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大一學(xué)習(xí)計劃書范文1

    (一)基本假設(shè)

    意象對話技術(shù)的基本假設(shè)是意象具有象征性,人的心理狀況是可以通過人的意象反映,而改變意象可以改變?nèi)说男睦頎顩r;溝通的兩者通過使用意象,通過意象的象征意義進(jìn)行交流。心理咨詢師可以通過意向?qū)υ捈夹g(shù)進(jìn)入來訪者的潛意識區(qū)域或者心理的深層,在使用意象交流的過程中,改變來訪者的心理意象,從而達(dá)到改變來訪者心理狀況的過程。

    (二)意象與象征性

    意象(imagery)是腦對不在眼前的事物的形象的反映,可以分為兩種[1]:一種是客觀世界在頭腦中的圖象表征,也就是類似于“表象”,例如,說到蛇的時候,在頭腦中出現(xiàn)的蛇的形象;第二種,意象代表一種象征意義。例如,在夢里見到一條蛇,也許它代表的是人生活中的一個陰險小人;也許它代表的是一個男人的欲望等。在意象對話技術(shù)中,意象的第二種意義更為重要。意象對話技術(shù)中提出元意象的概念。元意象是當(dāng)一類事物被綜合了它的特點后,找到了一個有代表性的形象,也就是一個概括的意象。

    (三)心理能量學(xué)

    意象對話技術(shù)中,認(rèn)為人的心理能量是里比多,但是里比多是人的生命力,而不是性能量。心理能量的產(chǎn)生有兩種形式[1]:一是自發(fā)產(chǎn)生,在適當(dāng)?shù)男睦頎顟B(tài)下,心理能量自發(fā)產(chǎn)生;二是被激發(fā)產(chǎn)生,是本能的力量被激發(fā)而產(chǎn)生。人從本能中獲得自發(fā)心理能量,通過激發(fā)后,可以產(chǎn)生多種形式的激發(fā)能量。心理能量在一定的情況下能夠相互轉(zhuǎn)化,并遵循能量守恒原則。被激發(fā)的能量在一定的時候會釋放。釋放有正常的釋放與不正常的釋放兩大形式。正常的釋放形式是自然地釋放,例如當(dāng)人覺得很悲傷,大哭一場是自然的、正常的釋放。當(dāng)人的心理能量得到正常的釋放時,人會保持一個健康的心理狀態(tài)水平。心理能量的不正常釋放具有兩種形式———壓抑與沉溺。壓抑引發(fā)的沖突及沉溺引發(fā)的情緒都可以轉(zhuǎn)換為各種各樣的意象。意象對話技術(shù),使人在醒著的時候,人仍可以看到各種化身為意象的心理沖突。

    (四)心理障礙

    心理障礙是人情緒和心理能量的郁結(jié)。過去的經(jīng)歷讓人壓抑和沉溺,而壓抑和沉溺是人心理的情結(jié)。內(nèi)容相似的情結(jié)會相互結(jié)合,形成更大的情結(jié),是心理能量的郁結(jié)。情結(jié)具有強(qiáng)大的心理能量。如果人不設(shè)法調(diào)走情結(jié)的能量,那么它會永遠(yuǎn)留在人的心靈深處,久而久之,便產(chǎn)生了心理障礙。

    二、意象對話技術(shù)的應(yīng)用

    意象技術(shù)是咨詢者與來訪者用象征性語言在交流,是心和心的交流,意象技術(shù)的基本程序如下:

    (一)引入過程

    意象對話技術(shù)中,咨詢者是處于一個引導(dǎo)的角色,引導(dǎo)來訪者進(jìn)行想象。在引導(dǎo)的過程中,咨詢師可以對成年人解釋一下意象對話技術(shù);對有心理問題的來訪者,可以告知本方法對治療這種心理問題是有效的。

    (二)想象過程

    心理咨詢者和治療者可以先設(shè)定一個內(nèi)容,讓來訪者想象。要求來訪者針對某些特殊問題進(jìn)行想象,相當(dāng)于投射性的測驗。咨詢者可以給來訪者設(shè)定起始意象。設(shè)定的起始意象可以有很多,例如,可以是房子、花、蛇、坑等,也可以是來訪者的夢。

    (三)咨詢者分析意象

    來訪者想象的意象都有象征意義,心理咨詢者和治療者可以分析其象征意義。分析來訪者的意象時,可采用分析原始意象的方式進(jìn)行,并分辨出來訪者意象的變種。

    (四)心理咨詢師作誘導(dǎo)

    心理咨詢師用象征性意象誘導(dǎo)來訪者改變。心理咨詢師或者引導(dǎo)者有兩種基本方法,一種主要是讓來訪者想象,心理咨詢師只是聽他的想象,并用語言誘導(dǎo);另一種是心理咨詢師介入,心理咨詢師讓來訪者想象的時候,把咨詢師也作為想象的一個對象。

    (五)反復(fù)想象和強(qiáng)化

    利用反復(fù)的想象和強(qiáng)化,讓一個新的意象替代舊的意象。咨詢者可以通過布置意象作業(yè),讓來訪者練習(xí),以鞏固來訪者心中的意象。這是對意象的反復(fù)想象和強(qiáng)化。

    (六)學(xué)會區(qū)分想象和現(xiàn)實

    意象對話可以把消極的意象原型轉(zhuǎn)化為積極的,但是,來訪者本身的想象與現(xiàn)實的區(qū)分能力可能會比較的弱,如果僅僅是停留在意象中,可能會造成來訪者在想象中可以調(diào)節(jié)出很好的心理狀態(tài),但是不能在現(xiàn)實生活中調(diào)節(jié)自己的心態(tài),于是讓來訪者在意象對話的過程中區(qū)分想象與現(xiàn)實是很必要的。心理咨詢與治療師可以用兩種方法使來訪者辨別想象和現(xiàn)實:一種是忽然喚醒法,也就是在來訪者做意象的時候,忽然讓來訪者睜開眼睛,并說出現(xiàn)在看到的是什么。第二種是借鑒格式塔療法中的一個小技術(shù),就是用8分鐘的時間讓來訪者不停地說“我現(xiàn)在……”。

    三、大學(xué)生是意象對話的適合人群

    (一)意象對話技術(shù)有利于大學(xué)生探索自我。大學(xué)生處于心理意識加速發(fā)展的時期,在這一階段,生活環(huán)境的改變,生理的發(fā)展,生活經(jīng)驗的增加等給大學(xué)生帶來極大的沖擊,也促進(jìn)大學(xué)生從生理自我、社會自我、心理自我等方面全面地重新認(rèn)識自我。然而,在認(rèn)識自我的過程中,“我是誰”這個問題大大地困擾著大學(xué)生。意象對話技術(shù)可以讓大學(xué)生在無意識中理順自己對自己、人生、對世界的認(rèn)識,形成良好的自我觀、人生觀和價值觀。

