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核酶的化學本質(zhì)范文1

從曲線不難得出這樣一些推論:1.每種酶的最適作用溫度都是一個定值。2.此曲線顯示酶的作用溫度是以最適作用溫度為對稱軸呈左右對稱的。3.曲線的兩側(cè)與橫坐標軸沒有交點。筆者教學研究中發(fā)現(xiàn)存在著明顯的缺點,為此,筆者專門請教了有關(guān)專家并進行了研究,覺得有必要予以澄清。

首先,大多數(shù)的蛋白酶在高溫下分子結(jié)構(gòu)遭到破壞,并失去了活性,特別是大多數(shù)的蛋白酶,因為蛋白質(zhì)的變性而失去活性,這種變性大多是不可逆的,而且隨著溫度的升高,這種變性更無恢復的可能,也就是說曲線的右側(cè)的某一位置上應該與橫坐標有一個交點,而課本上的插圖沒有。為此筆者完整地摘錄了《生化簡明教程》插圖如下:

從圖上可以明確看出右側(cè)也沒有交點。對于蛋白類的酶來說,高溫時失去活性是肯定的,是不是對于核酶來說有例外呢?筆者專門請教了南京師范大學的教授,得到的回答也是肯定的,RNA酶在高溫下也會失去活性,也就是說即使是核酶也應該有一個交點。

其次,在低溫下,酶的活性也會受到抑制,由于它的分子結(jié)構(gòu)沒有被破壞,所以在適宜的條件下可以恢復,而在日常生活中也可以利用這一點來保存酶,而從《生物化學簡明教程》的上述插圖可以看出,左側(cè)是從原點開始的,也就是說有一個交點。蛋白質(zhì)類的酶在低溫下一般不會發(fā)生變性,但活性極低,甚至可以低到難以檢測的程度,RNA酶在低溫下的活性也可能會很低,因此,給出這個交點倒是能夠讓人理解的。但酶在高溫下會發(fā)生變性,變性以后酶的活性大部分將會完全喪失,最適作用溫度高溫一側(cè)也必定存在一個交點,不給出這個交點無法讓人理解。

第三,酶的最適作用溫度不是一個固定不變的常數(shù),其數(shù)值受到底物、種類、作用等因素的影響而改變,例如,酶的作用時間長短不同,所求的最適作用溫度亦不同,作用時間愈長,最適作用溫度愈低,作用時間愈短,最適作用溫度則愈高。其實只有在一定的條件下各種酶才有其一定的最適作用溫度,通常動物體內(nèi)酶的最適作用溫度在37-50℃,植物體內(nèi)的酶的最適作用溫度在50-60℃。

第四,和一般化學反應相同,酶的反應在一定的溫度范圍0-40℃內(nèi),其速度隨溫度的升高而升高,根據(jù)一般經(jīng)驗每升高10℃的反應速度增加一倍,高溫下酶易失活,絕大多數(shù)酶在60℃即失去活性,故此,最適作用溫度的右側(cè)下降的幅度應該較大,左側(cè)上升的幅度應該相對較慢,曲線的兩側(cè)也應該不會程明顯的對稱。

綜上所述,酶在一定的條件下有一個最適溫度,并且在最適溫度兩側(cè)應該是不對稱,左側(cè)和橫坐標無限接近,右側(cè)和橫軸在某一位置有一個交點。所以酶受溫度的影響曲線應該大體上是這樣一個趨勢:

當然,蛋白酶和核酶在特性上有一定的差異,曲線也應該有所變動。

另外,從曲線上無法直接反映出來的是,蛋白質(zhì)的變性作用如不過于劇烈,是一種可逆反應。這一點在教學過程中往往也無法作出解釋。例如,胃蛋白酶加熱至80-90℃時,失去溶解性,也無消化的能力,如將溫度再降低到點37℃則它又可恢復溶解性與消化蛋白的能力,但隨著變性時間的增加、條件的加劇,變性程度也加深,如蛋白質(zhì)的結(jié)絮作用和凝固作用就是變性程度深刻化,這樣就達到不可逆的變性。這些也絕不是一個圖就可以說明的。當然上述是筆者的一孔之見,錯誤在所難免,請各位同仁不吝賜教。

參考文獻:

1.全日制普通高級中學教科書《生物》必修第一冊,人民教育出版社自然編著室編著

2.《生物化學簡明教程》高等教育出版社第三版由羅紀盛等編著

顧問專家:南京師范大學許曉風教授

核酶的化學本質(zhì)范文2

【摘要】 目的 了解用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測乙肝病毒DNA拷貝數(shù)時，溶血對乙型肝炎病毒DNA定量檢測的影響。 方法 采集30例乙型肝炎患者血液，分離血清，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆茫⑼瑫r配制出含不同濃度Hb血清管。采用實時熒光定量PCR方法，檢測含不同Hb濃度及不含Hb血清的乙型肝炎病毒DNA拷貝數(shù)，用配對t檢驗進行統(tǒng)計處理。結(jié)果 當標本中Hb濃度小于32 g/L時，Hb對檢測血清乙型肝炎病毒DNA拷貝數(shù)無顯著影響（P＞0.05）。結(jié)論 當Hb濃度較低時，Hb對血清乙型肝炎病毒DNA定量檢測無顯著影響，因此較低濃度溶血標本可以進行乙型肝炎病毒DNA的定量檢測。

