前言：中文期刊網精心挑選了白藜蘆醇范文供你參考和學習，希望我們的參考范文能激發你的文章創作靈感，歡迎閱讀。
白藜蘆醇范文1
釀酒葡萄渣由河北和新疆提供;白藜蘆醇標準品(中國藥品生物制品檢定所生產);甲醇為上海化學試劑有限公司生產，色譜純;其他試劑均為市售分析純。料處理釀酒葡萄渣在60℃的電熱恒溫鼓風干燥箱中烘24h，粉碎后過40目篩，置干燥器中備用。白藜蘆醇的提取［13－15］精密稱取30g釀酒葡萄渣原料，以80%乙醇作為提取溶劑，液料比為10mL∶1g，提取溫度為60℃，共提取3次，每次提取時間為2h，第2、3次提取前各超聲10min，合并3次所得濾液，在40℃條件下用旋轉蒸發儀濃縮至干，用三氯甲烷－丙酮－乙醇－水(體積比4∶4∶0．5∶0．2)溶解，置于10mL容量瓶中，定容得釀酒葡萄渣提取樣品。
樣品預凈化處理(1)白藜蘆醇的定性鑒定。白藜蘆醇在365nm處顯藍紫色熒光。用薄層層析法檢測，展開劑為三氯甲烷－丙酮－乙醇－水(體積比4∶4∶0．5∶0．2)時，根據標準品Rf值=0．638定性鑒定白藜蘆醇的存在，從而能有效控制預處理過程。點樣:取活化好的硅膠GF254板，薄層板尺寸為:10cm×20cm，距薄板一端約1．5cm處，用鉛筆輕輕劃1條與底邊平行的直線，確定各樣品點樣位置。然后分別用毛細管吸取白藜蘆醇標準溶液、釀酒葡萄渣溶液進行點樣。樣點之間的距離約1cm，薄層兩邊距離約1cm。展開:將點樣好的薄層板置于展開劑中，上行展開15cm，取出，揮干溶劑。檢測:在365nm紫外燈下觀察熒光斑點。(2)樣品預凈化處理。準確吸取0．5mL提取樣品，加樣于硅膠柱上(硅膠10g，硅膠柱為10mm×250mm的玻璃柱，濕法裝柱)。用約35mL三氯甲烷－丙酮－乙醇－水(體積比4∶4∶0．5∶0．2)洗脫，依據上述方法跟蹤鑒定，收集白藜蘆醇組分，濃縮至干。用甲醇溶解，置于10mL容量瓶中定容，用0．45μm濾膜過濾得樣品溶液。平行處理3個樣品，待HPLC測定。1．3．4白藜蘆醇含量測定(1)檢測波長的選擇。以甲醇作為溶劑空白，在220～400nm處對白藜蘆醇標準品溶液進行掃描，確定白藜蘆醇的最大吸收波長。(2)HPLC色譜分析條件。色譜條件:色譜柱HypersilODS(4．6mm×250mm，5μm);流動相－甲醇－水(體積比45∶55);流速0．8mL/min;柱溫35℃;檢測波長:306nm;色譜工作站:ShimadzuClass－VP。(3)外標曲線的測定。準確稱取白藜蘆醇標準品，用甲醇－水(體積比50∶50)溶解后，置于25mL容量瓶中定容。分別從中吸取1、2、3、4、5mL用50%甲醇分別定容至10mL，用0．45μm濾膜過濾，得濃度分別為1．65、3．3、4．95、6．6、8.25μg/mL的白藜蘆醇標準溶液。在上述色譜條件下進樣10μL，平行測定3次，求其峰面積的平均值，計算得外標曲線。(4)釀酒葡萄渣中白藜蘆醇含量測定。將“1．3．3”預凈化處理過的樣品進樣20μL，平行測定3次，計算白藜蘆醇的峰面積，根據外標曲線求出白藜蘆醇的含量。
檢測波長的選擇白藜蘆醇的紫外吸收光譜圖見圖1。可見最大吸收波長為306nm，與前人研究結果一致，故本研究選擇306nm為檢測波長。
外標曲線的確定白藜蘆醇標準品的HPLC圖見圖2。以對照品進樣量(μg)x對峰面積積分值y進行線性回歸，結果表明，白藜蘆醇在0．0165～0．0825μg范圍內線性關系良好，其線性方程為y=7×106x－82231(r=0．9999)。
重現性試驗按“1．3．4”(4)方法處理樣品，平行5份，測定白藜蘆醇的峰面積，其5次測定的RSD為4．8%，重現性好。
穩定性試驗按“1．3．4”(4)方法處理樣品，精密吸取同一樣品溶液，于0、1、2、3、4、5、6、12、24h分別進樣測定峰面積，RSD為1.2%(n=9)，可見樣品在24h內基本穩定。
加樣回收率試驗加20μg白藜蘆醇標準品于釀酒葡萄渣樣品中，平行5份，按“1．3．4”(4)方法處理樣品并進行HPLC測定，每個樣品平行測定3次，求平均峰面積，根據外標曲線計算加樣回收率。5次測定的白藜蘆醇的回收率為94．1%、95．3%、96.7%、102．9%和105．6%，平均回收率為98．9%，RSD為5.04%(n=5)。
