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熱力學(xué)在生命科學(xué)中的應(yīng)用范文1

1．1光譜法研究含氟卟啉-蒽醌化合物與DNA相互作用卟啉類化合物具有較強(qiáng)的吸光和發(fā)光性能，是一種良好的大環(huán)芳香系光敏劑，蒽醌類化合物具有良好的DNA光斷裂特性，它們易于插入DNA堿基對之間，以不同的作用機(jī)理使DNA斷裂。含氟化合物具有強(qiáng)的生理活性，它有可能和生物組織相互作用而顯示出抗腫瘤作用。黃岡師范學(xué)院的趙勝芳等［4］采用微波輻射合成了以二肽鍵聯(lián)的含氟卟啉-蒽醌化合物及其金屬鋅配合物。用紫外可見光譜法和熒光光譜滴定法考察了兩種合成的目標(biāo)化合物與質(zhì)粒DNA的相互作用，探討了它們與DNA的作用模式。即卟啉-二肽-蒽醌化合物與DNA發(fā)生自堆積的外部鍵合。該研究將在生命科學(xué)、醫(yī)藥學(xué)、配位化學(xué)的研究中得到廣泛應(yīng)用。

1．2基于DNA自組裝無酶循環(huán)放大猝滅化學(xué)發(fā)光法檢測核酸G-四鏈體DNA酶是一類具有催化功能的核酸分子，由于富含G的核酸分子可以在血紅素存在下，形成G-四鏈體的結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出類似于辣根過氧化物酶的活性，可以催化H2O2氧化魯米諾產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。基于目標(biāo)催化DNA自組裝，廣西師范大學(xué)的褚志丹等［5］基于G-四鏈體是富含鳥嘌呤堿基的DNA序列形成的一種特殊的DNA二級結(jié)構(gòu)，當(dāng)其與血紅素結(jié)合后，可顯示較強(qiáng)的過氧化物酶催化活性的事實(shí)，利用DNA自組裝、G-四鏈體的催化化學(xué)發(fā)光性能，構(gòu)建了一種無酶循環(huán)放大猝滅化學(xué)發(fā)光生物傳感新體系，用于DNA檢測。該傳感系簡單、低耗、靈敏。該研究將在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)及生物學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用。

1．3基于DNA鏈置換酶輔助信號(hào)放大G-四鏈體脫氧核酶DNAzyme催化化學(xué)發(fā)光檢測腺苷腺苷在各種生物組織和器官功能的生理活性調(diào)節(jié)中起著重要的作用。因此檢測生物體中腺苷含量意義重大。化學(xué)發(fā)光檢測具有靈敏度高、線性范圍寬、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)。廣西師范大學(xué)的李梅等［6］利用富含G堿基的DNA在血紅素和K+存在下，形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)并表現(xiàn)出過氧化物酶活性的特點(diǎn)，結(jié)合DNA鏈置換反應(yīng)和核酸內(nèi)切酶的置換反應(yīng)，構(gòu)建了一種基于DNA鏈體脫氧核酶DNA鏈置換反應(yīng)和核酸內(nèi)切酶輔助信號(hào)放大的G-四鏈體脫氧核酶(DNAzyme)的催化發(fā)光檢測腺苷的新方法。該方法靈敏度高、選擇性好、檢測限量為0．5μmol/L，用于人血清中腺苷的檢測效果良好。

1．4南海紅樹林真菌Fusariumsp．301次級代謝產(chǎn)物研究紅樹林生態(tài)系統(tǒng)是一種分布在熱帶、亞熱帶潮間帶具有海洋環(huán)境特有森林類型的木本植物群落，其特殊環(huán)境孕育出的紅樹林內(nèi)生真菌是此生態(tài)系統(tǒng)的主要降解者，也是海洋真菌的第二大生態(tài)群落［7］。從1994年至今，國內(nèi)外對海洋真菌次級代謝產(chǎn)物的研究表明，紅樹林內(nèi)生真菌的次級代謝中含有極其豐富的結(jié)構(gòu)新穎且在抗腫瘤、抗氧化、抗真菌、細(xì)菌等藥理方面表現(xiàn)出良好活性的化合物。海洋真菌活性代謝產(chǎn)物已經(jīng)成為重要的新型藥物來源之一。為了尋找結(jié)構(gòu)新穎且具有藥理活性的海洋真菌次級代謝產(chǎn)物，中山大學(xué)的方平等［8］對一株采自海口桐花樹的紅樹林內(nèi)生菌Fusariumsp．301次級代謝產(chǎn)物，根據(jù)化合物的理化性質(zhì)、采用正反相硅膠、凝膠柱層析法和高效液相色譜法對其次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，通過波譜解析以及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對照的方法，分離得到并確定了5個(gè)鏈紅菌素類化合物的結(jié)構(gòu)。該研究將在生命科學(xué)、生物學(xué)及醫(yī)藥學(xué)中得到廣泛應(yīng)用。

1．5鹽酸氨溴索的電化學(xué)氧化作用鹽酸氨溴索(AMB)，trans-4-［(2-氨基-3，5-二溴芐基)氨基］環(huán)己醇鹽酸鹽，是治療呼吸系統(tǒng)疾病的一種特效藥物。它對活性自由基(ROS)有不同的清除能力，對羥基自由基(HO•)的清除能力強(qiáng)，對超氧陰離子(O2－)弱，對過氧化氫(H2O2)很少或沒有作用。因此研究AMB的氧化作用和過程對了解AMB的生化過程很有意義。為此西北大學(xué)的孫杰娟等［9］在酸性水溶液中，研究了鹽酸氨溴索(AMB)的伏安行為，參照取代苯胺的伏安特性，說明了AMB的氧化機(jī)理。該研究將在生命科學(xué)、醫(yī)藥學(xué)的研究中得到應(yīng)用。

