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本文作者：張路遙 牛婉婷 楊昊 潘敏 單位：浙江大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程

量子點(quantumdots,QDs)是一種熒光半導(dǎo)體納米晶體,直徑1~100nm。量子點主要由Ⅱ~Ⅵ族元素(如CdSe、CdTe、CdS、ZnSe等)或Ⅲ~Ⅳ族元素(如InP、InAs等)組成,目前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究常用的水溶性量子點主要是CdX(X=S、Se、Te)[1]。由于量子限域效應(yīng)量子點具有獨特的光學(xué)特性:耐光漂白、激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄且隨粒徑大小的改變而改變。所以,不同粒徑的量子點可以在同一激發(fā)光的激發(fā)下發(fā)射不同顏色的熒光,有望解決傳統(tǒng)染料在復(fù)色檢測中存在的光譜覆蓋、不能同時激發(fā)等問題。1996年,Alivisatos[2]解決了量子點作為生物探針與生物分子之間的相容性問題,實現(xiàn)了量子點在生物領(lǐng)域的應(yīng)用。1998年,Chan等[3]實驗證明量子點作為熒光標記物有傳統(tǒng)熒光染料20倍的亮度、100倍的抗光漂白能力、1/3的發(fā)射半峰寬,從此,量子點成了最有前途的熒光標記物之一。經(jīng)過修飾的水溶性量子點,表面可與多種生物分子結(jié)合,從而獲得功能基團;基于量子點的探針和檢測系統(tǒng)可廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)檢測系統(tǒng)中;量子點的表面敏感特性在檢驗中也得到了應(yīng)用[4,5];在熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)技術(shù)中量子點作為供體也顯示了傳統(tǒng)熒光染料所沒有的優(yōu)點;量子點在各種新技術(shù)中的應(yīng)用更顯示了其巨大的潛力。本文將全面綜述經(jīng)過修飾的量子點在各方面的應(yīng)用現(xiàn)狀。

1量子點探針的應(yīng)用

經(jīng)過修飾的水溶性量子點具有免疫活性[3]和高度的特異性[6],可以作為熒光探針應(yīng)用于熒光免疫分析。偶聯(lián)了抗體的量子點探針可用于檢測抗原或細菌、腫瘤等有表面抗原的病原體、細胞、組織,并且具有很高的靈敏度。另外,量子點對表面變化非常敏感,基于量子點的這一特性發(fā)展起來的熒光猝滅探針、酶活性探針也具有很好的實用價值。

1.1量子點熒光免疫探針用于抗原檢測

Azzazy等[7]用親和素量子點探針對生物素化的前列腺特異性抗原(prostatespecificantigen,PSA)進行了檢測,檢測限低達0.38pg/ml。Ker-man等[8]改進了探針制備技術(shù),將量子點與單克隆抗體通過親和素-生物素偶聯(lián)制成探針,從而可以利用雙抗夾心免疫法直接對人血清標本中的PSA進行檢測,其檢測限可達0.25ng/ml,線性范圍為0•25~100ng/ml。

1.2量子點熒光免疫探針用于細菌檢測

Hahn等[9]報道了一種用量子點免疫探針檢測大腸桿菌O157∶H7的檢測技術(shù)。他們用鏈霉親和素修飾的CdSe/ZnS核殼式量子點和生物素化的抗體偶聯(lián),這種探針可以特異性地識別大腸桿菌O157∶H7,檢測限達2•08×107cfu/ml,比傳統(tǒng)異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)靈敏度更高、穩(wěn)定性更好。Yang等[10]利用不同顏色的量子點同時檢測了兩種病原菌:大腸桿菌O157∶H7和傷寒沙門氏菌S.Typhimurium。發(fā)射波長分別為525nm和705nm的兩種量子點分別偶聯(lián)大腸桿菌O157∶H7和傷寒沙門氏菌S.Typhimurium的抗體。該方法能特異性識別并定量檢測混合體中相應(yīng)的細菌,檢測限為1×104cfu/ml。

1.3量子點熒光免疫探針用于腫瘤檢測

Hu等[11]用PEG修飾的CdSe量子點實現(xiàn)了細胞表面腫瘤標記物-癌胚抗原(carcinoembryonican-tigen,CEA)的檢測。PEG量子點通過靜電吸附偶聯(lián)CEA抗體rch24。這種探針能比傳統(tǒng)的FITC標記更有效地檢測LS180細胞系表面表達的CEA。Yu等[12]用CdSe/ZnS量子點偶聯(lián)鼠抗人甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)抗體來識別肝癌標記物AFP,量子點-AFP抗體探針通過尾靜脈注射到小鼠內(nèi)。點對點激光照射獲取腫瘤部位和正常組織的熒光信號:熒光主要分布在肝癌組織上,周圍組織的熒光強度迅速下降,基本無非特異性分布。