【關(guān)鍵詞】 乙型肝炎病毒；DNA定量；溶血；PCR

血清中乙型肝炎病毒DNA水平是判斷乙型肝炎病毒在體內(nèi)是否復制，患者傳染性高低及選擇治療方案的重要指標。目前臨床一般采用實時熒光定量PCR技術(shù)對乙型肝炎病毒DNA拷貝數(shù)進行定量檢測。實時熒光定量PCR技術(shù)融匯了PCR技術(shù)的高效擴增，探針技術(shù)的高特異性，光譜技術(shù)的高敏感性等優(yōu)點，通過直接檢測PCR過程中熒光信號的變化以獲得定量的結(jié)果。但此技術(shù)可能與標本狀態(tài)密切相關(guān)，如溶血、脂血等。有研究表明Hb及其代謝產(chǎn)物可能與Taq酶相互作用，進而抑制Taq酶的活性，使PCR擴增效率明顯降低，導致定量測定結(jié)果偏低［1］。在臨床檢驗標本中，溶血標本較為常見，究竟溶血到何種程度會對乙型肝炎病毒DNA定量結(jié)果產(chǎn)生影響？本文將探討不同程度溶血對乙型肝炎病毒DNA定量檢測的影響。

對象與方法

1.對象 我們收集了ALT＞40 U/L、HBsAg陽性、HBeAg陽性、HBcAb陽性的乙型肝炎患者30例，其中男性17例，女性13例，年齡在18～53歲之間。

2.試劑 深圳匹基公司提供的乙型肝炎病毒DNA檢測試劑盒（批號：20070501）、乙型肝炎病毒DNA陽性標準品。

3.儀器 BECKMAN全自動血球計數(shù)儀（型號：Coulter Ac.Tdiffe）、Lightcycle熒光PCR擴增儀(羅氏公司)、高速低溫離心機（Sigma公司）、干式恒溫器（杭州藍焰科技有限公司）、低溫冰箱（SANYO公司）。

4. 方法

（1）模擬溶血標本的制備：抽取30例乙型肝炎患者血液后，2小時內(nèi)離心分離血清，這種不含Hb的血清作為無Hb對照組，然后取每位患者600 μl血清及適量紅細胞混合，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩４稳諏⒑t細胞的血清管取出放于室溫解凍，完全解凍后再將該管置于-20℃冷凍，如此反復凍融兩次，使得RBC完全破裂，釋放出Hb。在Coulter全自動血球計數(shù)儀測定每管紅細胞裂解后的Hb濃度，再用每位患者的血清稀釋，使得Hb終濃度為4 g/L、8 g/L、16 g/L、32 g/L，這些標本即為模擬溶血標本。

（2）乙型肝炎病毒DNA模板制備：取待測樣本及陰、陽性對照（試劑盒備有）各100 μl，分別加入到0.5 ml的離心管中，再分別加入100 μl DNA提取液1，震蕩混勻，13000 rpm離心10 min；吸棄上清液，再加入25 μl提取液2，震蕩至沉淀完全散開，100℃干浴10 min；冷至室溫后，13000 rpm離心10 min，保留上清液備用。

（3）PCR擴增：從試劑盒中取出乙型肝炎病毒DNA擴增反應液、Taq酶及UNG，室溫融化后按規(guī)定比例混合均勻，根據(jù)試劑盒說明書配置反應液，分裝于Roche毛細擴增管中，每次實驗均設2管陰性對照，1管強陽性對照，1管臨界陽性對照， 4管乙型肝炎病毒陽性工作標準品，其拷貝數(shù)分別為〗5.0×104、5.0×105、5.0×106、5.0×107拷貝/ml，將上述對照及樣本各加2 μl于加好反應液的Roche毛細管中，短暫離心后上機擴增。對檢測結(jié)果高于5.0×107拷貝/ml的標本進行稀釋后再擴增，使其結(jié)果落在試劑盒檢測線形范圍內(nèi)。

（4）核酸擴增與熒光數(shù)據(jù)采集：擴增條件設置為37℃孵育3分鐘； 94℃變性1分鐘；再進入40個循環(huán)，每一個循環(huán)包括92℃變性5秒，60℃退火及延伸30秒，在60℃時單點收集熒光信號；儀器檢測通道選擇F1通道。

（5）分析條件設定：選擇F1通道，點擊Quantification進入定量分析窗口，設定Analysis方式為proportional，選定Noise bank項，閾值選定為剛好超過陰性對照品擴增曲線的最高點，且Ct值不出現(xiàn)任何數(shù)據(jù)為準。

（6）數(shù)據(jù)分析：四個陽性標準品Ct值均須小于38.0，標準曲線的擬合度須小于-0.980，陰陽對照品擴增須符合預期要求，得出的待測樣品的拷貝數(shù)才為可信結(jié)果。