2現(xiàn)代有機(jī)及生物分析在有機(jī)物分析分離科學(xué)中的應(yīng)用

2．1殼聚糖衍生化杯［4］芳烴鍵合硅膠固定相對八種單取代苯的分離及分析殼聚糖大分子中有活潑的羥基和氨基，具有較強(qiáng)的化學(xué)反應(yīng)能力和生物相容性;杯芳烴的孔腔大小可調(diào)，構(gòu)象和取代基可以人為控制。鄭州大學(xué)的盧靜等［10］利用二者的優(yōu)點(diǎn)將其結(jié)合制備了一種新型固定相并對八種單取代苯進(jìn)行了分離分析研究。他們的做法是采用自制殼聚糖衍生化杯［4］芳烴鍵合硅膠固定相(CBS4)，對8種單取代苯(苯胺、苯甲醛、苯酚、甲苯、氯苯、溴苯、碘苯、丁苯)進(jìn)行了分離、熱力學(xué)、疏水作用的研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，8種單取代苯在CBS4上分離時(shí)間短，分離效果好，符合反相色譜機(jī)理;分析物的保留時(shí)間會(huì)隨柱溫的增加而減小;疏水作用在分離單取代苯時(shí)起著重要作用。該研究將在分析分離科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、生物學(xué)中得到應(yīng)用。

2．2Cu2+-羧甲司坦絡(luò)合物的光譜特征及其應(yīng)用羧甲司坦為一種黏痰調(diào)節(jié)劑，用于治療支氣管炎、支氣管哮喘等疾病引起的痰液黏稠，咳出困難者，但用量過大會(huì)有醫(yī)療副作用。為此廣西大學(xué)的林瑜等［11］根據(jù)羧甲司坦分子結(jié)構(gòu)特征，推測其分子應(yīng)該具有與金屬離子絡(luò)合的條件。通過紫外可見分光光度法考察了羧甲司坦與各種金屬離子絡(luò)合的可能性。他們的研究發(fā)現(xiàn)，羧甲司坦與Cu2+可以形成穩(wěn)定絡(luò)合物，該絡(luò)合物在237nm處有一個(gè)最大特征吸收峰。確定了絡(luò)合物的絡(luò)合比羧甲司坦Cu2+為2∶1，絡(luò)合物穩(wěn)定常數(shù)為4．98×109，在237nm處絡(luò)合物的摩爾吸光系數(shù)最大為4．74×103L/(mol•cm)建立了基于Cu2+絡(luò)合的紫外分光光度法定量測定羧甲司坦的新方法。該方法簡單、快速、靈敏、準(zhǔn)確，且成功的應(yīng)用于藥廠的產(chǎn)品分析，結(jié)果與標(biāo)量相符合。

3結(jié)束語

熱力學(xué)在生命科學(xué)中的應(yīng)用范文2

關(guān)鍵詞：原子力顯微鏡 探針 RNA聚合酶 分子間相互作用

一、原子力顯微鏡（AFM）簡介

原子力顯微鏡（AFM）有兩種類型：接觸式和非接觸式，分別基于排斥作用和吸引作用。原子力顯微鏡（AFM）試驗(yàn)中，探針尖端近似為顯微球，則針尖與樣品表面間的作用力為：F（Z）=2πR0B/3Z3其中Z為針尖與樣品之間的距離，R0為近似顯微球針尖的半徑，B為一個(gè)與物體介電常數(shù)有特殊關(guān)系的常量。原子力顯微鏡（AFM）探針安裝在一個(gè)靈活的懸臂上，激光二極管發(fā)出的一束激光經(jīng)懸臂反射后，打在一個(gè)分裂式光電二極管上，當(dāng)探針在樣品表面掃描時(shí)，由于樣品表面原子結(jié)構(gòu)起伏不平，懸臂也就隨之起伏，于是激光束的反射也就起伏。光電二極管將其接收、放大，即可獲得樣品表面凹凸信息的原子結(jié)構(gòu)圖像。原子量級的表面形態(tài)記錄是原子力顯微鏡（AFM）特有的性能。

二、原子力顯微鏡（AFM）的技術(shù)特點(diǎn)

原子力顯微鏡（AFM）本身的優(yōu)勢是其在生物學(xué)中得以迅速發(fā)展的主要原因。首先，原子力顯微鏡（AFM）技術(shù)的樣品制備簡單，無需對樣品進(jìn)行特殊處理，因此，其破壞性較其它生物學(xué)常用技術(shù)（如電子顯微鏡）要小得多；第二，原子力顯微鏡（AFM）能在多種環(huán)境（包括空氣、液體和真空）中運(yùn)作，生物分子可在生理?xiàng)l件下直接成像，也可對活細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察；第三，原子力顯微鏡（AFM）能提供生物分子和生物表面的分子/亞分子分辨率的三維圖像；第四，原子力顯微鏡（AFM）能以納米尺度的分辨率觀察局部的電荷密度和物理特性，測量分子間（如受體和配體）的相互作用力；第五，原子力顯微鏡（AFM）能對單個(gè)生物分子進(jìn)行操縱；另外，由原子力顯微鏡（AFM）獲得的信息還能與其它的分析技術(shù)和顯微鏡技術(shù)互補(bǔ)。

原子力顯微鏡（AFM）還具有對標(biāo)本的分子或原子進(jìn)行加工的能力，例如，可搬移原子，切割染色體，在細(xì)胞膜上打孔等等。綜上所述，原子級的高分辨率、觀察活的生命樣品和加工樣品的力行為成就了原子力顯微鏡的三大特點(diǎn)。