    (二)大學(xué)生的思維、領(lǐng)悟力的發(fā)展,能更好發(fā)揮意象對話技術(shù)的效果。隨著大學(xué)生的思維能力的發(fā)展,抽象思維的發(fā)展、思維的靈活性、創(chuàng)造性、領(lǐng)悟力處于發(fā)展的高峰期,讓意象對話技術(shù)中的意象想象中較容易呈現(xiàn)出需要的意象。思維的發(fā)展加上大學(xué)生自我探索的迫切需要,讓大學(xué)生在進(jìn)行意象誘導(dǎo)環(huán)節(jié)時,更容易領(lǐng)悟及進(jìn)行自我探索,使意象對話技術(shù)產(chǎn)生較大的效果。

    (三)大學(xué)生區(qū)分現(xiàn)實與想象的能力增強(qiáng),更能避免意象對話的消極效應(yīng)。意象對話的一個較大的弱點是擔(dān)心來訪者沉溺于想象中,也無法區(qū)分現(xiàn)實與想象。皮亞杰認(rèn)為現(xiàn)實監(jiān)控能力是在12歲左右發(fā)展成熟,大學(xué)生處在18-25歲之間,具有較強(qiáng)的現(xiàn)實區(qū)分能力,更容易從想象意象中抽離。

    四、意象對話技術(shù)在大學(xué)生心理教育中的應(yīng)用

    (一)利用房子意象對大學(xué)生進(jìn)行心理測試。根據(jù)意向?qū)υ捈夹g(shù)的原理,教育者可以利用意象對話技術(shù)中的意象了解大學(xué)生的真實心理狀態(tài),尤其是其中的房子意象。當(dāng)大學(xué)生坦誠地回答紙筆測試中的問題時,測試能夠較好地反映他們的心理狀況,然而大學(xué)生具有一定的封閉性心理,有時自己的心理狀態(tài)不愿意真實地呈露,容易在一般的心理測試中進(jìn)行虛假回答,掩飾自己的真實心理狀況;意象是利用人的無意識心理呈現(xiàn),減少測試者的掩飾性,能夠更好地反映大學(xué)生的真實心理狀態(tài)。研究者也發(fā)現(xiàn),房子意象與艾森克人格問卷、癥狀自評量表等不同維度有顯著性相關(guān)。因此教育者可以利用意象對話技術(shù)中的意象作為心理測試的補(bǔ)充,了解學(xué)生的真實心理,更有針對性地開展工作。

    (二)利用意象對話技術(shù)開展團(tuán)體訓(xùn)練。研究者利用意象對話技術(shù)進(jìn)行團(tuán)體訓(xùn)練,發(fā)現(xiàn)參與人員的強(qiáng)迫癥狀、人際關(guān)系敏感、抑郁、精神病性等因子分顯著下降,認(rèn)為意象對話技術(shù)對改善心理健康有著積極的影響。在大學(xué)生的心理調(diào)整過程中,針對大學(xué)生的情緒調(diào)整、人際關(guān)系等嘗試使用意象對話技術(shù)開展團(tuán)體訓(xùn)練,會對大學(xué)生的心理調(diào)整產(chǎn)生意象不到的效果。

大一學(xué)習(xí)計劃書范文2

【關(guān)鍵詞】大學(xué)藝術(shù)設(shè)計教育；數(shù)字化技術(shù)；應(yīng)用

計算機(jī)的普及以及互聯(lián)網(wǎng)的推廣，使人類進(jìn)入了信息化的時代，由于互聯(lián)網(wǎng)具有開放性、全球化等特點，數(shù)字化技術(shù)對藝術(shù)設(shè)計領(lǐng)域造成了很大的沖擊。計算機(jī)技術(shù)、網(wǎng)絡(luò)技術(shù)等數(shù)字化技術(shù)逐漸的應(yīng)用與高校藝術(shù)設(shè)計教育中。通過我國教學(xué)改革的進(jìn)行，許多的教學(xué)方式得到了大力的推廣和應(yīng)用，實踐證明，這些新教學(xué)方法的應(yīng)用，在教學(xué)過程中發(fā)揮著不同程度的作用。數(shù)字化技術(shù)教學(xué)是這些新教學(xué)方法中的一種，其在高校藝術(shù)設(shè)計教學(xué)中可以發(fā)揮更大的優(yōu)勢，對提高藝術(shù)設(shè)計水平有重大的意義。

一、數(shù)字化技術(shù)教學(xué)概述

隨著信息時代的到來，信息產(chǎn)業(yè)得到了長足的發(fā)展，越來越多的數(shù)字化設(shè)備應(yīng)用到人們的生活與工作當(dāng)中，人們正式的進(jìn)入數(shù)字化時代。教育行業(yè)在數(shù)字化環(huán)境下也得到了很大的沖擊與發(fā)展，高校的硬件、軟件設(shè)施都以具有一定的規(guī)模。隨著社會對人才需求量的增多，對高校教育水平也提出了更高的要求，要求大學(xué)生不僅能夠?qū)W好專業(yè)知識，還應(yīng)該德智體美全面發(fā)展。在大學(xué)藝術(shù)設(shè)計教學(xué)中，利用數(shù)字化技術(shù)，將傳統(tǒng)的藝術(shù)設(shè)計與豐富的數(shù)字化有機(jī)的結(jié)合起來，能夠使學(xué)生更加的直觀的感受到藝術(shù)設(shè)計的本質(zhì)，并促使學(xué)生積極主動的參與到教學(xué)活動中，幫助學(xué)生整合相關(guān)的知識點，設(shè)計出更多更富有藝術(shù)的作品。這樣能夠提升大學(xué)生的藝術(shù)創(chuàng)造力，充分的發(fā)揮出大學(xué)生自身的潛力。

在藝術(shù)設(shè)計領(lǐng)域，隨著信息數(shù)字化技術(shù)的快速發(fā)展，藝術(shù)設(shè)計教育應(yīng)該面向媒體，逐漸的培養(yǎng)學(xué)生的認(rèn)知能力，促使學(xué)生在設(shè)計理念、藝術(shù)審美等各個方面得到全面的提升。在藝術(shù)設(shè)計過程中，越來越多的軟件被應(yīng)用，雖然其能夠達(dá)到手工無法達(dá)到的效果，但在時間、工作量等方面有一定的局限性，所以在實際的創(chuàng)作過程中，需要根據(jù)實際的情況進(jìn)行選擇，手工與先進(jìn)技術(shù)的有效結(jié)合，才是藝術(shù)設(shè)計的方向。

二、數(shù)字化技術(shù)教學(xué)在大學(xué)藝術(shù)設(shè)計教育中的有效應(yīng)用

（一）在大學(xué)藝術(shù)設(shè)計教學(xué)中加快軟件的融入

隨著科技的發(fā)展，越來越多的數(shù)字化設(shè)備與軟件應(yīng)用到大學(xué)藝術(shù)設(shè)計教學(xué)過程中，但由于大學(xué)藝術(shù)設(shè)計的特殊性，需要表現(xiàn)不同的藝術(shù)形式與空間，這就要求教學(xué)使用的軟件能具備多樣性。在高校藝術(shù)設(shè)計教學(xué)中，教師應(yīng)該將這些軟件功能以及使用方式交給學(xué)生，使學(xué)生能夠有效的掌握并熟練的應(yīng)用。目前藝術(shù)設(shè)計專業(yè)的課程中，有一種或幾種藝術(shù)設(shè)計軟件，不能滿足藝術(shù)設(shè)計的各項要求，缺乏多樣性，這就需要大學(xué)藝術(shù)教學(xué)不能將重點放于一款軟件上，要根據(jù)專業(yè)的具體安排，多層系、多角度的引入各類應(yīng)用軟件，加強(qiáng)對大學(xué)生的教育，充分調(diào)動學(xué)生學(xué)習(xí)的積極性，提高學(xué)生掌握并應(yīng)用先關(guān)軟件的能力。

