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蛋白質的體外消化模型

蛋白質是食品的重要成分之一，涉及到的蛋白質消化酶及消化條件有比較好的研究基礎，且相對明確，因此，針對蛋白質的體外消化模型研究的最早，相關的研究和應用報道也較多。

1.蛋白質體外消化模型建立的主要依據(jù)

消化蛋白質的酶主要是蛋白酶，食物經(jīng)過口腔的咀嚼，經(jīng)由咽、食管、進入胃、小腸中，在蛋白酶比較豐富的胃腸開始消化過程。體外實驗中酶的濃度、反應溫度、pH、時間及抑制劑、激活劑都是影響蛋白質消化的重要因素，且消化不同食物來源的蛋白質的酶種類不同，它們刺激腸胃產生的酶量不同、所需消化時間也不同。在模擬消化的過程中，一般模擬的部位主要是胃和小腸，在胃中水解蛋白質的胃液主要由胃蛋白酶和胃酸組成。小腸中的蛋白質消化相對復雜，由胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶和肽酶、羧肽酶 A、B 等組成，可將經(jīng)胃消化所得的肽或蛋白質進一步水解為氨基酸和小肽。蛋白質體外消化模型一般以蛋白質的消化率為測定參數(shù)，消化率是動物從食物中所消化吸收的蛋白質占總攝入量的百分比，是評價食物營養(yǎng)價值的重要指標。Abdel-Aal[6]研究表明，蛋白酶的種類及酶作用順序和過程會對蛋白質的消化率產生影響。他們用三種酶（胰蛋白酶、糜蛋白酶、肽酶）同時消化蛋白質，對比兩種酶（胃蛋白酶和胰液素）分兩步消化蛋白質，就蛋白質的消化率而言，發(fā)現(xiàn)前者比后者高 39-66%。席鵬彬等[7]在研究菜粕的體外消化中也發(fā)現(xiàn)，如果用胰酶制劑代替胃蛋白酶-胰蛋白酶兩步酶解過程中的胰蛋白酶可使菜粕干物質和粗蛋白質的消化率分別提高 5.2%和 11%。所以，復合酶體系更符合體內的消化狀況[1]。另外，攝食的蛋白量增大會引起胰液素蛋白酶的分泌增多，同樣地，淀粉和脂質的攝入量增加會分別引起唾液淀粉酶和酯酶分泌增多，即食物組成和攝入量的不同會引起相應的酶分泌增加或減少，建立體外消化模型時也需考慮這方面的因素。單酶法可用來預測單個物質的可消化性，例如，淀粉的消化主要用淀粉酶，脂質的消化主要用脂肪酶、蛋白質消化用蛋白酶[1]。單酶消化法要比運用復合酶消化更有利于消化模型的標準化，但實際上，食用物質中各種營養(yǎng)物質相互作用，彼此間相互影響，所以就實用性而言，復合酶體系占優(yōu)勢[2]。

2.體外消化模型在食物蛋白質研究中的應用

近十年來被用于蛋白質營養(yǎng)代謝、生理活性、過敏原檢測等方面研究的體外消化模型中，主要以谷物類蛋白，奶制品中的蛋白質，以及水產品和一些果蔬中的蛋白質為研究對象。谷物類作為人們食物的主要來源，其蛋白質是主要研究對象，如對小麥蛋白[6]、大豆蛋白[8]、菜粕粗蛋白[9]等都有研究。在這些體外消化模型中，所采用的消化酶主要是胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰液素，牛奶作為膳食中蛋白質的主要來源之一也是蛋白質體外消化模型的主要研究對象，如對牛奶蛋白[10]、山羊奶蛋白[11]、牛乳清蛋白[12]、瑞士干酪[13]、β-乳球蛋白[14]的研究。上述體外消化模型因研究對象和目的不同，采用的消化酶組成和 pH 也不盡相同。例如在研究牛乳清蛋白時，研究者首先模擬胃部消化環(huán)境，在體外采用豬胃蛋白酶、牛科動物的凝乳蛋白酶、胃蛋白酶以及不同 pH 的小鼠胃液對牛乳清蛋白進行消化，結果表明在不同消化酶的作用下 α-乳白蛋白和牛血清白蛋白被水解了而 β-乳球蛋白在不同的消化酶和不同 pH 作用下都沒能水解，可見加熱變性的乳清蛋白包括 β-乳球蛋白都被胃蛋白酶徹底水解了。在進行體內試驗時出現(xiàn)了與體外試驗相同的結果，天然的 β-乳球蛋白在小鼠體內未能消化但是加熱變性的 β-乳球蛋白卻在小鼠胃內消化了，與胃部體外模擬實驗結果一致。接著，研究者在體外模型和小鼠體內分別研究蛋白質在腸中的消化，在體外用胰液素去消化天然的和變性的 β-乳球蛋白，二者都被消化了，同時將在胃中不消化的天然的 β-乳球蛋白注射到小鼠胃內，這些天然的β-乳球蛋白進入小腸后也被消化了，這與體外結果也是一致的。這個實驗表明體外建立模型模擬蛋白質的消化可以較好的反應體內真實的消化狀況，將其作為蛋白質消化研究的方法和工具是可行的。

