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一、穩(wěn)定碳同位素分析方法

目前常用的穩(wěn)定碳同位素測(cè)定方法有：質(zhì)譜法、核磁共振法和光譜法，其中質(zhì)譜法是穩(wěn)定同位素分析中最通用、最精確的方法。穩(wěn)定同位素質(zhì)譜分析法是先使樣品中的分子或原子電離，形成各同位素的相似離子，然后在電場(chǎng)、磁場(chǎng)的作用下，使不同質(zhì)量與電荷之比的離子流分開進(jìn)行檢測(cè)。穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀不僅能用于氣體，也可用于固體的研究，能用于幾乎所有元素的穩(wěn)定同位素分析。近年來，隨著生物地球化學(xué)元素循環(huán)研究的發(fā)展，借助同位素質(zhì)譜（EA－IRMS），多用途氣體制備及導(dǎo)入裝置－同位素質(zhì)譜（GasBenchII－IRMS）及痕量氣體預(yù)濃縮裝置－同位素質(zhì)譜（PreCon－IRMS）聯(lián)用技術(shù)的興起，碳穩(wěn)定同位素的研究有了更快的發(fā)展。穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀測(cè)定同位素比率大致分3個(gè)步驟（見圖2）：（1）樣品的收集、制備和前處理；（2）將材料轉(zhuǎn)化成具有所測(cè)元素的純氣體，（3）進(jìn)入質(zhì)譜儀檢測(cè)。

一般樣品通過前處理后，同位素質(zhì)譜聯(lián)用裝置可以完成后續(xù)的氣體轉(zhuǎn)化和測(cè)定。通常，穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀在計(jì)算機(jī)輔助下直接給出同位素比值，更先進(jìn)的儀器已可以進(jìn)行自動(dòng)化分析，如美國(guó)熱電公司的Thermosci－entificMAT253，德國(guó)元素公司的Isoprime100穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀等。植物和土壤等固體樣品，在進(jìn)行同位素質(zhì)譜分析之前必須進(jìn)行干燥、粉碎、稱量等處理。如果采集的土壤樣品中含有無機(jī)碳，在干燥前應(yīng)該進(jìn)行酸處理。制備好的樣品稱量后通過固體自動(dòng)進(jìn)樣器送入到元素分析儀－同位素質(zhì)譜（EA－IRMS）進(jìn)行碳氮同位素測(cè)定。測(cè)定土壤樣品中碳酸鹽δ13C的樣品稱量后放入樣品管，置于GasBenchII儀的恒溫樣品盤中通過酸泵滴加100％磷酸，生成的CO2氣體通過氣體自動(dòng)進(jìn)樣器送到同位素質(zhì)譜進(jìn)行碳同位素測(cè)定。

液體樣品包括土壤DOC和微生物生物量碳（MBC）等浸提液在進(jìn)行同位素質(zhì)譜分析之前要進(jìn)行分離轉(zhuǎn)化、冷凍干燥等前處理。其中土壤DOC和微生物MBC按照參考文獻(xiàn)方法用0．05mol／LK2SO4溶液提取，浸提液經(jīng)冷凍離心濃縮或者凍干機(jī)干燥獲得的粉末稱量后通過固體自動(dòng)進(jìn)樣器送入到元素分析儀－同位素質(zhì)譜（EA－IRMS）進(jìn)行碳氮同位素測(cè)定。氣體樣品包括空氣和培養(yǎng)富集氣體，用已抽真空的頂空樣品瓶采集，其中CO2氣樣需采集20～30mL，樣品中的碳同位素比值可直接通過多用途氣體制備及導(dǎo)入裝置－同位素質(zhì)譜聯(lián)用儀（GasbenchII－MS）測(cè)定。對(duì)于空氣中的CH4需采集100～150mL，樣品中的C同位素比值可通過帶有全自動(dòng)氣體預(yù)濃縮裝置－同位素質(zhì)譜聯(lián)用儀（如，美國(guó)熱電公司的PreCon－IRMS）測(cè)定。