（二）采用啟發(fā)式教學(xué)模式，增強(qiáng)學(xué)生的應(yīng)用能力

利用數(shù)字化技術(shù)進(jìn)行藝術(shù)設(shè)計，計算機(jī)效果圖是藝術(shù)設(shè)計中具有較強(qiáng)應(yīng)用性的課程，效果圖的每一個參數(shù)以及命令都是效果圖的集中表現(xiàn)，衡量效果圖制圖者的水平，一般以參數(shù)的搭配以及調(diào)整參數(shù)的靈活性作為標(biāo)準(zhǔn)。這就需要的大學(xué)藝術(shù)設(shè)計教學(xué)中，根據(jù)教學(xué)的實際情況與內(nèi)容，加強(qiáng)對學(xué)生自主操作能力的培養(yǎng)，使其能夠有效的運(yùn)用數(shù)字化技術(shù)，提高學(xué)生解決實際問題的能力。我國大學(xué)藝術(shù)設(shè)計教育教學(xué)過程中，往往是教師對軟件的操作進(jìn)行逐一講解，學(xué)生根據(jù)老師的步驟完成相關(guān)的操作，缺乏自主操作。在這種教學(xué)模式下，學(xué)生沒有主動學(xué)習(xí)的意識，進(jìn)行藝術(shù)設(shè)計也受到老師思想的束縛，只是不斷的模仿。所以必須利用啟發(fā)式教學(xué)模式，讓學(xué)生參與到實際的藝術(shù)設(shè)計項目中，提倡學(xué)生獨立完成設(shè)計工作。

（三）在數(shù)字化技術(shù)的基礎(chǔ)上，加大藝術(shù)設(shè)計創(chuàng)新教育

在數(shù)字化技術(shù)的大環(huán)境下，傳統(tǒng)的藝術(shù)設(shè)計教育受到了很大的沖擊，這就需要轉(zhuǎn)變傳統(tǒng)的教育理念，開拓創(chuàng)新。首先要從大學(xué)藝術(shù)設(shè)計課堂做起，堅持學(xué)生為課堂主體的中心思想，教師復(fù)雜指導(dǎo)與引導(dǎo)，注重教學(xué)內(nèi)容、方式上的變化，積極開展課堂討論、辯論，培養(yǎng)學(xué)生自主思考的能力；其次需要從校園文化做起，積極的開展校園文藝表演、美術(shù)展覽、學(xué)術(shù)講座等活動，為學(xué)生藝術(shù)創(chuàng)造營造良好的校園環(huán)境；最后，鼓勵學(xué)生積極開展各項社會調(diào)查活動，鼓勵學(xué)生參加各項社會實踐活動，使其充分的認(rèn)識社會，豐富自身的藝術(shù)才干，避免藝術(shù)設(shè)計推理了實際，產(chǎn)生違和感。

三、總結(jié)

數(shù)字化時代的到來，是我們的文化形象得到了改變，藝術(shù)設(shè)計教育也發(fā)生了巨大的變化。數(shù)字化設(shè)備為藝術(shù)設(shè)計提供了技術(shù)工具，并且計算機(jī)技術(shù)、網(wǎng)絡(luò)技術(shù)等創(chuàng)造了新的藝術(shù)表達(dá)方式，實現(xiàn)了藝術(shù)信息的交流及共享。在數(shù)字化時代，藝術(shù)教育只有加強(qiáng)創(chuàng)新，才能適應(yīng)時代的發(fā)展，使藝術(shù)設(shè)計作品更加貼近生活，使學(xué)生充分的掌握現(xiàn)代藝術(shù)的潮流，為社會培養(yǎng)更多更優(yōu)秀的藝術(shù)設(shè)計人才。

參考文獻(xiàn)：

[1]關(guān)潔.數(shù)字化：藝術(shù)教育創(chuàng)新的助推器[J].河南社會科學(xué).2010，15（5）：256-257

大一學(xué)習(xí)計劃書范文3

[關(guān)鍵詞]MMP_2；MMP_9；TIMP_1；血管平滑肌細(xì)胞；增殖；遷移；阿齊沙坦

中圖分類號：R544.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1009_816X（2014）04_0274_04

[Abstract] Objective To investigate the effects of azilsartan on TGF_β_induced spontaneously hypertensive vascular smooth muscle cells （VSMCs） proliferation and migration. Methods Rat VSMCs were cultivated by the method of tissue explants adherence. Cells of generation 3 to 5 were used as the experimental system. The MTT test was used to measure cell proliferation and Boyden chamber assay was used to measure cell migration. Primary cultured VSMCs were treated by 10 ng/ml TGF_β and azilsartan for 24 hours. The expression of MMP_2， MMP_9， TIMP_1 were measured by Western blot and RT_PCR. Results The expression of MMP_2， MMP_9 and TIMP_1 in rat VSMCs stimulated by TGF_β increased significantly. VSMCs migration and proliferation also increased significantly. Azilsartan significantly inhibited TGF_β induced MMP_2， MMP_9 and TIMP_1 production in rat VSMCs， as well as VSMCs proliferation and migration. Conclusions Azilsartan inhibited TGF_β_induced VSMCs proliferation and migration by down_regulation the expression of MMP_2， MMP_9， TIMP_1.

[Key words] MMP_2； MMP_9； TIMP_1； Vascular smooth muscle cells ；Proliferation； Migration； Azilsartan

自發(fā)性高血壓是最常見的心血管疾病，以體循環(huán)動脈壓升高為主要特點。高血壓伴發(fā)的血管重構(gòu)包括血管壁腔比增加、小動脈稀少及血管功能異常。基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是參與降解全身各種組織細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的蛋白酶家族，參與正常和病理條件下的組織重構(gòu)，金屬蛋白酶組織抑制物（TIMP）是MMPs的特異性抑制物[1]。MMPs/TIMP的動態(tài)改變，造成選擇性的降解ECM，從而調(diào)整血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)、生長和成活[2]。血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑可能是通過抑制局部腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)（RAS）活性和緩激肽的降解來抑制或逆轉(zhuǎn)血管重構(gòu)[3]。阿齊沙坦是一種血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，多用于治療高血壓病[4]。但沙坦類藥物是否可抑制血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）中MMPs/TIMP的表達(dá)則鮮有報道。通過藥物抑制MMPs/TIMP活性，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，阻止血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移是防治高血壓發(fā)生、發(fā)展的一個可能的切入點。本研究觀察血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑阿齊沙坦對血管平滑肌細(xì)胞中MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表達(dá)的影響，探討轉(zhuǎn)化生長因子_β（TGF_β）在自發(fā)性高血壓大鼠發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中誘導(dǎo)細(xì)胞外MMPs/TIMP分泌及促平滑肌細(xì)胞遷移、增殖能力，為臨床應(yīng)用阿齊沙坦治療高血壓提供指導(dǎo)信息。