三、使用原子力顯微鏡（AFM）研究生化過程

原子力顯微鏡（AFM）能對轉(zhuǎn)錄的過程進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察，在加入核苷酸后，沉積到云母上的延長復(fù)合物沿著DNA模板單向移動(dòng)。兩個(gè)對照實(shí)驗(yàn)證實(shí)RNAP與DNA的相對移動(dòng)與轉(zhuǎn)錄的實(shí)際情況相符。通過PAGE對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果顯示與云母結(jié)合的復(fù)合物具有活性，而且轉(zhuǎn)錄的速度與用原子力顯微鏡（AFM）測得的近似生物分子的構(gòu)象改變也是原子力顯微鏡（AFM）的重要觀察內(nèi)容。將尿素酶沉積到云母上并用原子力顯微鏡（AFM）掃描，在液池中加入尿素后發(fā)現(xiàn)，懸臂的垂直波動(dòng)明顯增加，這提示由酶活動(dòng)引起的構(gòu)象改變能直接通過原子力顯微鏡（AFM）記錄下來。

原子力顯微鏡（AFM）在研究分子識(shí)別中的應(yīng)用分子間的相互作用在生物學(xué)領(lǐng)域中相當(dāng)普遍，例如受體和配體的結(jié)合，抗原和抗體的結(jié)合，信息傳遞分子間的結(jié)合等，是生物體中信息傳遞的基礎(chǔ)。原子力顯微鏡（AFM）可作為一種力傳感器來研究分子間的相互作用。生物素（biotin）和抗生物素蛋白鏈菌素（streptavidin）間有高親和力，其相互作用的熱力學(xué)數(shù)據(jù)也較為清楚。因而，生物素和抗生物素蛋白鏈菌素是原子力顯微鏡（AFM）測定特異相互作用力的良好典型。

原子力顯微鏡（AFM）在物質(zhì)超微結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用： 原子力顯微鏡（AFM）可以直接觀察到表面缺陷、表面重構(gòu)、 表面吸附體的形態(tài)和位置、以及有表面吸附體引起的表面重構(gòu)等。原子力顯微鏡（AFM）可以觀察許多不同材料的原子級平坦結(jié)構(gòu)，例如，可以用原子力顯微鏡（AFM）對DL-亮氨酸晶體進(jìn)行研究，可觀察到表面晶體分子的有序排列，其晶格間距與X射線衍射數(shù)據(jù)相符。已有文獻(xiàn)報(bào)道了關(guān)于采用原子力顯微鏡（AFM）對APA薄膜的表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究的內(nèi)容，發(fā)現(xiàn)了APA表面的特殊結(jié)構(gòu)，從而揭示了APA表面超微結(jié)構(gòu)對半滲透性的重要意義。目前，利用原子力顯微鏡（AFM）已獲得了DNA、透析薄膜、烷烴分子、脂肪酸薄膜以及多糖等的超微結(jié)構(gòu)的圖象。

四、原子力顯微鏡（AFM）在細(xì)胞檢測的應(yīng)用

應(yīng)用原子力顯微鏡（AFM）可研究活細(xì)胞或固定細(xì)胞如紅細(xì)胞、白細(xì)胞、細(xì)菌、血小板、心肌細(xì)胞、活腎上皮細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的動(dòng)態(tài)行為。原子力顯微鏡（AFM）對體外動(dòng)態(tài)細(xì)胞的分析具有非凡的能力。這些研究大都把樣品直接放置在玻片上，不需要染色和固定，樣品制備和操作環(huán)境相當(dāng)簡單。用免疫膠體金標(biāo)記細(xì)胞膜則打開了細(xì)胞表面抗原高分辨定位之門。原子力顯微鏡（AFM）細(xì)胞成像如：用原子力顯微鏡（AFM）研究活腎上皮細(xì)胞，可在漿膜小斑上以50nm的分辨率觀察細(xì)胞骨架元素、漿膜淺凹和膜結(jié)合絲。用原子力顯微鏡（AFM）觀察血小板的運(yùn)動(dòng)，可看到微絲結(jié)構(gòu)、顆粒傳輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)外側(cè)及活化中細(xì)胞成份的再分配。游走上皮細(xì)胞的漿膜可用原子力顯微鏡（AFM）實(shí)時(shí)成像。

五、應(yīng)用前景

原子力顯微鏡（AFM）現(xiàn)已成為一種獲得樣品表面結(jié)構(gòu)高分辨率圖像的有力工具。而更為吸引人的是其觀察生化反應(yīng)過程及生物分子構(gòu)象變化的能力。因此，原子力顯微鏡（AFM）在生物學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用前景毋庸置疑。而對于原子力顯微鏡（AFM）技術(shù)本身，以下幾個(gè)方面的進(jìn)展將更加有利于它在生物學(xué)中的應(yīng)用。大多數(shù)生物反應(yīng)過程相當(dāng)快速，原子力顯微鏡（AFM）時(shí)間分辨率的提高有助于這些過程的觀察。高分辨率是原子力顯微鏡的優(yōu)勢。其分辨率在理論上能達(dá)到原子水平，但目前還沒有實(shí)現(xiàn)，如何作出更細(xì)的針尖將有助于其分辨率的進(jìn)一步提高。而隨著樣品制備技術(shù)的完善，原子力顯微鏡（AFM）必將成為生物學(xué)領(lǐng)域中一種常規(guī)的研究工具。

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熱力學(xué)在生命科學(xué)中的應(yīng)用范文3

作為新陳代謝的活性中間體,正常狀態(tài)下自由基在生物體中保持相對穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)平衡。細(xì)胞自身的細(xì)胞色素c(Cytochromec,Cyt.c)、超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase,SOD)等具有抗氧化能力，可以將自由基轉(zhuǎn)化為無害物質(zhì)進(jìn)行自我修復(fù)，這一系列的過程對細(xì)胞增殖、凋亡、損傷具有重要的影響,并在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著十分重要的作用。當(dāng)細(xì)胞受到外界剌激或發(fā)生病變過程中會(huì)產(chǎn)生過量O2'_自由基,使得細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，引起癌癥、神經(jīng)性疾病、帕金森病等生理病變,從而對細(xì)胞的生理和病理功能產(chǎn)生重要的影響。因此,檢測生物體中O〗_自由基的濃度具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

