化合物，分別推斷為2′-OH-aucuparin（1），3，5-dihydroxy-biphenyl（2），noraucuparin（3），aucuparin（4），eriobofuran（5）。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，SASC合成的聯(lián)苯類化合物總量呈上升趨勢(shì)，但5種聯(lián)苯類化合物在細(xì)胞中的含量則分別呈現(xiàn)出不同的積累規(guī)律見圖1。

化合物1在YE誘導(dǎo)24 h后方可檢測(cè)到，在48 h時(shí)該化合物的含量達(dá)到峰值，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)含量逐漸減少，但是在156 h時(shí)，其含量又呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。

化合物2在YE誘導(dǎo)24 h時(shí)濃度達(dá)到峰值，在其他檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)上該化合物的含量都較低。

化合物3是YE誘導(dǎo)后最先檢測(cè)到的化合物，其含量表現(xiàn)出周期性波動(dòng)的趨勢(shì)，12～36 h其含量顯著增加，36 h時(shí)出現(xiàn)峰值，36～96 h含量又顯著下降，108～168 h含量再次緩慢增加。

化合物4含量相對(duì)其他化合物較高，在YE誘導(dǎo)24 h之后其含量逐漸增加，132 h含量達(dá)到最大值，132～168 h其含量呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)。

YE處理后檢測(cè)到化合物5的時(shí)間最遲，直到36 h該化合物才積累到一定的濃度。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，該化合物的含量呈波動(dòng)性增加的趨勢(shì)，168 h時(shí)其含量達(dá)到最大值。

由以上結(jié)果可知YE誘導(dǎo)子對(duì)SASC合成聯(lián)苯類化合物的影響是一個(gè)動(dòng)態(tài)的變化過程，隨著處理時(shí)間的變化，SASC合成不同的聯(lián)苯類化合物的組分及其組分間的配比都發(fā)生了改變。

3.2 酵母提取物對(duì)歐洲花楸懸浮細(xì)胞生物量的影響 YE對(duì)SASC生物量的影響見圖2中的實(shí)際值，為了解YE誘導(dǎo)后細(xì)胞生物量與CK組的變化，根據(jù)已得到的SASC生長(zhǎng)曲線的擬合函數(shù)：f（x） =0.369 9/[1+10.77 exp（-0.329 2x）][5]。

將取樣時(shí)間點(diǎn)代入函數(shù)，得到了細(xì)胞在正常生長(zhǎng)條件下生物量的理論值（圖2中的理論值），用得到的理論值減去實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的實(shí)際值，得到了理論值和實(shí)際值之間的差值（圖2中的差值）。

在添加YE誘導(dǎo)子后（如圖實(shí)際值），細(xì)胞生物量呈現(xiàn)出緩慢的先增加又減少的過程，其變化幅度并不是很明顯。在取樣時(shí)間段內(nèi)，細(xì)胞生物量變化不大。

分析理論值、實(shí)際值之間的差值，說明在YE的影響下，SASC增長(zhǎng)曲線偏離了細(xì)胞增長(zhǎng)模型的曲線，YE對(duì)SASC的影響整體表現(xiàn)為抑制作用。隨著YE對(duì)SASC誘導(dǎo)時(shí)間的增加，YE對(duì)SASC的抑制作用也逐漸增大。

3.3 酵母提取物對(duì)歐洲花楸懸浮細(xì)胞細(xì)胞懸浮液中pH的影響 隨著處理時(shí)間的增加，細(xì)胞懸浮液的pH也越來越小。細(xì)胞懸浮液的pH變化大致為2個(gè)階梯式下降，見圖3。48 h至108 h，pH緩慢下降，在108 h時(shí)降至6.445，至此第1階段結(jié)束；在120 h時(shí)細(xì)胞懸浮液pH降至6.045，在120 ～168 h，pH處于另一個(gè)下降階段，但下降的幅度較上個(gè)階段要大。

正常細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)下，細(xì)胞懸浮液中的pH隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高[5]。添加YE后細(xì)胞懸浮液pH呈明顯下降趨勢(shì)，說明可能是SASC產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物導(dǎo)致pH變化，并且這種pH的改變并不利于細(xì)胞的生長(zhǎng)。

3.4 酵母提取物對(duì)歐洲花楸懸浮細(xì)胞中可溶性蛋白質(zhì)的影響 CK組細(xì)胞中的可溶性蛋白質(zhì)含量表現(xiàn)為緩慢下降的變化趨勢(shì)，見圖4。在24，48 h時(shí)含量最高，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)可溶性蛋白質(zhì)的含量開始下降，在120，144，168 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，可溶性蛋白質(zhì)的含量相差無幾。YE組SASC中可溶性蛋白質(zhì)的含量呈現(xiàn)出緩慢下降，再趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。24～96 h細(xì)胞中的可溶性蛋白質(zhì)含量逐漸下降，96 h之后細(xì)胞中的可溶性蛋白質(zhì)含量逐漸趨于穩(wěn)定。

將YE組細(xì)胞可溶性蛋白含量與CK組做差，得到Y(jié)E處理后細(xì)胞中可溶性蛋白含量的增量，然后與CK組對(duì)比得到細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)的相對(duì)增量，見圖5。從圖中可清晰得出，YE處理后細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量與CK組對(duì)比，主要經(jīng)歷2個(gè)階段，第1個(gè)階段其相對(duì)增量大概在50%左右，120 h之后進(jìn)入第2個(gè)階段，細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白相對(duì)增量達(dá)到了140%左右。