1資料和方法

1.1材料：自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）和同一株系的正常血壓大鼠（WKY）大鼠（購自上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院高血壓研究所），雄性，7～10周齡。血壓：SHR>170mmHg（1mmHg=0.113kPa），WKY

1.2實驗分組：將大鼠斷頭處死，無菌情況下分離胸主動脈，剪碎后加入含有20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，用貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法行原代細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞長成致密單層后傳代，取3～5代細(xì)胞用于實驗。在傳代過程中，細(xì)胞以5×105個/ml接種于6孔板培養(yǎng)板上。實驗前48h換成不含血清的DMEM，使細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)。將培養(yǎng)的VSMC分成6組：WKY組、SHR組；TGF_β刺激WKY組、TGF_β刺激SHR組：10ng/ml TGF_β誘導(dǎo)增殖；TGF_β刺激WKY組阿齊沙坦給藥組、TGF_β刺激SHR組阿齊沙坦給藥組：50μmol/ml阿齊沙坦預(yù)處理30min后，用10ng/ml TGF_β誘導(dǎo)增殖。各組均應(yīng)用0.2%胎血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞。

1.3MTT法檢測阿齊沙坦對TGF_β誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞增殖的作用：取對數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔3×104/孔均勻接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，按照上述分組方法將各組細(xì)胞懸液接種于96孔板上，培養(yǎng)24h后，結(jié)束實驗，將每孔的培養(yǎng)液吸出，重新加入180μl培養(yǎng)液，然后每孔加入濃度為5mg/ml的MTT液20μl。在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸取培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 200μl振蕩10min，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長測定各孔A值，取每組3孔的均值。

1.4Boyden趨化小室檢測阿齊沙坦對TGF_β誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞遷移的影響：取對數(shù)生長期的VSMCs，將培養(yǎng)的VSMCs分成6組觀察VSMCs遷移：WKY組、SHR組：上室中加入未經(jīng)處理的VSMCs懸液，下室中加人DMEM；TGF_β刺激WKY組、TGF_β刺激SHR組：上室中加入未經(jīng)處理的VSMCs懸液，下室中加入10ng/ml TGF_β 0.5ml；TGF_β刺激WKY組阿齊沙坦給藥組、TGF_β刺激SHR組阿齊沙坦給藥組：上室中加入50μmol/ml阿齊沙坦孵育2h的VSMCs懸液，下室中加入10ng/ml TGF_β 0.5ml。上、下室之間隔以8μm孔徑聚碳酸酯濾膜。將建立好的Boyden小室放入一容器培養(yǎng)24h后取出濾膜，固定、染色，在高倍鏡下（×400）隨機(jī)觀察6個視野，計數(shù)移行細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.5Western blot檢測蛋白表達(dá)：取對數(shù)生長期細(xì)胞，0.05%胰蛋白酶消化，PBS洗滌兩次后離心棄上清，加入含全酶抑制劑和PMSF的RIPA裂解液冰浴裂解提取總蛋白。BCA法測定樣品蛋白濃度，完成十二磺基硫酸鈉/聚丙烯酸胺凝膠電泳和蛋白轉(zhuǎn)膜操作，膜片分別與一抗（抗MMP_2多克隆抗體、抗MMP_9多克隆抗體、抗TIMP_1多克隆抗體）進(jìn)行抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，再與辣根酶標(biāo)記二抗反應(yīng)，經(jīng)適當(dāng)洗滌，膜片與ECL溫浴1min，保鮮膜包裹后，經(jīng)X光片曝光，顯影和定影，最后對結(jié)果進(jìn)行光密度掃描分析。

1.6RNA的提取及RT_PCR檢測m_RNA表達(dá)：以Trizol提取細(xì)胞總RNA，按照試劑盒要求操作。MMP_2上游引物序列：5’_GCGACAAGAAGTATGGCTTC_3’，下游引物序列：5’_TGCCAAGGTCAATGTCAGGA_3’；MMP_9上游引物序列：5’_CGCAGACATCGTCATCCAGT_3’，下游引物序列：5’_GGATTGGCCTTGGAAGATGA_3’；TIMP_1上游引物序列：5’_CAATTCCGACCTCGTCATCA_3’，下游引物序列：5’_TCAGAGCCTTGGAGGAGCT_3’，按實驗室常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液2μl作為模板，加入2μl上游及下游引物和2μl Taq酶后用PCR儀擴(kuò)增。循環(huán)步驟如下：變性94℃ 1min，58℃ 1min和72℃ 1min共35個循環(huán)；末次長7min，終止反應(yīng)。以β_actin為內(nèi)參，依據(jù)2_ΔΔCT法計算各組細(xì)胞mRNA的相對表達(dá)量。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理：以SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計，計量資料用（x-±s）表達(dá)，組間比較采用t檢驗分析，P

2結(jié)果

2.1MTT法檢測TGF_β對VSMCs細(xì)胞的增殖作用：見圖1。MTT法檢測結(jié)果如圖所示：SHR和WKY組VSMCs，TGF_β刺激組細(xì)胞增殖水平均顯著高于對照組和TGF_β+阿齊沙坦給藥組（P0.05）。另外，SHR組VSMCs細(xì)胞增殖水平均顯著高于相同干預(yù)的WKY（#P

圖1各組大鼠VSMCs細(xì)胞增殖水平的比較

2.2阿齊沙坦對TGF_β誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞遷移的影響：見圖2。與WKY組相比，SHR組細(xì)胞遷移數(shù)目明顯增多（#P

圖2阿齊沙坦對TGF_β誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞遷移的影響2.3各組VSMCs中MMP_2、MMP_9、TIMP_1蛋白水平比較：Western blot檢測結(jié)果如圖3所示：SHR和WKY組VSMCs，TGF_β刺激組MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表達(dá)水平均高于對照組和TGF_β+阿齊沙坦給藥組（P0.05）。各組SHR大鼠VSMCs中MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表達(dá)水平均顯著高于相同干預(yù)的WKY大鼠（P

圖3MMP_2、MMP_9和TIMP_1在各組細(xì)胞中的蛋白的表達(dá)

2.4各組VSMCs中MMP_2、MMP_9、TIMP_1 mRNA水平比較：RT_PCR檢測結(jié)果見圖4。SHR和WKY組VSMCs，TGF_β刺激組MMP_2、MMP_9和TIMP_1 mRNA表達(dá)水平均高于TGF_β+阿齊沙坦給藥組（*P