然而，因?yàn)樽杂苫哂醒趸钚愿摺Ⅲw內(nèi)濃度低、壽命短等特點(diǎn),所以需要發(fā)展原位、實(shí)時(shí)、活體的自由基檢測方法。電化學(xué)方法具有操作簡單、易微型化、靈敏度高、易于原位、實(shí)時(shí)、在體檢測等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注,其中，基于酶傳感器的電化學(xué)分析方法最為引人注目。

2溶液/電極界面的設(shè)計(jì)及酶的直接電子傳遞

2.1溶液/電極界面的設(shè)計(jì)

針對自由基的電化學(xué)分析,對溶液/電極界面進(jìn)行設(shè)計(jì)以改善和提高電極的分析性能是一個(gè)極其關(guān)鍵的問題^2?16。酶自身體積較大,而活性中心通常都深埋在其內(nèi)部,從而加大了活性中心到電極表面的電子傳遞距離，不利于實(shí)現(xiàn)直接電子傳遞。第二代酶傳感器采用氧化還原電子媒介體在酶的氧化還原活性中心與電極之間傳遞電子，但存在媒介體的流失和干擾大的缺陷，給O〗_自由基的準(zhǔn)確測定帶來干擾,從而極大限制了其實(shí)際應(yīng)用。第三代酶傳感器的開發(fā)使這個(gè)領(lǐng)域向前邁進(jìn)了一大步。通過界面設(shè)計(jì)優(yōu)化,利用酶的直接電子傳遞機(jī)理克服了原先的不足，能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞或生物體中自由基的直接檢測。界面設(shè)計(jì)優(yōu)化是人為地設(shè)計(jì)電極表面微結(jié)構(gòu)和其界面反應(yīng)，通過將酶固定在電極表面上,使暴露的電活性中心更接近電極表面，實(shí)現(xiàn)酶與電極之間快速的電子傳遞,達(dá)到預(yù)期檢測的目標(biāo)。2.1.1分子設(shè)計(jì)分子自組裝是對固體表面進(jìn)行修飾最為有效的手段之一。高度有序、結(jié)構(gòu)可控、定向密集的穩(wěn)定分子層為保持酶蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)和構(gòu)象提供理想的微環(huán)境。同時(shí)，單分子作為加快電子傳遞的促進(jìn)劑，可以用于探索電極表面分子微結(jié)構(gòu)和宏觀電化學(xué)響應(yīng)之間的關(guān)系。巰基化物在金屬表面自組裝是目前研究得最廣泛、最深入的一類物質(zhì)。其自組裝膜有序性強(qiáng),不易聚合,條件控制容易等優(yōu)點(diǎn)擴(kuò)展其在傳感方面研究和應(yīng)用的范圍。Tian等^在金電極表面自組裝一層巰基半胱氨酸單分子膜來考察溶液中SOD的電化學(xué)活性，同時(shí)以裸金電極作為對比，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)SOD能夠固定于分子修飾電極的表面上,使得電極反應(yīng)更容易實(shí)現(xiàn),這可能由于半胱氨酸在界面自發(fā)形成的一種熱力學(xué)穩(wěn)定分子層，更有利于實(shí)現(xiàn)SOD“軟著陸”。隨后，他們又將3種SOD(Cu,Zn-SOD,Fe-SOD和Mn-SOD)分別固定在巰基半胱氨酸修飾的金電極界面上，首次同時(shí)實(shí)現(xiàn)3種SOD的直接電子傳遞；巰基半胱氨酸作為促進(jìn)劑加快電子的傳遞。通過分子設(shè)計(jì)在界面上自組裝單分子體系考察電子轉(zhuǎn)移過程，為更深層次的分子設(shè)計(jì)和功能組裝反饋信息M。

此外,作為一種常用的選擇性結(jié)合組氨酸標(biāo)記蛋白質(zhì)的方式，次氮基三乙酸/組氨酸（NTA/HT)技術(shù)成為組氨酸結(jié)合最成功的模版。其將蛋白質(zhì)定向有序固定在電極表面上,并加快電子傳遞。Joln_等㈣利用該通用模版技術(shù)成功將蛋白質(zhì)固定在金電極表面上，通過大環(huán)效應(yīng)使NTA衍生物的三氮雜環(huán)與金屬離子穩(wěn)定反應(yīng),使得該體系具有更高的穩(wěn)定性。Wang等^1首次利用NTA/HT技術(shù)將SOD修飾到電極表面上,極大提高了電子傳遞速率，電子傳遞常數(shù)為（24±1.1)S!1;同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了SOD的直接電化學(xué),并進(jìn)一步應(yīng)用于鼠腦在局部缺血和再灌注的過程中自由基濃度變化的檢測。

在簡單的蛋白質(zhì)^分子仿生體系中，分子設(shè)計(jì)在提高傳感器檢測底物的靈敏度、控制活性中心與電極表面距離、加快長程電子轉(zhuǎn)移等電分析化學(xué)的應(yīng)用和理論方面發(fā)揮了重要作用。

2.1.2納米材料利用酶的特異性檢測O2'_自由基時(shí),往往受限于酶負(fù)載量過少或缺乏電子傳遞導(dǎo)體從而致使電信號(hào)過小或者電子傳遞過慢,影響傳感器的整體分析性能。納米材料是材料學(xué)中最基礎(chǔ)、最活躍的組成部分。不同于體材料和單個(gè)分子，納米材料具有小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)和量子尺寸效應(yīng)等獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì),特別是良好的生物相容性和穩(wěn)定性，可作為負(fù)載酶的良好基質(zhì)，在傳感領(lǐng)域獲得廣泛的應(yīng)用。