釀酒葡萄渣中白藜蘆醇的含量測定釀酒葡萄渣預處理樣品的HPLC圖譜見圖3。經過一步硅膠柱預處理，不僅白藜蘆醇得到了富集，且白藜蘆醇峰與其他雜質峰得以完全分離，無雜質峰干擾，預處理凈化效果好。試驗測得河北釀酒葡萄渣中白藜蘆醇的含量為6．482μg/g干葡萄渣，而新疆釀酒葡萄渣中未檢測到白藜蘆醇。
白藜蘆醇范文2
[關鍵詞] 癲癇；白藜蘆醇；異常放電；炎性反應
[中圖分類號] R742.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）07（b）-0038-03
[Abstract] Epilepsy is a chronic， recurrent paroxysmal disease. About 20%-30% of epilepsy patients cannot be effectively controlled after rational therapy. Epilepsy pathogenesis complex and the antiepileptic drugs have certain shortcomings and some side effects. Resveratrol is a pleiotropic phytoalexin， which has a certain effect on epilepsy treatment. The antiepileptic mechanism of resveratrol includes inhibitting the abnormal discharge of epilepsy， reducing the inflammatory reaction after seizure， playing the antagonistic role on cell apoptosis induced by seizure and protective effects on neurons.
[Key words] Epilepsy； Resveratrol； Abnormal discharge； Inflammatory reaction
癲癇是神經系統常見疾病，由腦血管疾病、器質性病變、感染性疾病、遺傳等多病因引起的綜合征，全世界癲癇患病率為1%，約有5000萬例癲癇患者[1-2]。長期反復的癲癇發作不僅使患者軀體受到損害，而且在一定程度上可導致患者心理障礙及一系列的社會問題。抗癲癇藥物如卡馬西平、丙戊酸等可有效地控制部分癲癇患者，但仍有20%～30%的患者經正規的抗癲癇治療后發作不能得到有效控制，成為難治性癲癇。另外一方面，由于目前現有的抗癲癇藥物均有副作用，且藥理及藥力動力學上存在一定的不足，因此臨床上一直在找尋一種新型的抗癲癇藥物。白黎蘆醇（resveratrol，Res）是一種天然多酚類，廣泛存在于葡萄皮、虎杖等多種植物中。Res具有抗氧化、清除氧自由基、抗癲癇等多種生理活性[3]。在其眾多生物與藥理活性作用中， 目前越來越引起人們關注的是Res抗癲癇作用[4]，已成為新的研究熱點。本文就Res來源和體內代謝過程、抗癲癇及神經保護作用及臨床應用所面臨的問題作一綜述。
1 Res的來源、利用及代謝
Res的化學名稱為3，5，4-三羥基二苯乙烯，是一種植物抗毒素，其結構為一種多酚化合物，廣泛存在于葡萄皮、虎杖等植物中。天然存在的Res有反式和順式兩種同分異構體，其中以反式結構較為穩定，生物活性更好[5-6]。在人體內主要以白藜蘆醇苷的形式存在。Res可以先與葡萄糖結合，生成相應的苷類，在腸道中糖苷酶的作用下可以釋放出Res而發揮藥理學活性。體外研究顯示50%～98%的Res可與白蛋白、低密度脂蛋白及血紅蛋白結合[7-8]。在人類大約50%的Res代謝產物通過結合蛋白轉運；70%～98%的Res在24 h內在腎臟被代謝掉[9]。
2 Res參與癲癇治療的作用機制
2.1 Res抑制異常放電