3.體外消化模型在活性寡肽研究中的應用

隨著生物活性寡肽研究的深入，關于活性肽的消化研究也逐步展開。攝入蛋白質不僅是人體需要的營養(yǎng)物質氨基酸的重要來源，還扮演著生物活性肽的重要角色，體外模型對活性肽消化和活性的評價已有應用的先例。目前報道較多的是消化模型應用于 ACE 酶抑制活性肽的研究。有研究者在體外用 pH 在 2～3 之間的胃蛋白酶液和 pH 在 7～8 之間的胰液素消化瑞士干酪[15]，結果發(fā)現(xiàn)經(jīng)消化后的蛋白產物的 ACE酶抑制活性發(fā)生了變化。高分子量的蛋白質消化后會產生一些新的活性肽，加強對 ACE 酶的抑制，而原本具有一定 ACE 酶抑制作用的 10ku 的肽卻被消化了，這又降低了產物的 ACE 酶抑制活性，研究結果表明消化帶來的蛋白和肽的結構變化，將與其體外活性測定的結果有所差別，高活性的物質也許經(jīng)過消化后，其活性中心被影響，導致活性降低，而低活性的物質，經(jīng)過消化后也許活性片段將暴露，活性反而更高。因此，傳統(tǒng)的簡單的體外活性篩選不能完全反應它們在體內經(jīng)消化后的活性狀況，結合消化模型對活性進行綜合評價是十分必要的。同類研究還有用胃蛋白酶-胰液素聯(lián)合消化大豆蛋白[10]或鰹魚[16]蛋白，研究其產物的 ACE 酶抑制活性。體外消化模型也有用于抗氧化肽研究的報道，我國學者王興等[17]人通過體外模擬部分胃、腸道消化過程，考察苦蕎蛋白經(jīng)胃、腸道消化后生成肽的組成及其抗氧化活性，揭示了苦蕎蛋白質體內消化與抗氧化活性的關系。研究結果顯示苦蕎蛋白質經(jīng)模擬消化 10h 后產生最高抗氧化活性多肽，凝膠分離出 5 個組分，其中分子質量為 900u 的肽具有最強的抗氧化活性。生物活性肽在人體內發(fā)揮著重要作用，活性肽進入人體后的消化產物是多樣的，只有能在體內環(huán)境下保留某些特征結構或者釋放特征結構的肽分子才會在人體內發(fā)揮重要功能。因而，采用體外消化模型進行活性肽的篩選和評價，不僅可以縮短研究時間，減少研究費用，同時也是更為準確和合理評價其活性所必需的，對于生物活性肽食品、藥品的開發(fā)有重要意義。

4.體外消化模型在過敏原研究中的應用

蛋白質體外消化模型還被應用于過敏原等對人體有重大潛在危害的蛋白或肽類物質的檢測中。如對獼猴桃過敏原[18]、鯉魚過敏原[16]的研究。一些研究者通過模擬腸胃液消化試驗，分析鋸緣青蟹肌肉中過敏原（原肌球蛋白）的消化特性以及消化對過敏蛋白致敏性的影響，結果表明蟹類過敏蛋白相對于非過敏蛋白具有較高的消化穩(wěn)定性，而且其高分子質量降解產物仍可能引起過敏反應[19]。試驗采用模擬胃、腸液環(huán)境，以 SDS-PAGE 和Westernblot 進行分析，對青蟹原肌球蛋白和肌原纖維蛋白在體外模擬腸胃環(huán)境中的消化穩(wěn)定性進行了測定。在模擬胃液反應中，非過敏原蛋白尤其是肌球蛋白重鏈和肌動蛋白可被胃蛋白酶快速降解，而過敏原蛋白原肌球蛋白在 60min 時仍未被完全分解。在模擬腸液反應中，相對于致敏蛋白，肌球蛋白重鏈、肌動蛋白等非過敏蛋白在較短的時間內被分解，原肌球蛋白盡管 120min 后幾乎被完全分解，但會產生一些較穩(wěn)定的蛋白降解片段，而且其中一些分子質量為 34ku 的原肌球蛋白降解產物仍具有過敏原性。體外模型的應用為過敏原的研究提供了簡便實用的工具。除上述研究外，還有大量的應用體外消化模型對動植物蛋白進行研究的報道，如對海藻蛋白[20]、肌原纖維蛋白[21]、肉類蛋白[22]、抗高血壓三肽[23]以及其它動物副產品蛋白的研究。由此可見，作為應用較早的體外消化模型，蛋白質體外消化模型已經(jīng)開始在蛋白質的各類研究中發(fā)揮重要作用。#p#分頁標題#e#