Brown等M將直徑12nm單層金溶膠顆粒修飾二氧化錫電極,實(shí)現(xiàn)了溶液中Cyt.c的直接、可逆電化學(xué)，且無需任何預(yù)處理步驟。金溶膠顆粒可看作是空間緊密而獨(dú)立的微電極組合體。但隨著納米顆粒的聚集,Cyt.c的電化學(xué)變的準(zhǔn)可逆或者不可逆,表明納米金屬尺寸和形貌在實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的直接電子傳遞中也起到極其關(guān)鍵的作用。Zhu等122首次利用1,5或二硫醇交替連接Au、Ag膠體制備多層Au/Ag膜,在溫和條件下通過氯金酸溶液去除成孔物質(zhì)納米Ag,通過層層自組裝技術(shù)在氧化銦錫（ITO)電極表面制備了納米多孔金膜。Cyt.c保持其生物催化活性，電子轉(zhuǎn)移速率為3.9s!1。同時(shí),該第三代傳感器具有良好的選擇性和穩(wěn)定性,其檢出限達(dá)到6.3x106mol/L,線性范圍是1.0x105~1.2x102mol/L。

Bi等M通過將多壁碳納米管修飾玻碳電極上實(shí)現(xiàn)了SOD的固定。多壁碳納米管表面的晶格缺陷提供了較高的局部電子密度,有利于電子在酶蛋白和碳納米管之間傳遞；同時(shí),特殊結(jié)構(gòu)的碳納米管可以作為“分子導(dǎo)線”，加快電子傳遞到SOD的活性中心，以上兩方面因素致使SOD在電極表面上實(shí)現(xiàn)直接電子傳遞。

Deng等M利用蒸汽方法直接在預(yù)處理ITO表面沉積上一層花狀ZnO納米材料，設(shè)計(jì)出新型納米材料界面,增大了基底的比表面積和導(dǎo)電性。同時(shí)，生物相容性保持了SOD的高生物催化活性，結(jié)合ZnO作為“納米導(dǎo)線”加快電子的傳遞作用，實(shí)現(xiàn)了SOD的直接電子傳遞,構(gòu)筑了第三代生物傳感器，異相電子傳遞常數(shù)可達(dá)（10.4±1.8)s!l。Zhu等123將Cyt.c固定在SiO:納米材料修飾的玻碳電極表面上，實(shí)現(xiàn)了Cyt.c的直接電化學(xué)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)Cyt.c的直接電子傳遞及微環(huán)境的改變與SiOi雙功能結(jié)構(gòu)的空間幾何構(gòu)象有關(guān)。該模型能夠定性的解釋納米材料的尺寸和濃度對氧化還原蛋白的直接電子傳遞的影響，同時(shí)也為廣泛應(yīng)用無機(jī)納米材料來促進(jìn)電子傳遞提供一種新思路。

隨著納米技術(shù)的不斷發(fā)展和壯大,各種納米材料在傳感器領(lǐng)域的應(yīng)用日趨廣泛。納米材料所具有的高比表面積、高活性、特殊物理性質(zhì)及生物相容等特性使其成為應(yīng)用于傳感方面最有前途的材料之一。2.2基于酶直接電子傳遞的傳感器

直接電子傳遞是蛋白質(zhì)分子與電極表面在沒有任何媒介和試劑的情況下直接進(jìn)行電荷交換，這樣有利于電子傳遞效率的提高,更能反映生物體系內(nèi)的氧化還原系統(tǒng),為揭示生物體內(nèi)電子傳遞的機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。但是酶蛋白的活性中心通常是深埋在其內(nèi)部，當(dāng)其固定在裸電極表面時(shí),沒有合適的界面微

環(huán)境來實(shí)現(xiàn)其直接電子傳遞,致使阻礙其在活體檢測方面的實(shí)際應(yīng)用。通過界面設(shè)計(jì)使修飾電極可以建立理想的接觸界面,暴露酶的電活性中心，實(shí)現(xiàn)酶與電極之間快速的直接電子傳遞,并利用其對自由基的選擇性達(dá)到預(yù)期的檢測目的，對于預(yù)防和治療疾病以及抗氧化藥物的研發(fā)都具有現(xiàn)實(shí)意義。

2.2.1基于Cyt.c的傳感器Cyt.c是一種存在于線粒體內(nèi)膜外側(cè)的金屬蛋白分子，是呼吸鏈中一個(gè)重要的電子載體。通過血紅素輔基中心鐵離子價(jià)態(tài)的變化來傳遞電子，在細(xì)胞呼吸鏈中具有舉足輕重的作用。研究其在電極上的電子傳遞及與O2'_自由基的生物作用，對于了解生命體內(nèi)的能量轉(zhuǎn)化和物質(zhì)代謝具有重要的意義。因此,探索實(shí)現(xiàn)Cyt.c與電極表面之間的直接電子傳遞成為電分析化學(xué)研究的方向之一。　Cooper等將巰基半胱氨酸自組裝到裸金電極表面,通過碳二亞胺縮合反應(yīng)固定Cyt.c,考察了yt.c與電極之間的電子傳遞情況,結(jié)果顯示Cyt.c在電極表面實(shí)現(xiàn)直接電子傳遞；其表觀電位為2mV(vs.SCE),表明此傳感器具有潛在實(shí)際應(yīng)用的可行性。Cooper等M采用電化學(xué)分析方法檢測黃嘌昤/黃嘌昤氧化酶體系酶化反應(yīng)產(chǎn)生的自由基，其原理如圖1所示。酶化反應(yīng)產(chǎn)生O〗_自由基還原Cyt.c,自身被氧化成Oi;同時(shí)還原態(tài)的Cyt.c在電極表面正電位下迅速被氧化為氧化態(tài)。基于此反應(yīng)機(jī)理,他們實(shí)現(xiàn)了嗜中性粒細(xì)胞中應(yīng)激產(chǎn)生的02’_自由基的動(dòng)態(tài)檢測，且引起的電流響應(yīng)速率與02"自由基的產(chǎn)生速率成線性關(guān)系。-傳感器的靈敏度取決于負(fù)載活性酶的數(shù)量以及酶與自由基的反應(yīng)速率。Wegrich等63利用定點(diǎn)誘變技術(shù)在Cyt.c活性位點(diǎn)附近引進(jìn)帶正電荷的賴氨酸,考察其在巰基分子修飾的金電極上的分析性能。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明誘變重組的Cyt.c均具有氧化還原圖10廠電流傳感器的作用機(jī)理示意圖電活性,能夠?qū)崿F(xiàn)直接電化學(xué)，并且與O2’_自由基的Fig.1Mechanismofoperationofamperometric反應(yīng)速率顯著加快。基于誘變Cyt.c構(gòu)筑的電化學(xué)生sensor物傳感器在靈敏度和穩(wěn)定性上都有不同程度的提