癲癇發作由神經元細胞發生異常放電所致，神經元異常放電的確切機制至今尚未完全闡明。目前有癲癇病理學研究發現，癲癇最明顯的病理學特征是海馬苔蘚纖維發芽（mossy fiber sprouting，MFS），有實驗表明，海馬CA1區神經元大量丟失，使其下位突觸空缺，誘導存活神經元異常芽生，從而參與MFS生長，引起神經元網絡重組，改變癇樣放電的方向和傳播途徑，避開一些抗癲癇藥物作用的重要靶點，導致難治性癲癇的形成[10-11]。目前有研究發現Res可明顯地抑制MFS，降低了海馬內神經元同步化放電和癲癇自發發作的頻率，具有較好的抗癲癇作用[12]。尤竹燕等[13]通過正常大鼠海馬腦片灌流γ-氨基丁酸受體拮抗劑引起癲癇樣活動以及在正常大鼠海馬CA1區注射海人藻酸建立顳葉癲癇大鼠模型，應用離體腦片細胞外場電位記錄，發現隨著Res灌流濃度增加到50 μmol/L，可部分抑制兩者誘發的癲癇樣活動，并指出 Res抑制異常放電的可能機制為通過調節N-甲基-D-天冬氨酸受體的功能抑制海馬CA1區的癲癇放電。目前有研究指出中樞神經系統內興奮性和抑制性氨基酸比例的失衡可能是導致癲癇發作的直接原因[14]，李敏等[15]發現低劑量Res對慢性癲癇大鼠海馬谷氨酸（Glu）/γ-氨基丁酸（GABA）比值失衡具有明顯保護作用，但對皮層 Glu/GABA 比值失衡沒有明顯保護作用。
2.2 Res與癲癇發作后的細胞凋亡
細胞凋亡是一種特殊的細胞死亡類型，其受生理及病理誘導而發生，該過程包括細胞內信號系統的激活，相應凋亡程序的啟動，最終實現細胞的自我破壞、自我死亡。反復和長期的癲癇發作易導致大腦尤其是海馬區神經元的發生壞死和凋亡[16-17]。不少臨床及動物模型證明了癲癇發作繼而發生海馬硬化、神經細胞變性，都可直接導致大腦海馬萎縮，這種體積的改變是神經細胞凋亡的結果。凋亡是一個精細調控過程，其中包括了不同基因表達的改變。其中Bax和Bcl-2是調控細胞凋亡的重要基因，Bcl-2是抗凋亡基因Bcl-2家族中的重要成員，其在調控細胞線粒體介導的凋亡中發揮著重要的作用。Bcl-2的高表達對神經細胞有一定的保護作用[18]。另外一方面Bax可以促進細胞凋亡的發生，其具體機制可能與破壞線粒體膜及促進細胞色素C釋放有關[19]。當細胞凋亡發生時，細胞內Bax和Bcl-2的比率升高[20-21]。郭家智等[22]發現，經Res預處理的癲癇大鼠海馬內抗凋亡Bcl-2表達及Bcl-2陽性細胞量均增加。促凋亡因子Caspase-3和Bax表達被抑制，Caspase-3和Bax陽性細胞總量減少，提示了Res可抑制癲癇大鼠海馬凋亡相關蛋白的表達，對抗癲癇發作所誘導的細胞凋亡過程。
2.3 Res減少癲癇發作后炎性反應
目前大量的實驗和臨床研究證實炎性反應在癲癇的發生和發展中起重要的作用[23-25]。癲癇發作后的炎性反應提高了神經元興奮性，繼而進一步損傷仍存活的神經元細胞。有研究顯示癲癇能激活雷帕霉素哺乳動物靶點（mammalian target of rapamycin，mTOR），提高核轉錄因子kappa B（nuclear transcription factorkappa B，NF-κB）活性，促進炎癥因子一氧化氮合酶、環氧合酶-2等的表達，從而發揮抗癲癇作用[26]。
2.4 Res與癲癇發作后神經元保護作用
除了抑制癲癇發作的異常放電，Res具有神經元的保護作用也是其治療癲癇的理想方法[27]。而近年來針對神經退行性疾病、腦損傷實驗研究均提示Res具有神經元保護作用[28-29]，且對正常大腦具有維護線粒體功能、神經保護的活性[30]。目前已有大量的臨床研究證實了癲癇反復發作可導致認知功能障礙。近期研究發現Res對戊四氮致癇大鼠同時具有抗癲癇和改善其空間學習記憶能力的兩重作用，與其保護神經元的作用有關，但具體作用機制尚不明確[31]。
3 Res在癲癇治療上局限及展望
綜上所述，Res通過抑制異常放電、抗凋亡、抗炎以及神經元保護作用等多個途徑來實現治療癲癇。但目前的研究多局限于動物實驗和細胞實驗，臨床應用的研究報道較少，而對于其臨床應用安全性、有效性的研究目前未見有報道。在今后的工作中，研究重點應當逐步轉移到人體內的機制研究、 臨床試驗以及安全性的探索，為Res作為治療癲癇藥物的開發提供更多有力依據。
[參考文獻]
[1] Giussani G，Cricelli C，Mazzoleni F，et al. Prevalence and Incidence of Epilepsy in Italy Based on a Nationwide Database [J]. Neuroepidemiology，2014，43（3-4）：228-232.