糖類的體外消化模型

糖類是人體最主要的供能物質，食物中糖類的消化主要受到淀粉酶的作用，在淀粉酶的水解作用下，淀粉轉化為寡糖和單糖。從上世紀九十年代起就有關于在體外分析食物中碳水化合物可消化性的報道，但其中又有較大的不同，主要表現(xiàn)為消化模型采用的食物粉碎方式、在胃中的消化時間、淀粉水解酶種類等方面。研究表明食物的粉碎方式對淀粉的消化具有明顯的影響[24]，另外，淀粉消化物粘度[22]也會影響消化率，但是在體外實驗條件下很難準確地模擬人體的生理狀態(tài)，所以目前一般不考慮粘度對淀粉消化速率的影響[24]。與蛋白質的體外消化模型一樣，在建立糖類體外消化模型時主要考慮酶、食物成分、顆粒大小和 pH 的影響。與蛋白質體外消化模型不同的是，由于口腔中唾液淀粉酶的重要作用，糖類消化模型不能忽略口腔的消化作用。同時還發(fā)現(xiàn)，可能是由于口腔中唾液淀粉酶對淀粉有初步的消化作用，所以與部分蛋白質和脂質消化模型相比，體外模擬淀粉消化模型中胃蛋白酶和胰液素對淀粉的作用時間設置較短。目前有關糖類體外消化模型的研究主要用于分析食品中淀粉多糖、非淀粉多糖、抗性淀粉以及被 FAO 列為第七大營養(yǎng)素的膳食纖維。從已建立的糖類體外消化模型來看，大多數(shù)糖類主要模擬在口腔、胃和小腸三個部位中的消化過程，口腔中唾液淀粉酶的作用時間一般選取 6min，pH（7.0±0.2）即接近中性環(huán)境，胃中胃蛋白酶的作用時間在 0.5～2.0h，pH 在 1.5～2.0 之間，而在小腸中的消化時間就相對比較長在 3h 左右，pH 大約在 5 左右，小腸中消化糖類的酶有胰液素、淀粉轉葡糖苷酶、轉化酶等。一些研究針對抗性淀粉和纖維素含量較高的食物如豆科類植物還特別模擬了在大腸、回腸中的發(fā)酵過程[25]。近年來糖尿病等與碳水化合物攝入緊密相關的重大疾病越來越成為人們的困擾，血糖碳水化合物定義委員會建議通過建立可靠的、標準化的體外模型去模擬糖在體內的消化，但是目前這樣的模型還不是很完善，所以限制了食品工業(yè)利用營養(yǎng)標記技術控制血糖的大規(guī)模應用[24,26]。同時，大量糖類生理活性物質的開發(fā)和利用也需要消化模型的支持，所以，研究糖的體外消化模型對食品、醫(yī)藥行業(yè)有重要的意義。

脂類的體外消化模型

食物中的脂類以多種形式存在，包括活性脂質、結構脂肪、脂質乳液等。然而，大多數(shù)的脂肪在口腔、胃或是小腸中受到機械應力或是表面活性劑和穩(wěn)定劑的作用，分解為水包油乳化液[27]。因此，飲食攝入的脂肪，其消化是以水包油乳膠進行的[28]，這是脂質消化不同于其它物質的主要特點。影響脂質消化的因素有很多，Anette Mullertz 等人[29]在體外用胰脂酶對脂質進行水解以建立體外的脂質消化模型，此模型被用于難溶性親脂性藥物在可控速率下的溶解性研究。實驗中用 1 M 的 NaOH 調節(jié)pH 至 6.5，溫度設定 37℃，這時胰脂酶的活性最強，在消化液中加入純水配制的膽汁鹽和 Ca2+溶液，研究膽汁鹽和 Ca2+濃度以及酯酶活性三個參數(shù)對脂質水解速率的影響，結果發(fā)現(xiàn)三個參數(shù)對脂質的初水解速率都有影響，且只有酯酶活性和 Ca2+濃度影響隨后的水解速率，所以通過控制 Ca2+的添加濃度來控制脂質水解率從而建立一種脂質體外消化模型是可行的。與蛋白質和糖類消化不同的是膽汁鹽對脂質消化也有影響，有研究表明足夠的膽汁鹽會解析脂質顆粒表面吸附的其它活性成分，使酯酶吸附到膽汁鹽界面，從而提高脂質的消化[29,30]，因此研究中使用的脂質消化模型也多添加膽汁。脂質體外消化模型一個很重要的作用就在于對脂質制劑的篩選、評價及預測，在醫(yī)藥行業(yè)有很重要的應用。例如，我國的研究者根據(jù)脂質制劑腸消化吸收的特性，在體外脂解模型的基礎上，引入腸吸收評價方法，建立了一種用于篩選評價脂質制劑的新型體外動態(tài)腸吸收模型，研究了葡萄糖、K+、Ca2+對腸道消化吸收脂質的影響。

