前言：尋找寫作靈感？中文期刊網用心挑選的PPEs的遺傳多樣性，希望能為您的閱讀和創作帶來靈感，歡迎大家閱讀并分享。

光合自養型真核超微藻(PhotosyntheticPicoeukaryotes，ppes)為粒徑小于2μm的自養型真核原生生物［1］，其廣泛分布于海洋和淡水生態系統中，作為重要的初級生產者，在水生生態系統的物質循環和能量流動中起著十分重要的作用．尤其在熱帶、亞熱帶貧營養海域是重要的初級生產者，對其所在海域的生物量貢獻巨大［2］．   1994年Li首次揭示了光合自養型真核超微藻由于具有較大的比表面積和高的碳吸收效率，是海洋初級生產力的重要貢獻者［3］．國際上關于真核超微藻遺傳多樣性的調查和研究多集中于海洋，近幾年才有少量關于湖泊的研究報道［4-5］．國內關于真核超微藻遺傳多樣性的研究才剛剛起步［6］，袁潔等［7］構建了我國南沙海域真核超微藻基因克隆庫，發現了大量新型基因序列;王建等［8］對武漢東湖超微藻生態學進行初步研究;陳美軍等［9-11］對太湖不同湖區真核微型浮游生物基因多樣性進行研究，其中涉及部分微型藻類．   調查真核超微藻多樣性，一般將水樣經過一定孔徑的濾膜抽濾，然后用真核生物18SrRNA基因的通用引物擴增和克隆濾膜上的DNA，最后進行測序和序列比對、生物進化分析［12］．該方法得到的海洋和湖泊樣品的克隆庫中，三分之二以上的基因序列屬于異養真核微生物，但熒光原位雜交方法卻發現，在適宜藻類生長的水環境中，通常自養型真核超微藻相對異養真核微生物在數量上占絕對優勢［13］．為了更好地揭示光合自養型超微藻的遺傳多樣性，Fuller等設計了針對真核藻類葉綠體16SrRNA的引物來構建基因克隆庫［14］．該引物能夠特異性地擴增自養真核藻類，較好地克服傳統方法對異樣真核微藻較高的擴增率．   本研究采用真核藻類葉綠體16SrRNA的引物來構建基因克隆庫，以揭示太湖自養真核超微藻的遺傳多樣性，從而幫助我們更全面地了解湖泊浮游藻類的群落結構及生態功能，同時為湖泊超微藻的研究和開發利用提供一定的依據．   1材料與方法   1．1藻樣采集   梅梁灣位于太湖北部，是目前太湖富營養化程度最高的區域之一，而東太湖的富營養水平在太湖幾個湖區中最低［9］．2010年3月采集太湖梅梁灣(T1點)、東太湖(T2點)水樣各500ml(圖1)．用20μm的濾膜粗濾后分別用2μm、0．2μm的濾膜逐級抽濾，得到粒徑范圍為0．2～2μm的超微浮游藻類［13］．用10ml離心管收集0．2μm濾膜，加3ml細胞溶解液，－20℃保存．   1．2藻樣總DNA提取   將加有細胞溶解液的離心管從－20℃取出，室溫溶解．加入350μl10%的SDS，33．5μl10mg/ml蛋白酶K，混勻，37℃水浴50min后55℃水浴20min，期間每隔10min搖勻，使反應充分．加入等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提，10000轉/min、4℃下離心5min．取上清至新離心管中，同樣的方法再次抽提．將上清轉移至新離心管中，加入等體積異丙醇和0．4倍體積的7．5mol/L的醋酸銨，室溫靜置10min后，10000轉/min、4℃下離心30min．棄溶液，加入1ml的70%乙醇洗滌，10000轉/min、4℃下離心15min，棄乙醇．干燥30min，使酒精充分揮發后，每管加入30μl的TE懸浮沉淀，－20℃保存．   1．3PCR反應與產物的純化   以上提取的藻樣總DNA用于目的片段擴增．50μlPCR反應液中含有25mmol/LMgCl2，2．5mmol/LdNTP，10×buffer，5U/μlTaqDNA聚合酶(TaKaRa公司)．采用真核藻類16SrRNA基因的引物對PLA491F:5'GAGGAATAAGCATCGGCTAA3'，OXY1313R:5'CTTCACGTAGGCGAGTTGCAGC3'［14］進行擴增．擴增反應程序:95℃，5min;95℃，1min;55℃，1min;72℃，1min，循環30次，最后72℃，6min．擴增完成后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切取PCR產物目的片段(約822bp)，用Promega公司的PCR純化試劑盒(Wiz-ard?SVGelandPCRClean-UpSystem)進行純化．   1．4克隆子篩選   PCR產物經純化回收后與載體pGEM-TEasy連接，并轉化感受態大腸桿菌，涂布于含有Amp、IPTG及X-gal的LB培養平板上，置于37℃培養箱中倒置過夜．在平板上挑取白斑單菌落轉移至含有Amp的液體LB培養基中37℃，150轉/min振蕩培養6～8h．取1μl菌液，用pGEM-TEasy載體的通用引物T7、SP6擴增，電泳檢測，對擴增出目的片段的菌液進行測序．   1．5序列分析   將測序獲得的序列剪切掉載體和引物區，采用Bellerophon在線軟件分析，隨后利用核苷酸序列進行分子遺傳多樣性和分子系統學分析．