二、穩(wěn)定同位素技術(shù)應(yīng)用

土壤是地球表層最為重要的碳庫(kù)也是溫室氣體的源或匯，但對(duì)關(guān)鍵過程及其源或匯的研究卻十分有限。隨著全球變化趨勢(shì)的日趨明顯，農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)在碳素的吸收、轉(zhuǎn)移、貯存和釋放過程中所起的作用越來越受到人們的關(guān)注。農(nóng)田土壤碳的動(dòng)態(tài)變化和循環(huán)特征及其微生物驅(qū)動(dòng)機(jī)理研究，成為當(dāng)今生態(tài)學(xué)、生物地球化學(xué)和環(huán)境科學(xué)研究的共同熱點(diǎn)。

1.穩(wěn)定同位素技術(shù)與Keeling曲線法

土壤呼吸是農(nóng)田土壤碳循環(huán)的重要組成部分，也是其排放CO2到大氣中的主要途徑。土壤呼吸以根系呼吸和土壤微生物呼吸為主。利用微氣象法能夠測(cè)定生態(tài)系統(tǒng)CO2通量，但是不能精確量化和區(qū)分根系呼吸和土壤微生物呼吸作用。應(yīng)用穩(wěn)定碳同位素技術(shù)，通過脈沖標(biāo)記法（13C－CO2標(biāo)記示蹤）和持續(xù)標(biāo)記法（自然豐度或FACE），造成根呼吸和土壤微生物呼吸CO2碳同位素組成的差異，然后分別測(cè)定土壤總呼吸、土壤微生物呼吸和根呼吸的δ13C值，追蹤土壤呼吸的來源，并根據(jù)碳同位素質(zhì)量守恒原理即可區(qū)分根系呼吸和土壤微生物呼吸，定量土壤呼吸中根系呼吸和土壤微生物呼吸的比例。目前用于測(cè)定土壤呼吸CO2碳同位素組成的取樣方法包括靜態(tài)箱（KeelingPlot）法、靜態(tài)箱平衡狀態(tài)法和動(dòng)態(tài)箱連接紅外分析儀法等，其中靜態(tài)箱法相對(duì)比較成熟，而且成本低廉。Buchmann和Ehleringer采用靜態(tài)箱研究了冠層尺度C3（紫花苜蓿）和C4（玉米）作物光合作用和土壤呼吸通量及其δ13C同位素組成變化規(guī)律，通過土壤有機(jī)碳及土壤呼吸的δ13C同位素組成差異，區(qū)分了輪作系統(tǒng)土壤呼吸及作物光合作用對(duì)凈通量的貢獻(xiàn)。隨著靜態(tài)箱方法經(jīng)過不斷的修改和完善，通過Keeling曲線法測(cè)得的農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)呼吸釋放CO2的碳同位素組成（δ13C）能夠反映作物土壤根系和微生物呼吸釋放CO2的δ13C同位素組成，以較好地理解生態(tài)系統(tǒng)的同位素鑒別。