高。納米材料的不斷發(fā)展為電極界面設(shè)計(jì)提供了新的契機(jī),其巨大的比表面積和良好的生物相容性,既

能增大酶的負(fù)載量,又能較好的保持酶蛋白的高催化活性，同時(shí)作為良好導(dǎo)體加快電子的傳遞。Rahimi

等M將多層碳納米管/室溫離子液體的納米復(fù)合材料與Cyt.c混勻后，直接滴涂到玻碳電極表面上,簡單有效地制備了O〗_第三代生物傳感器。首先,多層碳納米管作為電子促進(jìn)劑,加快Cyt.c和電極之間的電子傳遞;其次,室溫離子液體保持了Cyt.c的空間構(gòu)象結(jié)構(gòu)和生物催化活性,二者協(xié)同提高了傳感器的

靈敏度、響應(yīng)時(shí)間、檢測限等分析性能。正如人們所期望的，基于Cyt.c的O〗_傳感器可避免抗壞血酸、尿酸的干擾，能夠在低電位下檢測。然而,作為過氧化物酶的本質(zhì)特點(diǎn),Cyt.c同樣能夠還原來自酶化反應(yīng)產(chǎn)生和體內(nèi)共存的&O2,受其干擾。雖然Gobi等M報(bào)道可以通過設(shè)計(jì)電極來控制Cyt.c的過氧化酶活性,但Cyt.c不是O〗-的特異性酶,這極大限制了其在復(fù)雜生物體系中的選擇性檢測的作用。眾所周知，SOD可高活性和選擇性地將O〗-歧化為O:和H2O2M,從而完成O〗-高選擇性測定。因此,采用SOD替代Cyt.c來構(gòu)筑高靈敏度和高選擇性的O〗_生物傳感器越來越受到業(yè)內(nèi)人士的普遍關(guān)注。

2.2.2基于SOD與仿生SOD的O「傳感器SOD是廣泛分布于生物體內(nèi)重要的抗氧化酶,也是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)。作為一種金屬蛋白酶，常見的幾種不同金屬中心SOD是Cu,Zn-SOD,n-SOD,Fe-SOD和Ni-SOD,它們都能將O；-自由基有效的歧化為%。2和。2保護(hù)機(jī)體不受毒性的侵害。但其電活性中心都包埋于蛋白質(zhì)深處，致使SOD與電極表面的直接電子傳遞難以實(shí)現(xiàn)。

因此，實(shí)現(xiàn)SOD與電極之間的直接電子傳遞對第三代O2’_生物傳感器的構(gòu)筑以及實(shí)際應(yīng)用的發(fā)展具有現(xiàn)實(shí)意義。

Ohsaka等M首次將Cu,Zn-SOD修飾在半胱氨酸自組裝修飾的金電極表面上構(gòu)筑了第三代傳感器。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，自組裝的半胱氨酸分子可作為SOD電極反應(yīng)的促進(jìn)劑。結(jié)合傳感器高靈敏度、高選擇性和快速響應(yīng)的良好分析性能，實(shí)現(xiàn)對酶化反應(yīng)產(chǎn)生O^自由基的檢測，這一工作是利用SOD直接電化學(xué)實(shí)現(xiàn)O;_自由基檢測的一個(gè)巨大突破。Ohsaka課題組M首次發(fā)現(xiàn)O;_自由基在SOD電極上能夠同時(shí)氧化和還原,并進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)證實(shí)了可以在氧化和還原電壓雙向檢測自由基，這為實(shí)現(xiàn)溶液中自由基的分析檢測提供了第一手資料，同時(shí)為實(shí)現(xiàn)持久和可靠的檢測生物體系里的O；-自由基奠定了基礎(chǔ)。接著，Tian等^首次在半胱氨酸膜修飾的電極上同時(shí)實(shí)現(xiàn)3種活性中心SOD(Cu,Zn-SOD,Fe-SOD和Mn-SOD)的直接電子傳遞。如圖2所示，通過活性中心的氧化還原循環(huán)，SODs能夠催化還原成H2O2和氧化成O2,使得陽極和陰極上的電流響應(yīng)明顯增大，這說明SOD對O；-具有雙功能電催化活性。結(jié)合SOD快速電子傳遞的特性,該傳感器為雙向?qū)崿F(xiàn)O^電化學(xué)檢測的提供了一條可行性路線。

Ge等M將Cu,Zn-SOD和Fe-SOD固定在巰基半胱氨酸修飾的裸金電極表面上,研究其動(dòng)力學(xué)和吸附過程,結(jié)果表明通過不同動(dòng)能學(xué)過程均能結(jié)合到電極表面上。

在實(shí)際應(yīng)用檢測中，高靈敏、高選擇性的檢測方法越來越顯示出其重要性。納米技術(shù)的發(fā)展為高靈敏電化學(xué)分析方法的發(fā)展提供了機(jī)遇。例如，納米材料在生物分析檢測中得到了廣泛應(yīng)用，已有多種信號(hào)放大方法用于高靈敏電化學(xué)分析方法的構(gòu)建。

如圖3所示,Tian課題組[43首次在錐狀、棒狀和球狀3種不同形貌的納米金表面上同時(shí)實(shí)現(xiàn)了SOD的直接電化學(xué)。熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)分析表明SOD在不同界面上的電子轉(zhuǎn)移速度，與納米金的形貌有關(guān)；同時(shí)，