1.4量子點熒光探針猝滅的應(yīng)用

量子點表面修飾有生物活性的酶之后,基于量子點對表面敏感的特性,可以用于檢測酶底物的濃度。Ji等[13]報道了一種新穎的基于CdSe/ZnS量子點-有機磷水解酶(organophosphorushydrolase,OPH)探針的生物傳感器。其熒光猝滅程度和有機磷的濃度成線性相關(guān),檢測限可達10-8mol/L。增大OPH和量子點的比例能夠增加傳感器的靈敏度,但是當量子點表面結(jié)合的OPH已經(jīng)飽和后,探針靈敏度不再增加。該方法為有機磷的檢測提供了新途徑,極具實用價值。

2量子點FRET在檢測中的應(yīng)用

FRET是一項應(yīng)用能量轉(zhuǎn)移來測量分子級別的距離的技術(shù)。當供體發(fā)射的熒光與受體的吸收光譜重疊,并且供受體之間的距離很近(<10nm)時,供體受激發(fā)產(chǎn)生的偶極子震蕩就會引起受體偶極子的共振,發(fā)生這種非放射性的能量轉(zhuǎn)移[14]。FRET對供受體間的距離非常敏感[15],可以用來檢測蛋白質(zhì)、核酸的分子結(jié)構(gòu)和距離的微小變化。量子點作為FRET供體相對于有機熒光染料在靈敏度方面有很大的優(yōu)勢:量子點的激發(fā)光譜寬,可以選擇產(chǎn)生背景熒光少的激發(fā)波長段來進行檢測,量子點-有機染料-FRET探針可產(chǎn)生相對背景熒光更顯著的熒光信號,從而能夠檢測到較低濃度的目標,并且多余的探針并不影響檢測效果,操作起來更為方便。

2.1量子點FRET在DNA檢測中的應(yīng)用

基于量子點檢測DNA的方法很多,大部分量子點DNA探針是用量子點作為供體、有機染料作為受體的。Zhang等[16]介紹了一種超靈敏的、基于量子點熒光共振轉(zhuǎn)移的DNA檢測方法。該方法可以用于檢測未分離的低濃度DNA。量子點修飾一段DNA單鏈,有機染料Cy5標記另一段DNA單鏈,Cy5作為受體,量子點作為供體,二者與目標DNA結(jié)合,從而發(fā)生FRET。與同樣用FRET技術(shù)的分子信標法相比,量子點作為供體背景熒光更少,靈敏度更高(4•8fmol/L),目前已成功檢測基因點突變。

2.2量子點FRET在蛋白濃度和酶活性檢測中的應(yīng)用

Ma等[17]發(fā)現(xiàn)FRET可以用于檢測溶液中鼠源IgG的含量。紅綠兩種不同顏色的量子點先后加入到IgG溶液中與IgG通過靜電結(jié)合后可以觀測到FRET現(xiàn)象的發(fā)生。FRET增強的程度和IgG濃度成線性相關(guān),線性范圍在0•1~20•0mg/L。在此FRET體系中加入木瓜蛋白酶后,IgG酶解,兩種量子點之間的距離增大,FRET也隨之消失。從另一個角度考慮,FRET也可以用于酶的活性檢測?；谶@一原理,Xu等[18]將Cy5-底物-量子點FRET探針用于β-內(nèi)酰胺酶的活性的檢驗,檢測限32μg/ml。這種酶是細菌產(chǎn)生的,其活性與細菌的抗藥性相關(guān),在檢驗β-內(nèi)酰胺類抗生素藥效方面具有很重要的臨床意義。

3量子點在新技術(shù)中的應(yīng)用

#p#分頁標題#e# 3.1量子點化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移在微芯片毛細管電泳中的應(yīng)用

微芯片毛細管電泳(microchipcapillaryelectro-phoresis,MCE)是基于微機電加工技術(shù)在芯片上的微管道中完成電泳檢測過程的新型技術(shù),常用紫外吸光度分析法對樣品進行檢測。Zhao等[19]用魯米諾-NaBrO-量子點化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(chemilu-minescenceresonanceenergytransfer,CRET)系統(tǒng)改進了微芯片電泳的檢測技術(shù)。某些生物組分能有效抑制魯米諾供體、CdTe量子點受體之間的CRET,Zhao等利用CRET的這種猝滅機制檢測了人紅細胞中的生物胺、硫醇類、氨基酸類、有機酸、膽固醇等5類生物分子,檢測限10-8~10-9mol/L。采用CRET技術(shù)的MCE不需要激光光源,而且比采用其他檢測技術(shù)(電泳圖譜、化學(xué)發(fā)光等)的MCE靈敏度高10~1000倍,是一種很有發(fā)展前景的檢測技術(shù)。