2.土壤有機(jī)碳來源及其周轉(zhuǎn)規(guī)律研究

2.1C3／C4植物變遷自然豐度法

碳、氮、氧、氫這些輕元素在自然環(huán)境中的循環(huán)和周轉(zhuǎn)過程中，其同位素比值間的差異較大，同位素分餾效應(yīng)比較明顯，利用13C／12C、15N／14N、18O／16O和D／H同位素豐度比的變異攜帶有環(huán)境因素的信息，具有原位標(biāo)記特性。通過測(cè)定土壤或者植物中δ13C，可以研究植物－土壤生態(tài)系統(tǒng)碳來源及其周轉(zhuǎn)規(guī)律。穩(wěn)定碳同位素比值（δ13C）分析方法在土壤有機(jī)質(zhì)分解程度評(píng)估、土壤有機(jī)質(zhì)來源探討、C3／C4植被變化歷史研究等領(lǐng)域中得到日益廣泛的應(yīng)用。由于不同植物類型具有不同的δ13C值，C3植物δ13C的變化范圍為－9‰～－17‰。；C4植物δ13C的變化范圍為－10‰～－22‰，當(dāng)C3植物被C4植物所取代時(shí)就會(huì)導(dǎo)致土壤有機(jī)質(zhì)δ13C值的改變。因此，可以通過土壤有機(jī)碳δ13C值相對(duì)于參考土壤（未改變種植作物的土壤）的變化來探討土壤有機(jī)碳的周轉(zhuǎn)速度，及不同C3和C4植物來源碳占土壤碳庫(kù)各組分及氣體CO2中的比例。Balesdent和Mariotti最早通過C3和C4植物類型的變遷來研究土壤碳庫(kù)各組分的穩(wěn)定性及周轉(zhuǎn)規(guī)律，研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期耕種小麥（C3作物）的農(nóng)田土壤在連續(xù)13年種植玉米（C4作物）后，22％的土壤有機(jī)碳獲得了更新，而且不同粒徑土壤有機(jī)碳的周轉(zhuǎn)速率不同，其中＞50μm和＜2μm團(tuán)聚體中含有更多的新碳，而粘粒中土壤有機(jī)碳的更新速度最慢。

Dignac等通過C3和C4植物類型變遷長(zhǎng)期定位試驗(yàn)，采用銅氧化法結(jié)合穩(wěn)定同位素質(zhì)譜分析技術(shù)進(jìn)一步研究了植物根系殘留物（木質(zhì)素）的穩(wěn)定性及其對(duì)土壤有機(jī)碳庫(kù)的貢獻(xiàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，連續(xù)9年種植玉米（C4作物）對(duì)土壤有機(jī)碳含量、木質(zhì)素及其生物降解程度（分解和周轉(zhuǎn)）雖未產(chǎn)生顯著影響，但其碳同位素組成發(fā)生了顯著變化，其中有機(jī)碳中9％而木質(zhì)素有47％來源于玉米（C4作物），木質(zhì)素大分子的周轉(zhuǎn)速率較土壤有機(jī)碳庫(kù)更快。作為土壤碳庫(kù)中的活性組分，MBC的穩(wěn)定性和周轉(zhuǎn)速率也可以通過土壤碳自然豐度δ13C值的變化進(jìn)行研究。Blagodatskaya等通過54d室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究了C3和C4植物類型的變遷后各碳組分的周轉(zhuǎn)速率、新老碳對(duì)土壤有機(jī)碳（SOC）、微生物碳（MBC）和CO2氣體的貢獻(xiàn)以及微生物在碳分餾過程中的作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，土壤SOC及MBC的周轉(zhuǎn)時(shí)間分別為16．8年和29～30d，而且隨著種植年限的增加，周轉(zhuǎn)時(shí)間將會(huì)延長(zhǎng)。新老碳庫(kù)對(duì)SOC、MBC和CO2氣體的貢獻(xiàn)不同，其中MBC中20％碳來源于老碳（C3），CO2氣體中60％來源于老碳（C3），由于微生物對(duì)土壤老碳的偏好利用，土壤中SOC中新碳貢獻(xiàn)將逐年增加。13C自然豐度法靈敏度和分辨率較低，而且C3／C4植物更替，限制了應(yīng)用。