5.統(tǒng)計學處理 將測得的乙型肝炎病毒DNA拷貝數(shù)轉(zhuǎn)換成常用對數(shù)，再利用SPSS軟件包進行統(tǒng)計，各含Hb的血清組與無Hb的血清組間差異采用配對t檢驗進行差異性檢驗。

結(jié)果

Hb為4、8、16、及32 g/L的血清組中乙型肝炎病毒DNA拷貝數(shù)與無Hb的血清組分別進行配對t檢驗，P值均大于0.05，因此每一組含Hb的乙型肝炎病毒DNA拷貝數(shù)與不含Hb的血清組均無顯著性差異。見表1。

表1 各組乙型肝炎病毒DNA拷貝數(shù)及統(tǒng)計量（略）

討論

實時熒光定量PCR技術(shù)檢測乙肝病毒DNA已在臨床廣泛使用，但在臨床應用中，影響的因素也較多，如實驗室條件，操作人員的技術(shù)，臨床標本的狀態(tài)等。一些研究認為溶血標本對FQPCR技術(shù)檢測乙肝病毒DNA有影響，但也有研究認為這種影響并不顯著［2］。本文通過模擬不同程度溶血標本，認為溶血達到32 g/L對檢測結(jié)果無顯著影響（P＞0.05）。陳英劍等認為溶血至20 g/L時對檢測結(jié)果無影響，這與本文研究結(jié)論基本一致［3］。

本文將乙型肝炎患者抽血后2小時內(nèi)分離的血清作無Hb對照組，然后通過反復凍融使標本溶血，再用乙型肝炎患者自身血清稀釋以獲得不同Hb濃度溶血標本，在模擬不同程度溶血標本過程中，不添加任何外來物質(zhì)，使檢測結(jié)果受外在因素影響程度減少到最低。實驗結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計處理后，發(fā)現(xiàn)溶血程度控制Hb的濃度在32 g/L以下時，對乙型肝炎病毒DNA的檢測結(jié)果無顯著影響（P＞0.05）。出現(xiàn)此結(jié)果的原因可能有兩個方面，一是在HBVDNA模板的提取過程中，標本中的Hb經(jīng)100℃煮沸10分鐘后已經(jīng)變性沉淀，再經(jīng)離心后，待測樣本上清液中可能不會有Hb的存在，僅剩Hb的衍生物［4］。而且隨著提取方法的不斷改進，提取液中對DNA聚合酶的干擾物質(zhì)不斷減少，去除Hb越來越徹底。另一方面FQPCR對乙肝病毒DNA定量檢測只是一種半定量方法，并不是對擴增后終產(chǎn)量進行完全定量，它是根據(jù)樣本可檢測的起始擴增時間與標準品擴增曲線得出的半定量結(jié)果。本文收集的30例病人的血清中HBVDNA含量均大于107 拷貝/ml，樣本中HBVDNA含量較高，血清中HBVDNA含量小于107 拷貝/ml時，檢測結(jié)果是否有差異，尚需進一步研究。且本文只對溶血程度小于32 g/L時進行探討，溶血大于32 g/L時對檢測結(jié)果的影響，也需進一步驗證再作結(jié)論。溶血程度達到32 g/L時已是肉眼非常清晰可見，臨床溶血樣本的溶血程度大多在32 g/L以下，因此我們認為一般的溶血樣本可以接受。但需注意的是，本文只是對深圳匹基公司試劑進行探討，不同廠家，可能因使用不同的提取液及提取方法而出現(xiàn)不同的結(jié)論，有文獻報道，使用PEG沉淀煮沸法和直接加熱煮沸法提取HBVDNA所得的定量結(jié)果有差異，因此不同提取方法對檢測結(jié)果有一定的影響［5］。一般而言廠家提供試劑時會給出較為清晰的影響試劑盒使用的各種因素，有能力的PCR實驗室在試劑使用前，可進行此類評價實驗，制訂合適本實驗室使用標本留取標準。隨著衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展，人們對檢驗質(zhì)量的的要求越來越高，但檢驗質(zhì)量不可避免的受較多因素影響，標本質(zhì)量是重要的影響因素之一，如溶血、脂血、餐前、餐后等，對各項影響因素進行量化研究，如溶血、脂血達到何程度時則定為不合格樣本，都應該有明確的指標。本文只對溶血程度小于32 g/L時進行探討，溶血大于32 g/L時及血清中HBVDNA含量小于107 拷貝/ml拷貝時對檢測結(jié)果的影響，需進一步驗證再作結(jié)論。

參考文獻

［1］黃 翔，王日軍，周志明，等.溶血和脂血標本中乙肝病毒DNA提取方法的選擇與評價［J］.華中醫(yī)學雜志，2004，28（02）：123-124.

［2］李金明，王露楠. 樣本處理對聚核酶鏈反應測定乙肝病毒核酸的的影響［J］.中華檢驗醫(yī)學雜志，2000，23（6）：337-339.

［3］陳英劍，胡成進，齊法蓮，等.溶血對熒光定量PCR檢測HBV DNA結(jié)果的影響［J］.國外醫(yī)學臨床生物化學與檢驗學分冊，2004，25（6）：563-564.