良好的生物相容性讓納米金表面的SOD保持了其自身的生物催化活性，可用來構(gòu)建既可在氧化電位又可在還原電位下進(jìn)行0廠自由基檢測的生物傳感器。

無需其它步驟，結(jié)合良好的分析性能大大增加了其應(yīng)用于實(shí)現(xiàn)生物體內(nèi)O^測定的可行性。

綜上所述，分析檢測都是在體外分析體系中通過外來不斷加入O2'_自由基進(jìn)行電分析，與體內(nèi)的復(fù)雜生物環(huán)境截然不同。因此我們很有必要對體內(nèi)O；-自由基進(jìn)行準(zhǔn)確的分析檢測，以便更好的深入理解O^自由基在生理和病理上中所發(fā)揮的作用。

3細(xì)胞釋放檢測

在細(xì)胞水平上，當(dāng)細(xì)胞受到外界剌激或者生理病變過程中會(huì)產(chǎn)生過量自由基，從而對細(xì)胞生理功能產(chǎn)生重要影響，進(jìn)而引起生理病變。因此，構(gòu)筑適于檢測細(xì)胞內(nèi)O2'_自由基的傳感器,原位、實(shí)時(shí)地檢測自由基濃度的變化,對疾病預(yù)防與治療的途徑具有重要的生理及病理意義。

Tanaka等[44利用碳纖維修飾電極檢測由免疫球蛋白G和卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯剌激單中性白細(xì)胞產(chǎn)生O^自由基的氧化電流。實(shí)驗(yàn)證明自由基會(huì)在剌激1min后產(chǎn)生，5min達(dá)到最大值,20min后消失，這種方法獲得的電流4寸間關(guān)系與傳統(tǒng)方法獲得的結(jié)果一致。隨后,Tanaka課題組[45設(shè)計(jì)了一種檢測由單個(gè)噬菌細(xì)胞釋放自由基的電流方法,其靈敏度高達(dá)到fA級。

在實(shí)際樣品檢測時(shí),天然酶的空間結(jié)構(gòu)和構(gòu)象變化容易致使其喪失催化活性,成為制約它們實(shí)際應(yīng)用瓶頸。為了避免這些缺陷，基于活性位點(diǎn)■銅、鐵和錳設(shè)計(jì)的低分子量、具有SOD生物活性的仿生酶研究已陸續(xù)報(bào)道[4649]。Cabelli等^研究了錳磷酸鹽作為仿生SOD在有機(jī)活體內(nèi)的抗氧化機(jī)理。為了證明結(jié)果的可靠性,他們采用兩種不同方法:脈沖輻射法和Co~60i輻射法產(chǎn)生自由基。實(shí)驗(yàn)證明Mn2+與O「自由基反應(yīng)生成暫態(tài)的MnO:+,然后MnO:+快速歧化生成O:和^O:。

Tian課題組利用M%(PO4)2具有仿生SOD的生物特性,在高導(dǎo)電納米針狀TiOi膜上構(gòu)筑了一個(gè)具有選擇性高和穩(wěn)定性好的第三代O〗_生物傳感器，提供了一種方便、快速原位直接檢測貼壁生長在修飾膜表面的正常人胚腎細(xì)胞HEK293T和CHO癌細(xì)胞釋放的O〗_自由基的電化學(xué)分析新方法。檢測原理如圖4所示,在M%(PO4)2仿生酶的催化作用下發(fā)生歧化反應(yīng)的過程中，將Or分別轉(zhuǎn)化成Oi和&O2(如圖4A)。此過程可看成是分別在兩個(gè)電極上獨(dú)立進(jìn)行的兩個(gè)反應(yīng)。一方面,在陽極反應(yīng)中圖（4B),電解液中的被MnOi+的氧化生成O2,同時(shí)MnOi+被還原成Mn2+。而生成的Mn2+能夠在電極上失去電子，重新被氧化成MnO2+。另一方面，在陰極反應(yīng)中（圖4C),O；-氧化Mn2+生成MnO2+,而生成的MnO2+在電極表面得到電子被還原成Mn2+。因此,在O〗-存在的情況下,通過Mn2+修飾電極上的氧化或還原電流檢測O2'_。因此,通過兩極上氧化或還原電流信號(hào)的變化，即可實(shí)現(xiàn)對O2’_的檢測。電化學(xué)信號(hào)表明此生物傳感器可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生0廠自由基的可逆響應(yīng)，暗示02'_自由基可作為_種癌癥生物標(biāo)記物，為生理和病理方面的研究提供了基礎(chǔ)。

基于SOD生物仿生酶(PO4)2,Zhou等開發(fā)了一種可靠和持久原位實(shí)時(shí)檢測O-自由基的方法。Mn2+通過離子交換作用進(jìn)入zeolite~ZSM-5的納米結(jié)構(gòu)中，進(jìn)一步被聚二烯丙基二甲基氯銨化覆蓋固定到電極表面上。沸石的納米微結(jié)構(gòu)加快了Mn2+的直接電子傳遞，其表觀電位是（561±6)mV(vs.Ag/AgCl),位于O2'-/O2和O2'-/H2O2動(dòng)力學(xué)電位內(nèi)，可以將O〗_歧化為Oi和％O2。利用分子篩較好的生物相容性和細(xì)胞黏附性，讓細(xì)胞貼壁生長，

可靠、持久的原位實(shí)時(shí)測定了細(xì)胞釋放出來的O‘-自由基濃度,實(shí)現(xiàn)從理論到實(shí)踐應(yīng)用的轉(zhuǎn)變。

作為細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)分子，自由基與金屬離子密切關(guān)系，包括Ca2+通道、K+通道、Na+通道等。