[2] Kaiboriboon K，Bakaki PM，Lhatoo SD，et al. Incidence and prevalence of treated epilepsy among poor health and lowincome Americans [J]. Neurology，2013，80（21）：1942-1949.
[3] 林春蕾，郭傳勇.白藜蘆醇抗肝癌作用研究[J].中國醫藥導報，2013，10（6）：22-24.
[4] Pan QR，Ren YL，Liu WX，et al. Resveratrol prevents hepatic steatosis and endoplasmic reticulum stress and regulates the expression of genes involved in lipid metabolism，insulin resistance， and inflammation in rats [J]. Nutrition Research，2015，35（7）：576-584.
[5] Almeida L，Vaz-Da-Silva M，Falcao A，et al. Pharmacokinetic and safety profile of trans -resveratrol in a rising multiple-dose study in healthy volunteers [J]. Molecular Nutrition & Food Research，2009，53（S1）：S7-S15.
[6] Borriello A，Cucciolla V，Ragione FD，et al. Dietary polyphenols：Focus on resveratrol，a promising agent in the prevention of cardiovascular diseases and control of glucose homeostasis [J]. Nutrition Metabolism & Cardiovascular Diseases Nmcd，2010，20（8）：618-625.
[7] Baarine M，Thandapilly SJ，Louis XL，et al. Pro-apoptotic versus anti-apoptotic properties of dietary resveratrol on tumoral and normal cardiac cells [J]. Genes & Nutrition，2011，6（2）：161-169.
[8] Lu Z，Zhang Y，Liu H，et al. Transport of a cancer chemopreventivepolyphenol，resveratrol： Interaction with serum albumin and hemoglobin [J]. J Fluoresc，2007，17（5）：580-587.
[9] Boocock DJ，Faust GE，Patel KR，et al. Phase I doseescalation pharmacokinetic study in healthy volunteers of resveratrol，apotential cancer chemopreventiveagent [J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2007，16（6）：1246-1252.
[10] Fang M，Xi ZQ，Wu Y，et al. A new hypothesis of drug refractory epilepsy：neural network hypothesis [J]. Med Hypotheses，2011，76（6）：871-876.
[11] Wu Y，Feng Y，Pang JR，et al. Study on expression of laminin in patients with intractable epilepsy [J]. International Journal of Neuroscience，2009，119（12）：2219-2227.
[12] Wu Z，Xu Q，Zhang L，et al. Protective Effect of Resveratrol against Kainate-induced Temporal Lobe Epilepsy in Rats [J]. Neurochemical Research，2009，34（8）：1393-400.
[13] 尤竹燕，王斌生，解敏，等.白藜蘆醇對大鼠海馬CA1區誘發癲癇樣放電的影響[J].中國藥理學通報，2012，28（2）：260-265.
[14] Chiang YC，Hung TW，Lee WS，et al. Enhancement of tolerance development toin rats prenatally exposed to morphine， methadone，and buprenorphine [J]. Journal of Biomedical Science，2010，17（1）：284-290.
[15] 李敏，潘群皖，王海華，等.白藜蘆醇對慢性癲癇大鼠腦組織中氨基酸類遞質含量的影響[J].皖南醫學院學報，2015（4）：307-309.
[16] Tomé AR，Feng D，Freitas RM. The Effects of Alpha-Tocopherol on Hippocampal Oxidative Stress Prior to in Pilocarpine-Induced Seizures [J]. Neurochemical Research，2010，35（4）：580-587.
[17] Weise J，Engelhorn T，Drfler A，et al. Expression time course and spatial distribution of activated caspase-3 after experimental status epilepticus：contribution of delayed neuronal cell death to seizure-induced neuronal injury [J]. Neurobiology of Disease，2005，18（3）：582-590.
[18] Gustafsson AB，Gottlieb RA. Bcl-2 family members and apoptosis， taken to heart [J]. Am J Physiol Cell Physiol，2007，292（1）：C45-C51.
[19] Wolter KG，Hsu YT，Smith CL，et al. Movement of Bax from the cytosol to mitochondria during apoptosis [J]. J Cell Biol，1997，139（5）：1281-1292.
[20] Clementi ME，Pezzotti M，Orsini F，et al. Alzheimer's amyloid beta-peptide （1-42） induces cell death in human neuroblastoma via bax/bcl-2 ratio increase： an intriguing role for methionine 35 [J]. BiochemBiophys Res Commun，2006，342（1）：206-213.
[21] Sun ZK，Yang HQ，Wang ZQ，et al. Erythropoietin prevents PC12 cells from beta-amyloid-induced apoptosis via PI3K/Akt pathway [J]. Transl Neurodegener，2012，1（1）：7-10.