維生素的體外消化模型

目前研究較多的還有多種維生素的體外消化模型，如來自蔬菜和水果中的維生素 C，維生素 E，維生素 A 的前體物質類胡蘿卜素等[32]，這些活性物質在人體內有很重要的生物活性功能。在評價維生素對人類健康的作用時生物利用率是一個關鍵的概念，但是一些脂溶性的物質需形成膠微粒才會被人體吸收，所以其在人體內的生物利用率是經(jīng)過估計得到的相對值[32]，基于此目的建立了簡單、便利的體外消化模型來評價維生素在體內的生物利用率。維生素的消化率和生物利用率與多種因素相關，如食物基質、加工過程和顯微組織成分等[33]。Emmanuellae[34]等人在體外模擬了蔬菜中維生素 E 和胡蘿卜素的消化，他們建立的消化模型如下：食物與 0.9%的 NaCl 混合物均質 10min，調節(jié) pH=4.0 并加入豬胃蛋白酶溫育 30min，之后用磷酸氫鈉調節(jié) pH 至 6.0，并加入膽汁鹽和胰液素，消化時間 30min，整個過程在 37℃的恒溫震蕩水浴中進行。他們利用 HPLC 檢測了消化后胡蘿卜素和維生素 E 的含量，并計算其生物利用率，發(fā)現(xiàn)體外和體內的生物利用率有較好的相關性，r=0.9，而與從健康人群中獲得的生物利用率相比，相關性高達 0.98[35]。由此可以推斷目前一些成熟的體外消化模型是較為準確的，可以在一些研究和實際應用中使用。此外，Amanda 等人[35]模擬了親脂性的 β-胡蘿卜素的腸道靜態(tài)消化模型，圖 2 是 Fernando 等[36]研究者模擬的橙子中葉黃素脂類和花椰菜中非脂化的類胡蘿卜素與維生素 E 的體外消化模型。除脂溶性維生素外，水溶性維生素如維生素 C 的體外消化研究也開始的較早，AntonioPerez-Vicente 等人[37]于 2002 年第一次研究了石榴汁中維生素 C 在模擬的胃、腸中的消化狀況，他們建立的體外消化模型中先用濃鹽酸調 HCl-胃蛋白酶消化液的 pH 至 2.0、消化時間 2h，再用碳酸氫鈉調節(jié)胰液素和膽汁鹽消化液的 pH 至 7.5、消化時間 2h。消化后通過紫外-可見光譜從不同的酚類化合物中分辨出維生素 C，再用 HPLC 對維生素 C 進行分析，結果顯示經(jīng)模擬的胃腸道消化后在胃腸液中還存在一部分具有生物活性的維生素 C，而這部分維生素 C 對人體健康是很重要的。這些成功的研究經(jīng)驗將為今后食品維生素攝入基礎和應用研究提供有力支持。

其它物質的體外消化模型

1.金屬物質的體外消化模型

一些可食用物質中包含人體代謝所必需的金屬元素以及有毒的重金屬元素，如鎘、鉛等[38]。攝入的金屬元素，一方面需要評價其在胃腸中的潛在利用率，另一方面，需要評估其對人體的風險。因此，有必要建立體外消化模型以分析金屬元素攝入的利弊。Marise Intawongse 等人[32]總結了土壤和食物中的多種金屬離子的體外消化情況，包括 Al、As、Cd、Ce、Cu、Pb、Zn 等。金屬元素的體外消化模型條件如下，口腔：唾液、pH6.5，作用時間 2min；胃：HCl、胃蛋白酶，pH1.0-4.0，作用時間 3h；小腸：胰蛋白酶、胰液素、淀粉酶，膽汁，碳酸氫鹽，pH4-7.5，作用時間 7 h。溫度維持在 37℃，以保證所有的消化酶都發(fā)揮正常的催化效果。他們還對Cd、Pb、As、Fe 在體內做了生物利用率的相關試驗，以證明體外消化模型的準確性，結果表明體內和體外測定的生物利用率具有良好的相關性。我國研究人員進行了基于體外消化模型的香蕉果肉中可溶性鈣含量的分析，在分析過程中引入了人體外消化模型進行預處理，采用火焰原子吸收分光光度計測量 Ca 含量[39]。可見，在金屬離子生物利用率測定方面體外消化模型已經(jīng)開始發(fā)揮著重要作用。#p#分頁標題#e#