大一學(xué)習(xí)計劃書范文4

【摘要】 ［目的］探討懷牛膝總皂苷（ABS）大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的影響，闡明其抗動脈粥樣硬化的機(jī)制。［方法］采用oxLDL誘導(dǎo)大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞增殖的方法，采用MTT法測定VSMC增殖，采用傷口愈合法測定VSMC遷移能力，觀察ABS對oxLDL誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的影響。［結(jié)果］oxLDL濃度為30mg/L促進(jìn)VSMC增殖最強(qiáng)；ABS（50、100、150mg/L）顯著抑制oxLDL誘導(dǎo)的VSMC增殖，作用呈濃度依賴性；ABS（20mg/L）顯著抑制oxLDL誘導(dǎo)的VSMC遷移。［結(jié)論］ABS能抑制oxLDL誘導(dǎo)的VSMC增殖與遷移，說明其具有抑制血管內(nèi)膜增厚和斑塊形成的作用。

【關(guān)鍵詞】 懷牛膝總皂苷；oxLDL；血管平滑肌細(xì)胞；增殖；遷移

Abstract：［Objective］To investigate the influence of Achyranthes bidentata saponins（ABS）on the proliferation and migration of rats aorta vascular smooth muscle cells，and to elucidate its mechanism of antiatherosclerosis.［Methods］The oxidized low density lipoprotein （oxLDL） was used to induce the proliferation of rats aorta vascular smooth muscle cells（VSMC） and Methyl thiazolyl tetrazolium（MTT） assay was used to determine the growth of them，wound healing assay was used to determine the influence of ABS on the ability to migrate of VSMC.All methods were used to observe the effect of ABS on the proliferation and migration of VSMC induced by oxLDL.［Result］The proliferation of VSMC was at the highest level when the concentration of oxLDL was 30mg/L，and this effect of oxLDL could be significantly inhibited by ABS（50，100，150mg/L） in a concentrationdependent manner;ABS could also inhibit the migration of VSMC induced by oxLDL at 30mg/L.［Conclusion］ABS could inhibit the proliferation and migration of VSMC induced by oxLDL.From these results，it appears that ABS can reduce the thickness of vascular intima and inhibit the development of vascular plaque.

Key words：Achyranthes bidentata saponins; oxLDL;vascular smooth muscle cells; proliferation; migration

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的發(fā)病機(jī)理有許多學(xué)說，但以氧化損傷學(xué)說研究最多［1］。氧化修飾LDL（oxLDL）能促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成及血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，導(dǎo)致動脈粥樣硬化［2］。本研究采用中醫(yī)臨床治療心血管疾病的常用藥物懷牛膝，觀察其對oxLDL誘導(dǎo)的VSMC增殖和遷移的影響，報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

懷牛膝總皂苷（浙江中醫(yī)藥大學(xué)化學(xué)教研室提供），SD大鼠（浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供），人血漿（購自浙江省血液中心），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所），DMEM（美國GIBCOBRL公司），胰蛋白酶（杭州宏博生物工程有限公司Amresco分裝），MTT（華美生物工程公司），二甲基亞砜（浙江杭州雙林化工試劑廠），其余試劑為國產(chǎn)分析純試劑，超速離心機(jī)（日本Hitachi公司），熒光倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司），UV754紫外分光光度儀（上海分析儀器總廠），HEPA CLASS 100型細(xì)胞CO2培養(yǎng)箱（美國THERMO公司），SWCJ1F超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），UR4100型酶標(biāo)儀（美國Dynatech公司）。

1.2 方法

1.2.1 低密度脂蛋白制備、氧化與鑒定

參考郭剛等方法［3］，取人血漿，用序列超速離心法，獲得LDL區(qū)帶（密度范圍為1.019～1.063）。取LDL于試管中加入CuSO4溶液氧化，使Cu2+終濃度為10μmo1/L，37℃分別孵育20h。氧化后的LDL加入終濃度為20μmol/L EDTA，4℃放置2h終止氧化，再以pH 7.4 PBS緩沖液透析24h除去EDTA，PEG 2，0000濃縮到一定體積。通過Lowery法檢測蛋白含量為4.8g/L。制備的oxLDL盡快0.22μm過濾除菌，保存4℃?zhèn)溆茫瑑芍軆?nèi)用完。對氧化后的LDL蘇丹黑預(yù)染，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測oxLDL比LDL遷移速度大。

1.2.2 大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)

參考任立群等方法［4］，雄性SD大鼠處死后，無菌條件下取胸主動脈，去除血管內(nèi)膜和外膜，將中膜以組織塊法培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2孵箱中靜置培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底達(dá)80%時，用0.15%胰酶和0.02%EDTA消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代比例為1∶2，傳代周期為4～5d。選生長良好的第5～10代傳代細(xì)胞用于以下實驗。

1.2.3 確定oxLDL誘導(dǎo)的VSMC生長的最佳濃度

取對數(shù)生長期的細(xì)胞以每孔6000個細(xì)胞接種于96孔板中，每孔200μl，分7組，每組6個孔。用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)一天后，換用無血清DMFM培養(yǎng)，次日各組換用含5%FBS的DMEM并分別處理如下：第1組不加oxLDL；其余各組加oxLDL，終濃度分別為10，20，30，40，50，60 mg/L，24h后加入5mg/ml MTT，每孔20μL，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后取出，加入二甲基亞砜，每孔150μL，振蕩充分溶解結(jié)晶。用酶聯(lián)免疫儀檢測在570nm的吸光度值（OD）值（OD值與細(xì)胞數(shù)正相關(guān)），實驗重復(fù)3次，以每組各孔平均OD值繪制增殖曲線，確定以oxLDL的濃度為30mg/mL促細(xì)胞增殖最佳濃度。

1.2.4 MTT法測定VSMC增殖的反應(yīng)

取對數(shù)生長期的細(xì)胞以每孔6000個細(xì)胞接種于96孔板中，分5組，每組六個孔。用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)一天后換用含5%FBS的DMEM并分別處理如下： 1、空白組；2、oxLDL組：30mg/L oxLDL；3、低劑量組：30mg/L oxLDL+50mg/L ABS；4、中劑量組：30mg/L oxLDL+100mg/L ABS；5、高劑量組：30mg/L oxLDL+150mg/L ABS。24小時后通過MTT法（同上）檢測細(xì)胞增殖情況。測各孔OD值，實驗重復(fù)三次，比較每組平均OD值大小差異。

1.2.5 傷口愈合法測定VSMC遷移能力

參考相關(guān)文獻(xiàn)方法［5］，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以每孔5×104個細(xì)胞接種于24孔板中，每孔1ml，分3組。用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿瓶底80%左右，用200μl槍頭在每個孔中劃出基本相同的寬度，5%DMEM培養(yǎng)并分別如下分組：1、空白組；2、oxLDL組：30mg/L oxLDL；3、給藥組：30mg/L oxLDL+ 20mg/L ABS，拍照記錄，設(shè)為0點，用ipp6.0圖像處理軟件測定劃帶寬度W0，在顯微鏡下分別記錄并測定24h劃帶的寬度，每孔取6處劃帶寬度值求平均值w，計算各個時間段細(xì)胞實際遷移距離即h= （W0w）/2，比較每組平均h值大小差異。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)以表示，由SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 ABS對oxLDL誘導(dǎo)的VSMC增殖的影響

