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救火事跡材料范文1

【關(guān)鍵詞】 組織型纖溶酶原激活因子(t-PA)；包被Dacron；PTEE；表面血小板

近年來的很多研究表明［Lin TL，Lu FM，Sheu MS. Antimicrobial coatings: A remedy for medical device-related infections. Med Dev Tech，2001］，在由生物材料引發(fā)的感染（biomaterial centered infection，BCI）中，45%的原因是因?yàn)樯锊牧吓c人體接觸時(shí)，血液和組織中的纖維粘連蛋白（fibronectin）、玻璃粘連蛋白（vitronectin）和纖維蛋白原（fibrinogen）會(huì)吸附在材料表面，形成一層蛋白膜，而細(xì)菌很容易在這層蛋白膜上黏附，繼而生長(zhǎng)繁殖，逐漸形成一層頑固的水合多聚糖性質(zhì)的生物活性膜（biofilm）［1］。這層生物膜可以吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有一定厚度，產(chǎn)生很強(qiáng)的抗藥能力，傳統(tǒng)的抗菌治療是無法根除的。根據(jù)細(xì)菌性感染的機(jī)理，本文就t-PA對(duì)生物材料表面血小板黏附的作用及影響進(jìn)行初步探討。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料和儀器 滌綸（Dacron）B型（蘇州華明織帶有限公司），膨體聚四氟乙烯（PTEE，美國(guó)Gore&Associates公司）。谷胱苷肽硫基轉(zhuǎn)移酶（Glutathione-S-trasferase，GST）和GST-t-PA融合蛋白由實(shí)驗(yàn)室制備，液體培養(yǎng)基（法國(guó)生物梅里埃公司）。

1.2 材料的包被 將Dacron和PTEE薄膜剪裁成96孔酶標(biāo)板等大的原片，用蒸餾水充分漂洗干凈后在70%的酒精中浸泡30min，無菌條件下取出、晾干，置入96孔板中，每種材料分成3組，每孔分別加入100μl含0.5mg/ml GST-t-PA的Tris-HCl緩沖液（pH8.0）或含0.5mg/ml GST的Tris-HCl緩沖液或單純的Tris-HCl緩沖液，4℃放置過夜，棄去上清液，用Tris-HCl緩沖液（50mM Tris-HCl，pH8.0/120mM NaCl）輕輕漂洗兩次移入新的96孔板孔中備用。

1.3 材料植入動(dòng)物模型的制作 2.5～3.0kg雄性新西蘭大耳白兔72只（武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），隨機(jī)分為3組(各組24只)：空白對(duì)照組，GST蛋白組和GST-t-PA蛋白組，每組又分為兩組，D組（放置Dacron片）和PEET組(放置PEET片)。

動(dòng)物稱重后，2%戊巴比妥鈉（35mg/kg）耳緣靜脈麻醉動(dòng)物，備皮消毒后沿股動(dòng)脈走向切開皮膚，分離出兩側(cè)的股動(dòng)脈和股靜脈，結(jié)扎股動(dòng)脈的側(cè)枝循環(huán)，經(jīng)股靜脈注射肝素(10U/kg體重)，5min后從兩端夾閉股動(dòng)脈，其間間隔不小于6cm，用眼科剪剪開0.3cm左右的縱口，用生理鹽水將血管內(nèi)的血液沖洗干凈，然后放入經(jīng)GST蛋白或GST-t-PA蛋白包被處理的兩種滌綸材料膜片，空白組進(jìn)行手術(shù)后血管縫合，不予以任何處理。用3-0聚丙烯線縫合血管，移去動(dòng)脈夾使血流再通，密切觀察手術(shù)處股動(dòng)脈搏動(dòng)情況。麻醉恢復(fù)后，正常飼養(yǎng)。于術(shù)后第2天，每組隨機(jī)選8只行血小板沉積實(shí)驗(yàn)。

1.4 血小板在材料表面黏附的觀察（體外實(shí)驗(yàn)） 取空白組新鮮兔動(dòng)脈血，按9∶1的比例與3.8%的枸櫞酸鈉溶液混勻，離心分離富含血小板的血漿，用PBS將血小板數(shù)目調(diào)節(jié)至106/ml，取150μl加到上述處理的材料表面然后于37℃放置30min，棄取血漿，用PBS將材料膜片輕輕漂洗3遍后用2.5%的戊二醛固定2h，經(jīng)冷凍干燥后進(jìn)行掃描電鏡觀察。隨機(jī)選取6個(gè)視野進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)。

1.5 對(duì)機(jī)體內(nèi)血小板黏附的觀察（在體實(shí)驗(yàn)） 在植入物后2天，各組8只動(dòng)物按前述方法麻醉，常規(guī)分離提取血小板，于血小板懸液內(nèi)逐漸滴加Cr51鉻酸鈉溶液18.5MBq（0.5mCi）。將51Cr標(biāo)記的血小板懸液2ml經(jīng)股靜脈注入體內(nèi)，1h后取出移植材料，用PBS輕輕沖洗，并置于γ記數(shù)井中記數(shù)，同時(shí)抽取全血標(biāo)本確定以確定游離和細(xì)胞51Cr活性，測(cè)定血小板計(jì)數(shù)和凝血酶原時(shí)間(PT)。

2 結(jié)果

2.1 血小板在材料表面黏附的觀察（體外實(shí)驗(yàn)） 結(jié)果顯示，用t-PA重組蛋白及GST蛋白處理醫(yī)用Dacron及PEEP片，可明顯抑制血小板在其表面的粘附，對(duì)Dacron片，用GST包被使其表面的血小板數(shù)目比對(duì)照組減少了大約42.3%(P＜0.01)；而TFPI重組蛋白處理組的血小板粘附數(shù)目減少更為明顯，與對(duì)照組相比減少了大約76.4%(P＜0.01)。在聚氯乙烯材料的實(shí)驗(yàn)中，也得到了類似的結(jié)果，其中GST處理的材料表面的血小板數(shù)目比對(duì)照組減少了大約34.1%(P＜0.05)；TFPI重組蛋白比對(duì)照組則減少了大約74.8% (P＜0.01)。在兩種材料的實(shí)驗(yàn)中GST組與TFPI重組蛋白組之間相比都有明顯的差異(P＜0.05) (見圖1)。

2.2 在體實(shí)驗(yàn)中機(jī)體內(nèi)血小板沉積的影響 在體實(shí)驗(yàn)研究表明，Dacron組中，GST-tPA組血管血小板沉積明顯少于GST組和空白對(duì)照組載體組和空白對(duì)照組，（P＜0.05）；PEEP組也得出相同的結(jié)論。見表1。

1 Conarweron JW，Stewart PS，Greenberg EP. Bacterial biofilms. A common cause of persistent infections. Science，1999，284：5418.

2 Tang L，Sheng Y. The mechanism of device－centered infection. Thans Soc Biomater ，1998，24：7.

3 Lijuen HR，Collen D.Strategies for the improvement of thrombolytic sgents.Throb Haemost，1991，66:88-110.

4 Collen D，Lijnen HR. Thrombolytic agents. Thromb haemost，2005，93(4):627-630.