3.5 酵母提取物對(duì)歐洲花楸懸浮細(xì)胞外Ca2+流的影響 YE對(duì)細(xì)胞外Ca2+流的影響，YE組與CK組細(xì)胞外Ca2+都表現(xiàn)為內(nèi)流現(xiàn)象，但是YE組Ca2+流平均值顯著小于CK組。從動(dòng)態(tài)流速圖中也可以得出，雖然YE組與CK組都是在測(cè)定初期Ca2+內(nèi)流速度較大，隨著測(cè)定時(shí)間的延長(zhǎng)速度逐漸減小，但YE組速度始終小于CK組。說明YE處理后導(dǎo)致細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流大量減少，見圖6。

4 討論

YE處理后SASC提取物中檢測(cè)到5種聯(lián)苯類化合物，而正常培養(yǎng)條件下細(xì)胞并沒有合成這類化合物，說明細(xì)胞合成這類化合物來應(yīng)對(duì)YE誘導(dǎo)子的脅迫。同時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)液中的pH逐漸降低，細(xì)胞生物量與CK組比增長(zhǎng)明顯緩慢，說明SASC在YE脅迫下合成的次生代謝產(chǎn)物可能改變了培養(yǎng)液中的pH，導(dǎo)致了細(xì)胞的生長(zhǎng)條件惡化、影響細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞不能正常進(jìn)行生長(zhǎng)、分化、增殖等生命活動(dòng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞的生物量下降。

有研究推測(cè)聯(lián)苯類化合物合成過程中有一定的轉(zhuǎn)化順序[9] ，本研究發(fā)現(xiàn)5種聯(lián)苯類化合物含量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)不同的積累規(guī)律，整體表現(xiàn)為：1，2，3號(hào)化合物處理后12 h即可用現(xiàn)有方法檢測(cè)到但相對(duì)含量較低，并且積累量迅速達(dá)到峰值然后下降，推斷這3種化合物可能是聯(lián)苯類化合物生物合成途徑上的上游化合物或中間體；4，5化合物積累時(shí)間相對(duì)較晚，且呈較小波動(dòng)的穩(wěn)定積累狀態(tài)，其可能處于合成途徑的下游，結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定。本研究在一定程度上明確了聯(lián)苯類化合物之間存在的轉(zhuǎn)化，為明確轉(zhuǎn)化順序提供了依據(jù)。

YE組細(xì)胞中可溶性蛋白質(zhì)的含量與CK組對(duì)比具有顯著性差異，在YE誘導(dǎo)下，可溶性蛋白質(zhì)的相對(duì)含量越來越大，最高時(shí)相對(duì)增量達(dá)到了147.76%，說明細(xì)胞為了抵抗真菌帶來的傷害，對(duì)防治機(jī)制的投入也越來越多，多合成的可溶性蛋白質(zhì)可能是初生生長(zhǎng)所不需要的，用來調(diào)節(jié)催化次生代謝產(chǎn)物的合成。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)YE處理后SASC細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流與CK組對(duì)比顯著減少，說明在細(xì)胞受到Y(jié)E誘導(dǎo)子脅迫后，Ca2+作為信號(hào)分子可能介導(dǎo)細(xì)胞合成次生代謝產(chǎn)物的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

本實(shí)驗(yàn)通過分析生物量、細(xì)胞培養(yǎng)液中的pH以及細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白含量的變化，發(fā)現(xiàn)YE誘導(dǎo)SASC合成次生代謝產(chǎn)物的機(jī)制與道地藥材形成的逆境效應(yīng)的假說[10]基本一致。在不受外界環(huán)境脅迫的情況下，植物首先滿足的是生長(zhǎng)和繁殖；在面對(duì)不同因素的脅迫時(shí)，植物會(huì)合成次生代謝產(chǎn)物抵御外界不利環(huán)境，為此需要付出相應(yīng)的成本，因而會(huì)降低植物的初生生長(zhǎng)速度。此外，細(xì)胞應(yīng)對(duì)YE脅迫迅速啟動(dòng)了Ca2+信號(hào)分子，說明Ca2+可能介導(dǎo)SASC合成次生代謝產(chǎn)物的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。這些為YE誘導(dǎo)SASC合成次生代謝產(chǎn)物的機(jī)制研究拓展了思路，為下一步深層次的研究打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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Mechanism exploration on synthesis of secondary metabolites in

Sorbus aucuparia cell cultures treated with yeast extract

HUANG Lei， XIAO Wen-juan， YANG Guang， MO Ge， LIN Shu-fang， WU Zhi-gang， GUO Lan-ping

（State Key Laboratory of Dao-di Herbs， National Resource Center of Chinese Materia Medica，

China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract] Suspension cultures cell of Sorbus aucuparia （SASC） was used as materials， the changes of physiological and biochemical indexes of SASC after treatment with yeast extract （YE） were detected， and the synthetic mechanism of secondary metabolites in SASC treated with YE was preliminarily explored. The results were as follows： under the assay conditions， SASC was induced to synthesize five biphenyl compounds， and these compounds content changed differently with induction time prolonging； YE treatment inhibited cell growth， the culture medium pH was gradually reduced after treatment； water-soluble protein content showed a trend of slow decline， which was significantly increased in YE treatment group （YE group） compared with the control group （CK group）， the maximum relative content was 147.76% in contrast with CK group； both YE group and CK group were extracellular Ca2+ flow influx， but the YE group flow was significantly slow than CK group. The results indicate that YE induced the cells in a stress state， which was not conducive to the growth of cells and forced the cells to synthesize biphenyl compounds against external stress； water-soluble protein may serve as intracellular enzymes involved in the synthesis of compounds regulation； Ca2+ may as signal molecule mediate cell signal transduction respond to YE stress.