見表1。表1 不同濃度ABS對oxLDL誘導(dǎo)的VSMC增殖的影響（略）

2.2 ABS對oxLDL誘導(dǎo)的VSMC遷移能力的影響

見表2。表2 ABS對oxLDL誘導(dǎo)的VSMC遷移的影響（略）

3 討論

文獻(xiàn)表明，oxLDL在AS形成過程中起著重要作用［2］。一方面oxLDL與清道夫受體結(jié)合，導(dǎo)致VSMC內(nèi)吞oxLDL，繼而產(chǎn)生平滑肌源性泡沫細(xì)胞，而脂質(zhì)在泡沫細(xì)胞中沉積所造成結(jié)果是動脈壁的纖維斑塊和粥樣斑塊。另一方面oxLDL通過促進(jìn)平滑肌細(xì)胞釋放血小板源生長因子（PDGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）等因子，而這些細(xì)胞因子可促進(jìn)VSMC增殖和遷移。［3］結(jié)果造成血管內(nèi)膜增厚、斑塊形成及管腔狹窄等效應(yīng)，從而促進(jìn) AS 的發(fā)生和發(fā)展。本實驗結(jié)果證明ABS能顯著抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖與遷移，表明ABS抑制血管內(nèi)膜增厚和斑塊形成的作用，這為臨床上防治動脈粥樣硬化提供可靠的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

［1］Bediner JA，Heinecke JW.The role of oxidized lipoproteins in atherogenesis.free radic bio Med，1996，20 （5）： 707727.

大一學(xué)習(xí)計劃書范文5

作者：王瑩 杜克莘 施京紅 謝雯

【摘要】 目的：觀察海洛因暴露對小鼠成癮和學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)的磷酸化p38 MAPK（pp38）表達(dá)的影響，探討p38 MAPK細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是否參與了發(fā)育早期海洛因暴露引起子代腦發(fā)育損傷的分子機(jī)制. 方法： 于胚胎鼠齡9～18 d時給孕鼠皮下注射海洛因10 mg/(kg·d)，建立子宮內(nèi)海洛因暴露的小鼠模型. 按出生前處理將小鼠分為海洛因和鹽水組. 蛋白免疫印跡檢測兩組小鼠前額葉皮層、海馬、伏核、杏仁核腦區(qū)pp38的表達(dá)改變. 結(jié)果： 與鹽水組相比，海洛因組小鼠的pp38蛋白表達(dá)在前額葉皮層、海馬、伏核、杏仁核4個腦區(qū)均有明顯增加( P< 0.05). 結(jié)論： 海洛因暴露可引起小鼠前額葉皮層、海馬、伏核、杏仁核腦區(qū)的pp38 MAPK蛋白表達(dá)上調(diào)，提示p38 MAPK信號通路可能參與了海洛因損傷小鼠神經(jīng)發(fā)育的分子機(jī)制.

【關(guān)鍵詞】 海洛因；p38絲裂原活化蛋白激酶；前額葉皮層；海馬；伏核；杏仁核

0引言

近年來，女性濫用者增多，且大多屬于育齡期婦女［1-2］. 研究表明，子宮內(nèi)海洛因暴露不但可引起新生兒宮內(nèi)窘迫和發(fā)育遲緩，還可導(dǎo)致子代成年后長期的認(rèn)知行為缺陷和社會行為障礙［3-4］，但其細(xì)胞、分子機(jī)制未完全闡明. p38是MAPK(mitogenacti vated protein kinase) 超家族的重要成員之一，屬于應(yīng)激活化激酶，p38 MAPK不但與其他信號傳遞途徑共同介導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激誘發(fā)的基因表達(dá)和酶活性的改變，還在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞因子的合成釋放、細(xì)胞骨架重排等機(jī)制中發(fā)揮重要作用［5-6］. 本研究旨在探討p38 MAPK 通路是否參與了海洛因?qū)е潞蟠窠?jīng)、行為異常的機(jī)制.

1材料和方法

1.1材料標(biāo)準(zhǔn)品海洛因（heroin），學(xué)名二乙酰嗎啡，純度98.5%，由中國藥品生物制品檢定所（國家麻醉品實驗室）提供，批號171206-200614. 兔抗鼠磷酸化p38 MAPK mAb，山羊抗βactin pAb （美國Cell Signalling 公司）；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗兔或山羊二抗（博奧森公司）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、PVDF 膜及Hyperfilm 膠片（德國Merck 公司）；蛋白質(zhì)提取及濃度測定試劑盒（美國BioRad 公司）. FS600超聲波粉碎儀(上海生析超聲儀器有限公司)；離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；電泳儀（德國Whatman Biometra公司）；紫外成像掃描儀及分析系統(tǒng)（美國BioRad公司）.

1.2方法

1.2.1動物分組及模型建立選健康活潑BALB/c 小鼠60只(第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心)，雌雄各半，2 mo齡，體質(zhì)量(25±5)g. 自由飲食飲水，晝夜12 h交替光照，室溫25℃，濕度60% 左右. 每日21∶00 雌雄合籠，次日晨查精栓或陰道涂片，以精栓或陰道涂片查到做為受精標(biāo)志，記為E0d. 將體質(zhì)量相近的實驗動物隨機(jī)分為海洛因組和鹽水組. 從E0～E8 各組動物自由進(jìn)食， E9～E18 d，鹽水組于21∶00在小鼠大腿外側(cè)皮下注射生理鹽水20 mL/（kg·d），1/d，海洛因組組給予海洛因10 mg/（kg·d） 注射，1/d，將藥物溶于生理鹽水中，0.5 g/L. 子代分組同親代孕鼠.

1.2.2蛋白印跡實驗仔鼠30 d齡時在各腦區(qū)取材，0.16 mol/L戊巴比妥鈉腹腔麻醉，速斷頭、開顱、分離各腦區(qū)，即刻入液氮，凍存管分裝，-80℃貯存. 用時加入4℃胞質(zhì)蛋白提取液裂解，20∶1 加入蛋白酶抑制劑PMSF，高速分散器組織勻漿，冰浴1 h，12000 g 4℃離心10 min，沉淀加入4℃預(yù)冷核蛋白提取液，震蕩混勻，冰浴1 h，再12000 g 4℃離心30 min，取上清為核蛋白，其蛋白濃度經(jīng)考馬斯亮藍(lán)法定量，取上清加等體積2×SDS 樣品緩沖液，煮沸5 min 使蛋白變性. 取50 μg待測蛋白加入等體積2×上樣緩沖液煮沸5 min，行SDSPAGE 電泳，蛋白半干轉(zhuǎn)至PVDF膜. 100 V 恒壓轉(zhuǎn)移2 h后，將PVDF 膜在含5%脫脂奶粉的TBST中室溫下封閉1 h，與1∶1000一抗pp38 MAPK 兔多抗4℃孵育過夜，PBST 緩沖液洗膜3次，每次10 min；隨后加入羊抗兔 IgGHRP 37℃孵育1 h，洗膜3次，每次10 min. ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影，膠片曝光，UVP 凝膠成像系統(tǒng)掃描目的條帶，Labworks 軟件測量各陽性條帶的光密度，將pp38 MAPK陽性條帶與相應(yīng)的βactin 條帶吸光度比值作為其蛋白的相對表達(dá)量.