[22] 郭家智，李燕玲，鐘蓮梅，等.白藜蘆醇調控癲癇持續狀態大鼠海馬內源性巰醇抗氧化劑（酶）的作用[J].解剖學報，2011，42（5）：582-587.
[23] Pernhorst K，Herms S，Hoffmann P，et al. TLR4，ATF-3 and IL8 inflammation mediator expression correlates with seizure frequency in human epileptic brain tissue [J]. Seizure the Journal of the British Epilepsy Association，2013，22（8）：675-678.
[24] Ashhab MU，Omran A，Kong H，et al. Expressions of tumor necrosis factor alpha and microRNA-155 in immature rat model of status epilepticus and children with mesial temporal lobe epilepsy [J]. Journal of Molecular Neuroscience，2013，51（3）：950-958.
[25] Nabbout R. Autoimmune and inflammatory epilepsies [J]. Epilepsia，2012，53（Suppl 4）：58-62.
[26] Wang SJ，Bo QY，Zhao XH，et al. Resveratrol pretreatment reduces early inflammatory responses induced by status epilepticus via mTOR signaling [J]. Brain Res，2012，1492：122-129
[27] Rao MS，Hattiangady B，Rai KS，et al. Strategies for promoting anti-seizure effects of hippocampal fetal cells grafted into the hippocampus of rats exhibiting chronic temporal lobe epilepsy [J]. Neurobiol Dis，2007，27（2）：111-132.
[28] Singleton RH，Yan HQ，Fellows-Mayle W，et al. Resveratrol attenuates behavioral impairments and reduces cortical and hippocampal loss in a rat controlled cortical impact model of traumatic brain injury [J]. Journal of Neurotrauma，2010，27（6）：1091-1099.
[29] Shin JA，Lee KE，Kim HS，et al. Acute resveratrol treatment modulates multiple signaling pathways in the ischemic brain [J]. Neurochem Res，2012，37（12）：2686-2696.
[30] Shetty AK. Promise of resveratrol for easing status epilepticus and epilepsy [J]. Pharmacology & Therapeutics，2011， 131（3）：269-286.
白藜蘆醇范文3
【關鍵詞】 虎杖 白藜蘆醇 微波輔助提取 正交實驗 紫外分光光度法
虎杖別名花斑竹、酸筒桿、酸桶筍、酸湯梗、川筋龍、斑杖根，為蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum，的干燥根莖和根。多生于山谷、溪旁或岸邊，分布在我國中部及南部。產于江西、福建、云南、四川、貴州等地。藥理作用：（1）對心血管系統的影響：強心擴血管作用；抑制血小板聚集、抗血栓；改善微循環、抗休克作用；降血脂；（2）對呼吸系統的影響：鎮咳、平喘作用；（3）對消化系統的影響：胃腸道作用、保肝用；（4）止血抗炎作用；（5）鎮靜作用；（6）修復損傷的DNA及保護大腦皮層神經元功能、對酶活性抑制作用、對內分泌的影響、對基因表達的影響、利尿作用等[1]。研究結果表明虎杖含有如下多種化學成分：含有大黃素、大黃素-6-甲醚、大黃素-8-單甲醚、大黃酚、大黃酸及蒽苷大黃素-6-甲醚-8-β-D-葡萄糖苷和大黃素-8-β-D-葡萄糖苷等[2]；含有白藜蘆醇和白藜蘆醇苷（虎杖苷）.