Tian課題組153基于Mn^TPAA(Mn-tris2-(2-pyridylmethyl)aminoethyl]amine)仿生酶構(gòu)筑了O;生物傳感器,具有高的穩(wěn)定性和良好的重現(xiàn)性。以Hela細(xì)胞為模型,他們進(jìn)一步研究了細(xì)胞釋放O〗_自由基與細(xì)胞內(nèi)Ca2+之間的依存關(guān)系。如圖5所示，在無抑制劑時(shí)，加入Ang后熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，說明Angn剌激細(xì)胞產(chǎn)生的O「促使細(xì)胞內(nèi)Ca2+的釋放,Ca2+與Fluo4-AM結(jié)合,從而使熒光增強(qiáng)。然而，在實(shí)驗(yàn)前先用NADPH氧化酶抑制劑Apo或陰離子通道阻滯劑DIDS處理10min,再進(jìn)行的相同實(shí)驗(yàn)時(shí),AngH剌激細(xì)胞前后熒光強(qiáng)度沒有明顯變化。這說明Apo抑制細(xì)胞外O〗_的產(chǎn)生而影響熒光強(qiáng)度的增加，DIDS阻止細(xì)胞外O〗_進(jìn)入細(xì)胞而抑制細(xì)胞Ca2+濃度的增大。這一研究對認(rèn)識(shí)自由基信號(hào)的傳導(dǎo)與其它生理和病理的關(guān)系提供了一種新思路。

4活體電化學(xué)分析

電化學(xué)分析方法雖具有高靈敏性、原位、實(shí)時(shí)在線檢測等優(yōu)點(diǎn),適于活體內(nèi)o2'_自由基的分析和檢測,但目前這方面鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。

對于植物體內(nèi)0廠自由基的檢測,Deng等M基于半導(dǎo)體ZnO納米材料成功構(gòu)筑了第三代生物傳

感器，實(shí)現(xiàn)了豆芽體內(nèi)O^的檢測。如圖6所示，活體實(shí)驗(yàn)采用雙電極體系,ZnO/SOD微電極作為工作電極,鉑絲作為對電極。ZnO/SOD微電極的制備步驟如下：首先，ITO導(dǎo)電玻璃切割成剌狀；然后，將ZnO納米材料電沉積到導(dǎo)電玻璃表面上，并進(jìn)一步負(fù)載Cu,Zn-SOD。結(jié)果表明，通過一步、無模版的電沉積得到新型六角形ZnO納米材料，可實(shí)現(xiàn)了SOD的直接電子傳遞;再結(jié)合SOD對O^自由基的催化歧化，實(shí)現(xiàn)了豆芽體內(nèi)O^自由基的在線檢測。該項(xiàng)研究不僅為酶蛋白在納米結(jié)構(gòu)半導(dǎo)體膜上構(gòu)筑第三代生物傳感器建立了一個(gè)模型，也為研究生物體內(nèi)O2’-作用機(jī)理開啟了一扇窗口，可以更深入的理解O；-自由基在生理學(xué)和病理學(xué)中的作用。

利用TTCA(5,2:5,2-terthiophene-3-carboxylicacid)聚合物膜依次共價(jià)鍵固定DGPD(1,2-Dipalmi-toylsn~glycero-3~phosphoethanolamine^i~dodecanylamine)和Cyt.c,Rahman等1551制備了一種高穩(wěn)定、高靈敏的體內(nèi)檢測O2_的第三代傳感器。他們通過持續(xù)不斷的往鼠腦注入可卡因溶液剌激產(chǎn)生O2_,并利用該傳感器對細(xì)胞外的o2’-進(jìn)行檢測。如圖1所示，該傳感器在鹽水、急性和重復(fù)注射可卡因不同實(shí)驗(yàn)條件下產(chǎn)生了不同程度的電流響應(yīng)，其中重復(fù)注射可卡因操作下傳感器的靈敏度最高。-0.31V的低電位結(jié)合聚合物膜的屏蔽可使傳感器在測定0廠自由基時(shí)避免抗壞血酸、尿酸、過氧化氫、氧氣等干擾,從而保證此微型傳感器植入鼠腦成功測定體內(nèi)02'-自由基的濃度，并且能夠?qū)崿F(xiàn)動(dòng)態(tài)檢測體內(nèi)02-自由基濃度隨可卡因不斷急性注入的變化。該微型生物傳感器可以作為監(jiān)測興奮劑藥物暴露引起細(xì)胞外0廠自由基濃度變化的一種有效工具。

近來，Tian等63提出了一種植入型微碳纖維電極直接實(shí)現(xiàn)活體內(nèi)0廠自由基檢測的新思路。此碳纖維基底上固定的SOD在測定0廠上擁有顯著的高選擇性和良好的穩(wěn)定性；同時(shí)背景電流的減小使得碳纖維微電極在高靈敏測定生物體內(nèi)0廠自由基占有優(yōu)勢。隨后,Tian課題組M首次利用NTA/HT技術(shù)實(shí)現(xiàn)了SOD在NTA修飾電極上的直接電化學(xué),極大提高了電子傳遞。整個(gè)傳感器的制備過程如圖8(A和B)所示。結(jié)合傳感器的高靈敏度、高穩(wěn)定性的分析性能以及碳纖維電極生物相容性和可微型化特點(diǎn),該課題組成功實(shí)現(xiàn)鼠腦在缺血再灌注過程中0廠自由基濃度的變化檢測（圖8C)。該研究為體內(nèi)活性氧的進(jìn)一步研究提供了一種新思路，同時(shí)也為理解其在氧化應(yīng)激和生理病理過程中的作用提供了獨(dú)特的視角。

建立基于納米材料與功能分子設(shè)計(jì)界面的02’-自由基檢測新方法和適于活體檢測的超微電極技圖8(A)NTA和SOD修飾電極過程示意圖；（B和C)碳纖維電極制備過程以及利用碳纖維電極檢測鼠腦內(nèi)02’_過程示意圖

    術(shù),將為研究等活性氧在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用，進(jìn)而解析0廠自由基等活性氧在生命活動(dòng)中的作用機(jī)理,治療和預(yù)防與氧化應(yīng)激等有關(guān)疾病,以及抗氧化物新藥的研制與開發(fā)等提供一種新的研究思路。