統(tǒng)計學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)均采用SPSS12.0進(jìn)行處理，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析.

2結(jié)果

分析各組間相應(yīng)蛋白帶的平均吸光度值，以βactin作內(nèi)參蛋白，調(diào)整后進(jìn)行半定量分析. 與鹽水組相比，海洛因組動物的前額葉皮層、海馬、伏核和杏仁核4個腦區(qū)組織的p38 MAPK磷酸化蛋白表達(dá)均明顯增加（P< 0.05，圖1，2）.

3討論

MAPK信號系統(tǒng)作為真核細(xì)胞內(nèi)各種信息傳遞的最后通路和共同通路，能夠?qū)⒓?xì)胞外的各種刺激信息轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，是神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生一系列可塑性變化的分子基礎(chǔ). p38 MAPK 多見于促炎和促凋亡的途徑中，它在細(xì)胞分化、凋亡、遷移和增殖等基本生理過程中也發(fā)揮著不可忽視的作用［5］，許多細(xì)胞外刺激如應(yīng)激刺激、炎性細(xì)胞因子、細(xì)胞因子、脂多糖、生長因子等通過細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活p38 MAPK，進(jìn)而磷酸化激活 MAPK APkinase2 等，并最終激活A(yù)TF2，Max 和MEF2 等轉(zhuǎn)錄因子而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)［6］，但其具體調(diào)制及與其他信號通路之間的關(guān)系尚未明了.

海洛因暴露導(dǎo)致的行為異常與海洛因作用的時間、時程、劑量和給藥方式等有密切關(guān)系，作用方式不同可導(dǎo)致的行為學(xué)損傷不完全相同. 我們采用的模型已報道動物有成年后迷宮學(xué)習(xí)記憶行為缺陷［7］，海馬膽堿能系統(tǒng)及PKC 細(xì)胞學(xué)定位的改變［8］. 海洛因可迅速通過胎盤和血腦屏障，直接作用于發(fā)育中的神經(jīng)細(xì)胞，導(dǎo)致子代成年后的神經(jīng)行為損傷，但其細(xì)胞、分子機(jī)制未完全闡明. 我們的結(jié)果顯示，發(fā)育早期海洛因暴露，上調(diào)了小鼠前額葉皮層，海馬，伏核，杏仁核腦區(qū)中p38 MAPK 磷酸化蛋白的表達(dá)，提示在這些與成癮和學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的腦區(qū)里，存在著p38 MAPK 信號通路可能參與的生理病理學(xué)過程的改變，提示海洛因?qū)ψ哟鷦游锍赡旰笊窠?jīng)行為異常的長期影響，至少是部分源于海洛因在動物的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育早期，作用于神經(jīng)行為相關(guān)的靶區(qū)，使該靶區(qū)的神經(jīng)活動異常或作用于相關(guān)基因，使海洛因的致畸作用持續(xù)到生后，如海馬損傷導(dǎo)致海馬依賴的空間學(xué)習(xí)記憶損傷.

p38 MAPK在疾病發(fā)展的不同階段，發(fā)揮的作用有所不同. 在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)或炎癥反應(yīng)的早期，p38 上調(diào)發(fā)揮腦保護(hù)作用，但隨著反應(yīng)進(jìn)程的加深，上調(diào)的p38 可以通過加強(qiáng)細(xì)胞的炎性反應(yīng)，介導(dǎo)其他胞外信號引起的炎性細(xì)胞因子或炎性產(chǎn)物的表達(dá)和釋放，以介導(dǎo)凋亡性細(xì)胞死亡的方式損傷神經(jīng)細(xì)胞［6， 9］. p38 蛋白在成癮和學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)的持續(xù)表達(dá)上調(diào)，是損傷神經(jīng)發(fā)育，或是激發(fā)了損傷后的神經(jīng)代償機(jī)制，需要進(jìn)一步研究.

我們結(jié)果的提示，p38 MAPK 通路可能參與了海洛因?qū)ε咛ツX發(fā)育的毒性作用，進(jìn)而影響動物成年后的行為，為進(jìn)一步探討子代神經(jīng)行為的損傷機(jī)制及后期臨床干預(yù)中靶蛋白的確定提供了有意義的資料.

【參考文獻(xiàn)】

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大一學(xué)習(xí)計劃書范文6

[關(guān)鍵詞] Notch信號通路；γ-分泌酶抑制劑；血管平滑肌細(xì)胞；雙向電泳

[中圖分類號] R587.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）02（c）-0024-04

糖尿病足（DF）是糖尿病（DM）的慢性并發(fā)癥之一，是高血糖、周圍血管病變、周圍神經(jīng)病變等多種因素共同所致，病因復(fù)雜，致殘、致死率高，治療費(fèi)用高。目前針對DF及微血管病變的治療效果難以令人滿意。Notch信號通路具有促進(jìn)非DM動物缺血區(qū)血管新生、動靜脈分化等作用。本課題通過γ-分泌酶抑制劑（DAPT）干預(yù)體外培養(yǎng)的DM大鼠血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs），研究對Notch信號通路中Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

凍存的DM大鼠VSMCs（SPF級SD大鼠購自大連醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，質(zhì)量合格證號：0003546，經(jīng)DM大鼠模型建立、取材后凍存）[1]。

1.2 主要試劑和儀器

DAPT（美國Sellect公司）；全自動凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)（日本Olympus公司）；Mini-Protean 3電泳系統(tǒng)、Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（北航圖像中心）；蛋白濃度測定試劑、β-actin（美國Sigma公司）；兔抗Notch1單克隆抗體、兔抗Notch3單克隆抗體、兔抗Notch4單克隆抗體、倉鼠抗大鼠Jagged-1蛋白（JAG1）慰寺】固濉⒉質(zhì)罌勾笫Jagged-2蛋白（JAG2）單克隆抗體、倉鼠抗大鼠DLL4蛋白單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；Bio-Lyte載體兩性電解質(zhì)、IEF電泳槽、IPG預(yù)制膠條（美國BioRad公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

取凍存的DM大鼠VSMCs進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇，將其接種于96孔板，D-Hank′s液沖洗2遍，加入0.25%TRYPSIN+0.02% EDTA?4Na約3 mL進(jìn)行消化，制成單細(xì)胞懸液。按1∶2傳代培養(yǎng)，傳至3代后，隨機(jī)分為兩組：正常培養(yǎng)基（con）組和加入DAPT的培養(yǎng)基（實驗）組（濃度梯度分別為0.15、1.25、7.50 μmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)傳至6代。

1.4 方法

1.4.1 蛋白提取 取配置好的單細(xì)胞懸液，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液400 mL，冰浴靜置40 min，提取蛋白。