其中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷為主要藥用成分。白藜蘆醇（3，4，5，-三羥基二苯乙烯；trans-resveratrol）是一種活性多酚物質，在虎杖、葡萄、花生、毛穗藜蘆、毛脈酸模等植物中存在[3]。白藜蘆醇的功能作用：首先，具有抗癌作用，可用于預防與治療慢性炎癥和癌癥。對腫瘤的起始、促進、發展三個階段均有抑制作用，可作為天然的化學防癌劑。其次，在心血管方面的作用。適量飲用葡萄酒有利于心血管健康的觀點已得到普遍認同。另外，白藜蘆醇還具有抗氧化、抗自由基，保護肝臟，抗菌，消炎，抗過敏等多種有益人體的功能作用[4]。目前，國內在白黎蘆醇的提取方面研究較多。一般是采用有機溶劑提取，如乙醇、甲醇、丙酮等，以丙酮提取率最高。提取方式有浸漬提取、回流提取、超聲提取等，硅膠柱層析或大孔吸附樹脂吸附分離的方法來提純白黎蘆醇；檢測多以高效液相色譜。本實驗以微波輔助提取，具有省時、方便等作用，微波輔助提取中藥有效成分具有選擇性好、提取純度高和高效快速的特點，已在中草藥化學成分提取方面得到廣泛應用。 有關虎杖中白藜蘆醇、白藜蘆醇苷和大黃素含量測定方法的研究報道較多，主要有分光光度法、膠束薄層色譜法、電化學發光法、高速逆流色譜法、高效液相色譜等[5-6]，其中以分光光度法最為簡單方便。本研究探討微波輔助提取虎杖中白藜蘆醇的工藝研究，并建立測定白藜蘆醇含量的紫外分光光度法，旨在為虎杖的藥理作用研究以及科學合理利用提供試驗依據。
1 實驗部分
1.1 原料、試劑與儀器
（1）實驗原料、試劑；虎杖，產地：福建三明； 95%乙醇；乙酸乙酯；石油醚；均為化學純；白藜蘆醇，產地：美國，分析純。（2）實驗儀器；TR-02型藥材粉碎機：（武義縣屹立工具有限公司）；LWMC-205型可調功率微波化學反應器 ：（南京陵江科技開發有限責任公司）；SHB-III循環水式多用真空泵：（鄭州長城科工貿有限公司）；UV-2550型紫外分光光度計：（廈門精藝興業科技有限公司）；FA1604N型電子天平：（上海精密科學儀器有限公司）；RE-52B旋轉蒸發儀：（上海博經經貿公司）；SYP智能型玻璃恒溫水浴鍋：（鞏義市予華儀器責任有限公司）；玻璃儀器氣流烘干器：（鞏義市予華儀器責任有限公司）722S-可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司。
1.2 分析方法
本方法采用紫外分光光度計在306.4nm出測量所提取液的吸光度。一定的波長下有吸收峰進行測定。白藜蘆醇的英文名Resveratrol簡寫RES，分子式C14H12O3，分子量228.25，無味、白色晶體難溶于水，易溶于乙醇，甲醇，丙酮等有機溶劑，本實驗以白藜蘆醇為對照品，以乙醇為溶劑，采用分光光度法在306.4nm波長下直接進行白藜蘆醇吸光度值的測定，從而分析計算其含量。
1.3 實驗步驟
（1）備料；把虎杖根莖烘干、把干凈的虎杖用粉碎機粉碎，過40目篩后放存儲瓶中備用。（2）配制溶液；分別配制45%、55%、65%、70%、75%、80%的乙醇溶液：乙酸乙酯：水為1：1的溶液。（3）供試品溶液制備；按照實驗方案準確稱取1.0g若干份虎杖根莖粉末，分別置于三角錐形瓶中，加入相應濃度和體積的乙醇浸泡6小時，置于微波化學反應器中按方案提供的條件提取，冷卻室溫后抽濾；加石油醚洗滌至上層清液為無色，濾液再用乙酸乙酯：水為1：1的溶液萃取3次（每次所用溶液為20ml），將萃取液轉入旋轉回流蒸發儀中，40℃水浴濃縮，樣品濃縮后，至于50ml容量瓶中加95%乙醇至刻度，搖勻，分別取2ml至25ml容量瓶中，加95%乙醇定容至刻度，搖勻，作為供試液備用。（4）微波輔助提取虎杖中白藜蘆醇及測定的工藝流程；虎杖根莖干燥粉碎烘干過篩（40目）按料液比浸漬微波提取冷卻石油醚洗滌1：1的乙酸乙酯：水溶液萃取旋轉回流蒸發儀（40℃水浴）蒸發定容（50mL容量瓶）移取2.00mL定容（25mL容量瓶）測定吸光值分析計算提取率。
1.4 標準曲線的繪制
（1）對照品溶液的制備；準確稱取白藜蘆醇標準品10.00mg至50mL容量瓶中，用無水乙醇配成濃度為0.2mg/mL的對照品溶液。（2）最大吸收波長的選擇；準確吸取對照品溶液0.3mL，置于10mL容量瓶中，加人95%乙醇定容，再取95%的乙醇溶液為空白對照液，及所制取的供試品溶液，將三種溶液用UV-2550型紫外分光光度計于波長為200——400nm范圍進行掃描。結果表明：供試品溶液及對照品溶液均在波長306.4nm處有最大吸收峰，因此選擇306.4nm為測定波長。（3）標準工作曲線：分別精確吸取0.2mg/mL的白藜蘆醇對照品溶液0.0mL、0.15mL、0.3mL、0.45mL、0.6mL、0.75ml、0.9ml置于10ml容量瓶中定容，同時以95%乙醇試劑空白對照，在306.4nm處測定吸光度。以白藜蘆醇標準溶液的濃度為橫坐標，測定的吸光度為縱坐標，作圖得到標準曲線，其回歸方程為：Y=0.1614X+0.0682， R=0.9991。本品在3.0μg～18.0μg/ml范圍內線性關系良好。結果見（圖1）。