2.2穩(wěn)定碳同位素示蹤法

碳的穩(wěn)定同位素（13C）示蹤技術(shù)能有效地闡明地下碳動(dòng)態(tài)變化和土壤碳儲(chǔ)量的微小遷移與轉(zhuǎn)換，以及定量化評(píng)價(jià)新老土壤有機(jī)碳對(duì)碳儲(chǔ)量的相對(duì)貢獻(xiàn)。利用13C標(biāo)記秸稈研究作物秸稈、殘茬或作物根系在土壤中的分解動(dòng)態(tài)或?qū)ν寥烙袡C(jī)質(zhì)的貢獻(xiàn)，可為闡明土壤碳轉(zhuǎn)化過程及土壤肥力演變過程提供新的技術(shù)支撐。以植物殘?bào)w形式輸入的作物光合碳對(duì)土壤有機(jī)碳庫(kù)的貢獻(xiàn)及轉(zhuǎn)化規(guī)律已有大量的研究。竇森等在室內(nèi)培養(yǎng)條件下，研究了添加13C玉米秸稈后，土壤有機(jī)碳庫(kù)中胡敏酸和富里酸含量隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)期間內(nèi)，原有土壤有機(jī)碳較新形成的有機(jī)質(zhì)的分解速度慢；同時(shí)也證明該方法用于研究短期培養(yǎng)條件下新加入有機(jī)質(zhì)在土壤中的分解動(dòng)力學(xué)是可行的。

隨著同位素技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，研究者開始了對(duì)生育期內(nèi)植物—土壤體系中碳分配的量化研究，定量化評(píng)價(jià)根際沉積對(duì)土壤碳儲(chǔ)量的相對(duì)貢獻(xiàn)。比如，Li－ang等通過13C穩(wěn)定同位素培養(yǎng)試驗(yàn)研究了玉米根際沉積碳在土壤碳庫(kù)中的分配，認(rèn)為水溶性有機(jī)碳（DOC）和MBC是“新碳”的主要去向。而Yevdokimov等的研究表明燕麥根際沉積碳的主要去向?yàn)镸BC、呼吸碳和SOC，而土壤DOC并不主要來源于“新碳”。何敏毅等應(yīng)用13C示蹤技術(shù)研究表明，玉米在其生育期內(nèi)輸入到地下的總碳量為4．6t•hm－2，其中42％存在于根系中，7％轉(zhuǎn)化為土壤有機(jī)碳，剩下的41％通過根際呼吸進(jìn)入大氣。不同研究結(jié)果的差異可能由于不同學(xué)者采用的研究方法、作物及土壤類型不同造成。

3.穩(wěn)定同位素探針技術(shù)（SIP）

農(nóng)田系統(tǒng)是半開放的人工系統(tǒng)，進(jìn)入土壤的新鮮有機(jī)物質(zhì)包括自然歸還的植物殘?bào)w和根系分泌物、人為歸還的有機(jī)肥等，而系統(tǒng)碳輸入是影響土壤有機(jī)碳動(dòng)態(tài)的最主要因素之一。土壤微生物是土壤有機(jī)質(zhì)、土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和循環(huán)的動(dòng)力，是土壤有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化的執(zhí)行者。外源有機(jī)質(zhì)（“新碳”）進(jìn)入礦質(zhì)土壤基質(zhì)后，發(fā)生由微生物介導(dǎo)的物理–化學(xué)–微生物的轉(zhuǎn)化過程。“新碳”輸入土壤，經(jīng)土壤微生物作用轉(zhuǎn)化為有機(jī)質(zhì)，影響土壤有機(jī)碳含量及其組分的變化，或轉(zhuǎn)化為CO2和CH4等氣體返回大氣。應(yīng)用同位素示蹤技術(shù)結(jié)合微生物分子生物學(xué)技術(shù)（PLFA／DNA／RNA－SIP）能夠定量化“新碳”在土壤碳庫(kù)中的轉(zhuǎn)化動(dòng)態(tài)及其對(duì)土壤碳儲(chǔ)量的相對(duì)貢獻(xiàn)，闡明微生物種群結(jié)構(gòu)與“新碳”轉(zhuǎn)化及穩(wěn)定性之間的關(guān)系。Lu等用13CO2對(duì)水稻進(jìn)行脈沖標(biāo)記，通過13C－PLFA圖譜分析發(fā)現(xiàn)，不同根際微生物對(duì)植物光合作用產(chǎn)物有不同的吸收特征，證明了水稻根際微生物種群與植物光合作用密切相關(guān)。進(jìn)一步對(duì)土壤13C－DNA進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)水稻ClusterIArchaea類群的核糖體RNA中含有13C，表明此類細(xì)菌可能在由植物碳源產(chǎn)生甲烷的過程中起重要作用，對(duì)全球氣候變化具有重要影響。