1.4.2 雙向電泳檢測目標(biāo)蛋白 在198 mm×256 mm×1 mm SDS凝膠上，標(biāo)記縱橫坐標(biāo)，將目的蛋白加入坐標(biāo)原點，進(jìn)行第一向等電聚焦電泳，聚焦結(jié)束后的膠條經(jīng)平衡處理后立即進(jìn)行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后，取出凝膠，拍照，應(yīng)用計算機(jī)軟件分析處理。取提取的蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，計算上樣量。煮沸，變性，標(biāo)記，上樣檢測或于-80℃保存。

1.4.3 Western blot 檢測蛋白表達(dá)情況 取30 μg蛋白，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入抗Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4單克隆抗體（1∶200），4℃孵育過夜，加入二抗IgG（1∶5000稀釋），室溫孵育1 h，ECL試劑盒顯影，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，以對照組為參照樣本，計算Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4蛋白的相對表達(dá)水平。實驗重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雙向電泳檢測結(jié)果

DM大鼠VSMCs蛋白雙向電泳檢測結(jié)果顯示，在凝膠上可以看到800多個蛋白點，其中大多數(shù)蛋白位于pH 5.0～8.5，分子量為134～300 kD。應(yīng)用計算機(jī)軟件Image-Master 2D Platinum software分析，其中“十字”表示計算機(jī)探測到的凝膠分離出的蛋白質(zhì)點，“標(biāo)簽”表示經(jīng)過計算機(jī)軟件自動編號后的目標(biāo)蛋白點，說明提取的蛋白質(zhì)中含有實驗所需目的蛋白。見圖1。

2.2 Western blot檢測結(jié)果

Western blot檢測結(jié)果顯示：隨DAPT濃度的增加，Nocth1、Nocth3、Nocth4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4各蛋白表達(dá)水平遞減；7.50 μmol/L組與con組相比，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），0.15、1.25 μmol/L組與con組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；0.15、1.25 μmol/L組與7.50 μmol/L組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；0.15 μmol/L組和1.25 μmol/L組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖2～3。

3 討論

DM已成為世界性疾病[2]，根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）的2015全球DM版圖[3]，目前世界成年DM患者約4.15億人，中國目前為1.096億人，且處于不斷增加中。據(jù)統(tǒng)計，15%～25%的DM患者一生中會發(fā)生DF[4]，而DM患者的截肢率與非DM患者相比要高40倍[5]，且截肢預(yù)后較差。據(jù)統(tǒng)計[6]截肢后5年死亡率達(dá)40%。

在DM血管病變過程中，VSMCs從中膜移行到內(nèi)膜，增殖、分泌生長因子，參與纖維膜的形成，VSMCs還分泌合成許多基質(zhì)分子參與血管病變的發(fā)生[7-8]。因此可見，VSMCs在DM血管病變的進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要作用。

目前針對DM血管病變的治療主要以內(nèi)科藥物保守治療、腔內(nèi)介入手術(shù)[9]、旁路移植手術(shù)[10]為主，但效果均欠佳，近年來開展的細(xì)胞因子治療[11]用于誘導(dǎo)和促進(jìn)DM血管缺血區(qū)血管再生的探索取得一定效果，但也存在一定不足。因此，尋求新的方式以促進(jìn)更多血管生成是非常有必要的。

有研究證實，Notch信號通路能促進(jìn)非DM動脈缺血區(qū)的血管新生[12-14]，在血管發(fā)育的過程中發(fā)揮重要的作用。在Notch信號通路的受體和配體中，Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4在血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)[15]。Notch1、Notch3、Notch4受體分別主要由Jagged-1、Jagged-2、DLL4配體啟動[16-17]。Qiao等[18]、Zela等[19]證實Notch信號通路對體外培養(yǎng)正常大鼠血管VSMCs的增殖、分化、凋亡等具有重要的調(diào)控作用，進(jìn)而促進(jìn)血管新生。但是Notch信號通路是否對DM動脈缺血區(qū)具有相同的作用尚未清楚。DAPT是Notch信號通路的抑制劑，可特異性抑制γ-分泌酶活性，進(jìn)而抑制Notch受體在S3位點的酶切，有效抑制Notch信號通路的激活[20]。

本課題組既往實驗經(jīng)流式細(xì)胞學(xué)檢測證實，體外培養(yǎng)的DM大鼠VSMCs經(jīng)DAPT作用72 h，對其細(xì)胞的抑制率較其余各時間段明顯，且當(dāng)DAPT濃度在0.25、1.25、7.50 μmol/L時，其半抑制率最為明顯[1]，所以本實驗選用以上3個濃度的DAPT作用72 h后行相關(guān)檢查。實驗結(jié)果顯示：各實驗組與con組提取Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4蛋白后行雙向電泳及Western blot檢測證實DAPT可以抑制Notch信號通路的活動，抑制Notch相關(guān)蛋白的表達(dá)。雙向電泳圖譜經(jīng)計算機(jī)軟件分析表明提取蛋白中含有目的蛋白。Western blot檢查結(jié)果顯示：隨DAPT濃度的增加，各蛋白的表達(dá)均遞減，說明DAPT干預(yù)Notch信號通路能抑制DM大鼠Notch信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)；其中，當(dāng)DAPT濃度在7.50 μmol/L時，對Notch信號通路各蛋白表達(dá)的抑制作用最明顯；當(dāng)DAPT濃度在0.15～1.25 μmol/L之間時，干預(yù)Notch信號通路后對相關(guān)蛋白的抑制作用無明顯差異；當(dāng)DAPT濃度在1.25～7.50 μmol/L之間時，隨著濃度的升高，DAPT對Notch信號通路的抑制作用逐漸增強(qiáng)，呈劑量依賴型。從結(jié)果中可看出，Nocth1、Nocth3、Nocth4蛋白分別與Jagged-1、Jagged-2、DLL4蛋白降低的幅度相似，證實了Notch1、Notch3、Notch4受體分別主要由Jagged-1、 Jagged-2、DLL4配體啟動這一理論。本實驗結(jié)果提示：Nocth1、Nocth3、Nocth4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4各蛋白在體外正常條件下培養(yǎng)的DM大鼠VSMCs中均有所表達(dá)；且DAPT能不同程度阻斷DM大鼠VSMCs Notch信號通路的活性，抑制Notch信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，且該抑制作用在一定濃度范圍內(nèi)（1.25～7.50 μmol/L）呈正相關(guān)。結(jié)合本課題前期實驗證實DAPT干預(yù)Notch信號通路后可抑制DM大鼠VSMCs的增殖、促進(jìn)凋亡等，提示Notch信號通路與DM大鼠VSMCs的增殖、凋亡等有關(guān)。此項研究提示，促進(jìn)Notch信號通路的表達(dá)或許可以促進(jìn)DM患者缺血區(qū)VSMCs的增殖，促進(jìn)更多新生血管的再生，但目前對Notch信號通路在DM患者中的具體機(jī)制還存在許多亟需解決的問題。

總之，DAPT干預(yù)DM大鼠VSMCs后能抑制Notch信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制Notch信號通路的活性，證明Notch信號通路在DM大鼠血管再生中起著重要作用，而進(jìn)一步研究Notch信號通路在DM大鼠中的作用C制或許為治療DM患者缺血區(qū)血管新生提供一種新的可能。

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