我們將核苷酸序列相似度為98%的克隆定為屬于同一OTU，代表相同的屬或種［15］，否則將被認為是不同的藻．本研究共得到14個真核超微藻序列，Cluster軟件分析后發現有10個OTU．采用MAFFT5．8軟件(align．bmr．kyushu-u．ac．jp/mafft/online/server/)對本研究得到的10個OTU和34個參考序列進行比對，Gblocks軟件剪切掉變異較大的區域，Modeltest軟件計算得到針對該44個序列構建進化樹的最佳參數，最后用PAUP4．0構建NeighbourJoining生物進化樹，重復1000次得到Bootstrap值，用MEGA4．1軟件對進化樹進行編輯．   2結果與分析   2．1DNA的擴增與陽性克隆子篩選結果顯示在822bp左右有特異性的擴增片段條帶，與預期片段相符(圖2)．目的片段純化后直接與載體pGEM-TEasy連接轉化獲得數百個克隆，最后每個樣品挑出46個陽性克隆進行測序．   2．216SrRNA部分序列分析將得到的序列在NCBI上進行比較分析，發現自養型真核超微藻優勢種群為隱藻(Cryptophyta)，占71．4%，其次是硅藻(Bacillariophyta)占14．3%，最后為金藻(Chrysophyta)和定鞭藻(Haptophyta)，分別占7．1%(表1)．構建NeighbourJoining生物進化樹(圖3)．與國內外研究結果比較，確定了部分藻的具體分類，但大部分為未培養的藻類，無法進行精確定位．分析發現本研究中得到的金藻序列EF052122、定鞭藻序列EF051968及隱藻序列如EF052243、EF052214等均與意大利Naples近海灣藻類親緣性較近［16］，除金藻相似度為96%，其他藻類的相似度均達到98%～99%．可見湖泊與海洋的藻類組成具有一定的相似性，且隱藻等廣泛分布于海洋及淡水湖泊中．硅藻序列EU580495與德國Constance湖及美國Horsetooth水庫的硅藻相似度較高［17-18］，說明硅藻在全球分布廣泛，且本研究發現的硅藻也多存在于湖泊中．分析發現目前國際上關于超微藻的研究也較少且相對集中，超微藻的已知種類較少．此外在本研究的克隆文庫中還發現了一些序列。#p#分頁標題#e#   3討論   3．1方法選擇   本研究采用了真核藻類16SrRNA基因的引物對PLA491F、OXY1313R［14］，近年來該引物在海洋真核超微藻研究中得到了廣泛應用，彌補了18SrRNA通用引物構建的基因克隆庫中大部分屬于異養真核微生物而非自養真核藻類的不足，較好地反映了海洋真核超微藻的遺傳多樣性［19-20］．由于太湖富營養化程度高，細菌含量高，實驗中也擴增出部分光合細菌，但目前國際分子生物學數據庫中已有大量序列可進行比較，因此可有效排除光合細菌．PCR產物克隆法構建文庫是研究超微型真核生物分子多樣性的傳統方法［21-22］．Zuendorf等對丹麥Mari-ager海峽樣品進行克隆文庫的構建，對隨機選取的400個克隆進行測序，最后獲得70個屬于不同種類超微型真核生物的OTUs［23］．這些研究均獲得了豐富的超微型真核生物多樣性，表明克隆文庫構建方法適用于本研究，為我們客觀認識環境中真核生物多樣性提供途徑．但構建克隆文庫直接測序耗時且花費較大．DGGE是檢測微生物多樣性的一種快速可靠的方法，其帶譜中條帶的數量和亮度可相應地反映環境樣品中微生物物種的數量和優勢種群［24］．此方法的優點是可以同時對大量不同的環境樣品比較分析，缺點是不知道樣品中具體的生物組成［25］．而構建克隆文庫，通過測序及網上比對，能夠知道樣品中主要的物種組成與相對豐度．結合兩種方法，能夠揚長避短，即可對不同時空的樣品進行分析，也可了解樣品的主要物種組成［26］．所以我們將結合這兩種方法進一步研究太湖自養真核超微藻的遺傳多樣性．本研究目前只對太湖2010年3月份T1、T2點的樣品進行初次分析，但可以推測湖泊中自養真核超微藻具有復雜的遺傳多樣性．我們將對太湖這些位點的水樣進行進一步調查，系統地研究太湖自養真核超微藻的遺傳多樣性．   3．2太湖不同湖區自養真核超微藻的分布   T1點位于太湖污染最為嚴重的梅梁灣，T2點位于水質相對最好的東太湖，本文以這兩個富營養化程度相差較大的湖區作為代表來反映太湖不同湖區自養真核超微藻的分布情況．結果表明T1、T2點均有隱藻和硅藻，可見春季隱藻與硅藻分布較為廣泛，可能在太湖的其他湖區也存在．其中優勢種群為隱藻，說明隱藻適應性強，生長旺盛．金藻多生活在透明度高，有機質含量低的水體中［27］，東太湖金藻的發現，驗證了東太湖水質相對較好，能夠為金藻的生長提供適宜的環境．已發現的定鞭藻主要存在于海洋中，在淡水生態系統中很少［28］．太湖梅梁灣發現定鞭藻，說明定鞭藻的生境可能比以往認識得更為廣泛，還可存在于富營養化的湖泊中．本研究得到的序列經比對后發現很多未培養、系統分類未定的藻類，說明我們對于真核超微藻的研究還很有限，需要進一步加深對其的認識．