3.2量子點為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)芯片技術(shù)

蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是一種新型蛋白質(zhì)分析技術(shù),僅需微量樣品,就可以同時檢測、識別不同的生物分子,具有集成、并行、快速和自動化分析等優(yōu)勢?？梢灾苯訙y量血漿、細胞裂解液等樣品。Zajac等[20]將單克隆抗體固定在硝化纖維包被的玻璃板上,制成了蛋白芯片。用量子點QD655結(jié)合二抗作為探針,實現(xiàn)了對血清或者血漿中腫瘤壞死因子、白介素-8、白介素-6、趨化因子巨噬細胞炎性蛋白-1β、白介素-13以白介素-1β6種腫瘤標志物的微量測定,白介素-8和腫瘤壞死因子的檢測下限可達到10~100pg/ml,其他四種腫瘤標志物的檢測下限也達到了ng/ml的量級。將待測樣品固定在硝化纖維涂層上的芯片技術(shù)稱為反相蛋白芯片,由于待測樣品是固定的,與普通蛋白芯片相比,這種芯片技術(shù)需要的樣品量更少。Shingyoji等[21]用量子點探針改進了反相蛋白芯片的檢測技術(shù),該技術(shù)在少量粗制細胞裂解液中能夠精確測量目標蛋白DNA-PKcs的濃度,靈敏度可以和傳統(tǒng)的酶比色法媲美。Geho等[22]用量子點標記、高光譜成像技術(shù)作為反相蛋白芯片的檢測技術(shù),實現(xiàn)了JurkatT細胞淋巴瘤的識別。該方法無需放大和預(yù)處理可直接檢測信號蛋白的濃度,并且動態(tài)范圍大于傳統(tǒng)比色法。最近,Hu等[23]實現(xiàn)了在反相蛋白芯片中通過復(fù)色量子點同時檢測多種腫瘤標記物的技術(shù),該技術(shù)具有足夠高的靈敏度,可以直接檢測血清中的腫瘤標記物。量子點這種在復(fù)色高通蛋白芯片中的應(yīng)用,將成為腫瘤診斷的重要手段,是一個令人矚目的研究方向。

3.3量子點與磁富集結(jié)合

量子點探針與磁富集結(jié)合可以大大提高量子點檢測技術(shù)的靈敏度。免疫磁珠能夠在濃度低的樣品中快速捕捉富集目標生物分子和病原體,量子點作為熒光標記物可以解決傳統(tǒng)磁性微球自發(fā)熒光干擾目標信號的問題。Agrawal等[24]用這種方法檢測了培養(yǎng)液中的腫瘤壞死因子。該方法檢測限達10-15mol/L,其靈敏度是傳統(tǒng)免疫富集分析的1000倍、有機熒光免疫分析的100倍。Wang等[25]通過類似方法檢測了培養(yǎng)液中的單增李斯特菌,檢測限低達2~3cfu/ml,遠高于前面提到的只用量子點探針[9,10]的檢測技術(shù)。

4小結(jié)與展望

量子點作為生物醫(yī)學(xué)檢測與診斷中的新技術(shù),具有廣闊的發(fā)展前景。隨著量子點標記、檢測技術(shù)的不斷發(fā)展和完善,必將成為新一代熒光標記物,用于疾病診斷、病原檢測、藥物篩選、腫瘤檢測等多個方面。但是要真正實現(xiàn)量子點在各方面的應(yīng)用,需要解決的問題還有很多:

(1)量子點比傳統(tǒng)熒光染料要大,產(chǎn)生的空間位阻比較明顯,有時候要考慮用長鏈分子偶聯(lián)消除空間位阻[26]。

(2)某些被測目標的表面結(jié)構(gòu)可能會阻止量子點的偶聯(lián),這時候要考慮對被測目標進行預(yù)處理,如炭疽桿菌孢子的檢測[27]。

(3)水溶性量子點與功能基團(如抗體、生物素等)的偶聯(lián)數(shù)量關(guān)系也是一個值得研究的問題。

(4)量子點存在閃爍現(xiàn)象,單一量子點的穩(wěn)定性還有待提高。

總而言之,量子點是一種很有潛力的熒光標記物,特別是基于多色量子點并行檢測多組分的微芯片技術(shù),集多種技術(shù)的優(yōu)點于一身,具有非常廣闊的發(fā)展前景和應(yīng)用價值。