1.5 微波輔助波提取虎杖白藜蘆醇的影響因素
微波時間：5—25min；微波功率：200W—600W；溶劑：不同濃度的乙醇（45%-80%）
料液比：1：15—1：35。
（1）微波輔助提取單因素實驗；準確稱取1.0g干燥的白藜蘆醇根莖粉末，用不同微波時間、微波功率、乙醇濃度、料液比分別進行單因素實驗。其中相同的提取條件分別是微波時間5min、微波功率400W、乙醇濃度70%、料液比1：25。（2）微波波提取正交優化實驗設計；實際操作中各因素相互交叉影響，為了全面考察影響因素，在單因素的基礎上，選取各單因素的較優條件，設計4因素3水平正交實驗L9（34），確定白藜蘆醇的最佳提取條件。
1.6 虎杖中白藜蘆醇提取量的計算方法
白藜蘆醇提取率：x（%）=（a×50×25/2m）/106
式中：x為樣品中白藜蘆醇的含量%；a為對應標準曲線上所對應的樣品中白藜蘆醇的質量（ug）；m為樣品的質量（g）。
2 結果分析與討論
2.1 虎杖中白藜蘆醇提取的單因素實驗
（1）料液比的選擇；料液比即提取過程中原料與提取溶劑的比例（為便于換算，使用質量w/體積v）。料液比對提取過程的影響主要體現在相同的提取條件下，白藜蘆醇等化合物的溶解度一定，此時若增大提取溶劑，則溶解的化合物的量也增大。理論上，在原料一定時，提取溶劑增大，三萜類化合物的浸出量增大；但提取溶劑并非能無限增大，若提取溶劑用量太大，一方面回收溶劑的成本增加，另一方面提取過程加熱的能耗增加。為尋求最佳的料液比，本實驗考察在70%乙醇﹣水體系，微波功率為400W、微波提取時間為5min，不同料液比條件下白藜蘆醇的提取率，結果見圖2所示。
（2）乙醇濃度的選擇；白藜蘆醇是多酚化合物，主要來源于蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的根莖提取物。白藜蘆醇為無味的白色晶體；難溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑。考慮到甲醇和丙酮的毒性和揮發性，所以本實驗采用乙醇-水為溶劑，根據相似相容原理，調節乙醇水比例，使其極性與白藜蘆醇相近，從而使得白藜蘆醇在提取溶劑中達到最大溶解度。在乙醇﹣水體系下，微波功率為400W、微波提取時間為5min、料液比1∶25，三萜類化合物的提取率見圖3。結果表明隨乙醇體積分數的增大，提取率增大，濃度增大有利于增大白藜蘆醇的溶解度，當達到一定程度時提取率不再增大，所以選擇乙醇濃度70%為最佳濃度。
（3）微波提取時間的影響；白藜蘆醇從虎杖的根莖中溶解到溶劑中是需要一定的時間，當破碎的細胞中的白藜蘆醇溶于溶劑中后，采用微波直接作用于虎杖根莖分子，使細胞破裂是需要一定的時間，時間的長短可能決定著虎杖根莖細胞的破裂程度，從而影響虎杖中白藜蘆醇的提取率。為尋找最佳微波提取時間，在微波功率為400W時，料液比1∶25，乙醇濃度70%的條件下，按不同微波提取時間進行提取實驗，結果如（圖4）。
（圖4）表明提取率隨時間的延長而增大，當提取時間到達15min后，隨著微波時間的延長，提取率增大的不明顯或已經停止增長，說明15min時提取率已經達到最大值，所以采取15min為最佳微波時間。
（4）微波功率的影響；粉碎至一定粒度后的藥材，一部分虎杖根莖細胞可能會碎裂，其中所含的白藜蘆醇可直接被溶劑萃取而轉入溶劑中，溶劑與虎杖根莖粉末固體之間的浸泡過程，溶劑不斷向固體內部擴散，在細胞內溶解白藜蘆醇。當破碎的細胞中的白藜蘆醇溶于溶劑中后，采用微波可直接作用于虎杖根莖分子，使分子的熱運動加劇，從而引起溫度升高，這種熱效應可以快速破壞細胞壁，使虎杖中的白藜蘆醇有效成分更快的分離提取出來，為尋找最佳微波功率，在微波時間為5min時，料液比1∶25，乙醇濃度70%的條件下，按不同微波功率進行提取實驗，結果如（圖5）。
（圖5）表明提取率隨微波功率而增大，但不是很明顯，當達到500W時就已經達到了最大提取率，為節約能源的消耗，只需取500W就為最佳提取功率。
2.2 微波輔助波提取虎杖白藜蘆醇的正交優化
（1）因素水平；試驗選擇以下4個因素：微波時間（A）、微波功率（B）、乙醇濃度 （C）、料液比（D）作為考察對象，每個因素取3個水平（表1），以提取物中白藜蘆醇含量為評價指標，采用L9（34）正交表進行正交試驗設計。
（2）正交實驗方案與結果（見表2）.