Bastian等定量研究了土壤外源添加小麥秸稈后，參與秸稈分解過程的（共168d，8個(gè)時(shí)間點(diǎn)）微生物種群結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在秸稈降解的前期（14～28d）和后期（28～168d）細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯，這主要是秸稈降解過程中養(yǎng)分由豐富向貧瘠轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)的微生物r選擇和k選擇的結(jié)果。另外，農(nóng)田土壤除作物光合碳根際輸入外，還存在大量的光合自養(yǎng)微生物，通過卡爾文循環(huán)固定大氣CO2合成有機(jī)物，并轉(zhuǎn)化為土壤有機(jī)碳，對(duì)農(nóng)田土壤有機(jī)碳累積的貢獻(xiàn)不可忽視。而農(nóng)田土壤中參與了“新碳”的輸入、分配與轉(zhuǎn)化的主要微生物種群，及其與“新碳”轉(zhuǎn)化的相互關(guān)系如何，有待進(jìn)一步研究。SIP能夠?qū)⒐δ芎头N群分類聯(lián)系起來，在微生物生態(tài)學(xué)研究中有著巨大的應(yīng)用潛力，隨著可用底物種類的增加（N、H），SIP技術(shù)將有可能鑒定出更多在碳、氮及其他元素循環(huán)中發(fā)揮重要作用的微生物。

三、展望

穩(wěn)定碳同位素技術(shù)已在土壤有機(jī)質(zhì)的轉(zhuǎn)化、土壤中碳素的來源及其影響因素等方面得到了較廣泛的應(yīng)用。然而，我國(guó)農(nóng)田土壤碳同位素研究大多集中于對(duì)C3和C4植物碳同位素、土壤CO2和土壤有機(jī)碳的同位素組成的測(cè)定與分析，對(duì)于農(nóng)田土壤管理方式以及土壤質(zhì)地、溫度等環(huán)境條件對(duì)土壤碳周轉(zhuǎn)過程的影響機(jī)理研究還很少。另外，土壤微生物是土壤有機(jī)質(zhì)和土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和循環(huán)的動(dòng)力，是土壤有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化的執(zhí)行者，但有關(guān)微生物種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量與農(nóng)田土壤碳轉(zhuǎn)化及穩(wěn)定性之間的關(guān)系尚知之甚少。因此，有以下幾方面的問題有待進(jìn)一步的研究：

（1）利用13C自然豐度法和示蹤技術(shù)相結(jié)合，定量土壤有機(jī)碳的周轉(zhuǎn)速度，確定土壤有機(jī)碳的來源，深入研究不同農(nóng)田管理方式對(duì)農(nóng)田土壤碳素累積和轉(zhuǎn)化的影響；

（2）分析土壤13C有機(jī)碳富集的基本機(jī)制、闡明土壤13C豐度與植被類型、土壤溫度、質(zhì)地之間的關(guān)系，進(jìn)一步評(píng)價(jià)不同農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)碳貯存潛力；

（3）通過穩(wěn)定碳同位素示蹤結(jié)合微生物分子生物學(xué)技術(shù)，探討農(nóng)田土壤有機(jī)碳周轉(zhuǎn)的微生物分子機(jī)理。綜上所述，我國(guó)農(nóng)田土壤碳循環(huán)過程的穩(wěn)定同位素技術(shù)研究還處于探索發(fā)展階段，有許多關(guān)鍵問題有待解決。隨著穩(wěn)定同位素分析儀器品種的增加、自動(dòng)化程度的提高和分析方法的不斷完善，該研究領(lǐng)域?qū)?huì)進(jìn)入一個(gè)全面發(fā)展的新階段。

作者：袁紅朝 李春勇 簡(jiǎn)燕 耿梅梅 許麗衛(wèi) 王久榮 單位：中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科技學(xué)院