2.評估食物中污染物生物利用率的消化模型

食物的攝入是污染物進入人體很重要的途徑之一，這些污染物主要由工業(yè)、環(huán)境污染或者產品加工造成[40]。但是只有從食物中釋放的那一部分污染物才可以發(fā)揮它們的毒性作用[41]，因此生物利用度是指從食物中攝取的污染物到達體循環(huán)并且其毒性作用能夠起作用的部分。采用體外模型對有害物質的生物利用度進行合理的評估，將有利于一些工業(yè)產品有害物質殘留標準的制定。在過去的幾年中，應用體外消化模型研究了包括有害的金屬元素、黃曲霉毒素 B1、赭曲霉毒素 A、小孩誤吞的玩具等有害物質[42]攝入的危害。Oomen 等人[42]建立了相關的體外消化模型用來評價腸道中來自食物和土壤的有害物質的生物利用度，這些模型也是研究其它誤食的有害物的消化模型建立的起點。還有一些研究者依據(jù)編織物中含有的偶氮苯、指甲油中的鉛、玩具上的油漆、PVC 磁盤中的鄰苯二甲酸鹽的消化狀況建立了四種污染物的體外消化模型[43]。

體內消化和體外消化模型的關系

體外消化模型和體內消化之間有緊密的聯(lián)系，建立體外消化模型時必須以實際的體內消化情況為依據(jù)，但是目前這種體內消化數(shù)據(jù)比較缺乏[43]，這導致了科學家對不同物質的體外消化模型與體內實際消化情況的一致程度產生了爭論，例如，As 和 Pb 已經(jīng)有一些可靠的體內生物利用率數(shù)據(jù)[36]，一項研究模擬了土壤中 As 在胃和小腸中的體外消化，發(fā)現(xiàn)與幼豬的體內消化情況有很好的一致性[43]。因此，這種方法可以被用來在體外測量 As 的生物利用率。此外，F(xiàn)atouros 等[44]的報告表明，體外脂質遞送藥物的溶解數(shù)據(jù)與體內具有良好的相關性。然而，其它體內喂養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，乳化劑的類型不同，脂質通過腸道時的乳化微結構會產生很大的差別，目前的體外消化模型對此類物質還不能準確的模擬。因此，體外消化模型的研究仍需針對不同的攝入成分，有針對性的開展大量工作，不能忽視體內實際的消化情況，在建立和使用的過程中，注意與體內實際消化結果進行對比，不斷完善體外消化模型。

展望

通過前面對體外消化模型的建立和使用的研究總結發(fā)現(xiàn)，食物成分的體外消化模型是一種非常重要的研究手段。體外消化模型可以快速模擬食物和藥物在體內的消化吸收情況，對食品行業(yè)和制藥行業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。體外消化模型的建立同時也是一項非常困難的工作，盡管目前一些體外消化模型是依據(jù)人體胃腸道建立起來的，但是如果沒有體內消化為依據(jù)很難判斷哪個體外模型更加準確。所以建立體外消化模型面臨的主要問題是：（a）體外消化模型與體內消化狀況的一致性仍需大量實驗完善和驗證；（b）體外消化模型要兼顧針對性和通用性，即模型要針對特定的攝入成分，不斷改進模型的各個環(huán)節(jié)，在此基礎上可以嘗試適用于多種食用物質的消化模型，以增加它的通用性，使之在更為廣闊的領域發(fā)揮作用。針對第（a）個問題，我們需要在研究中注意體內實驗的支持，不能盲目的建立和使用。第（b）個問題的解決需要我們長期研究的積累，在借鑒他人研究成果的同時，不斷完善前人的研究方法和技術。可以預見，在不遠的未來體外消化模型的建立和使用將成為食品、藥品以及保健品等行業(yè)不可或缺的重要研究、檢測和評價手段，在此之前需要我們共同的努力，互相借鑒，共同促進體外消化模型的完善和發(fā)展。

本文作者：張艷芳 董平 梁興國 單位：山東青島中國海洋大學食品科學與工程學院