（3）極差分析；由（表2）的極差計算結果得出，影響虎杖白藜蘆醇提取率的因素主次順序為A>C>D>B，即微波輔助時間對試驗結果影響最大，乙醇濃度、料液比影響次之，微波功率影響最小。最佳提取工藝條件應為A2 B3 C2 D3因而，微波輔助波優選提取虎杖白藜蘆醇的最佳工藝條件實際為：微波輔助作用時間15min，以70%的乙醇為提取劑，料液比1：30，微波輔助功率為500W。因最佳組合不在試驗設計中，須做驗證試驗。
2.3 驗證實驗
為了驗證優化計算結果的可靠性，選微波輔助作用時間15min以70%的乙醇為提取劑，料液比1：30，微波輔助功率為500W進行驗證實驗，平行做3組，計算得平均提取率為0.750%，雖然比試驗中的最大提取率第4組只大一點，但由于微波功率的影響最小，所以在此條件下的確實確實優于其他條件，為最佳條件。
3 結語
（1）以70%乙醇水體系為白藜蘆醇的提取溶劑，溶解度大，無毒而且溶劑回收容易，價格低廉對工業生產具有成本優勢。（2）正交實驗結果能驗證單因素實驗，各因素對白藜蘆醇提取率影響程度大小依次為：微波輔助作用時間>乙醇濃度>料液比>微波輔助功率，同時能得到最佳的提取參數范圍。在最佳提取參數范圍取一組參數結果讓人滿意，最佳提取工藝參數為：微波輔助作用時間15min以70%的乙醇為提取劑，料液比1：30，微波輔助功率為500W，在該條件下，白藜蘆醇的提取率為0.750%，關于虎杖中微波輔助提取白藜蘆醇并測定其含量的報到相比，本實驗方案采用的溶劑無毒、低成本、方法簡單、檢測采用分光光度法操作方便，且的到的提取率高，這是本文的獨特之處。（3） 微波輔助波與傳統的醇溶劑浸提法相比，操作時間明顯縮短，能達到降低成本、省時、高效、節能、減少污染的目的。
參考文獻：
[1]劉樹興，程麗英.虎杖有效成份的開發現狀及展望.中國食品添加劑，2004，（6）：80-82.
[2]裴蓮花，吳學，金光洙.虎杖化學成分及藥理作用研究現狀.延邊大學醫學學報.2006，29（02）：147-149.
[3]孟昭仁，奚洪民，劉進幫.白藜蘆醇的提取和純化及分析方法研究進展.化學世界.2002，（10）：511-513.
[4]張驊，綜述，劉琨審校.虎杖臨床應用研究進展.臨床肺科雜志.2007，12（01）：62-63.
白藜蘆醇范文4
關鍵詞：白藜蘆醇;細胞自噬;腫瘤;凋亡
1通過抑制Wnt/β-catenin信號通路，白藜蘆醇抑制乳腺癌干細胞樣細胞（BCSCs）增殖和誘發細胞自噬[1]。天然多酚類化合物白藜蘆醇，大量存在于植物性食物，其抗癌特性已被廣泛的研究。考慮到癌癥干細胞在乳腺腫瘤發生和進展中的重要作用，白藜蘆醇對腫瘤干細胞的影響是值得研究。白藜蘆醇顯著抑制BCSCs的增殖，和減少了BCSCs的百分比，因此在非粘著球狀群中，減少了乳腺球的大小和數量。因此， 給NOD / SCID小鼠（不肥胖的糖尿病/嚴重聯合免疫缺陷）注射白藜蘆醇（100毫克/公斤/天）有效地抑制移植腫瘤的生長和在腫瘤細胞減少BCSC。原發腫瘤細胞再植入二級老鼠30 d后，6個對照組都產生腫瘤，而用來源于白藜蘆醇處理老鼠腫瘤細胞植入6只老鼠只有1只產生腫瘤。進一步，通過TEM（透射電子顯微鏡） 分析 puncta LC3-II形成，用免疫印跡分析GFP-LC3-II，Beclin1和Atg 7，表明白藜蘆醇誘發BCSCs自噬。此外，白藜蘆醇在BCSCs中，抑制了Wnt /β-catenin信號途徑;通過轉染質粒過表達的β-catenin明顯減少了白藜蘆醇誘導的細胞毒性和BCSCs的自噬。我們的研究結果表明， 通過抑制Wnt /β-catenin信號通路，白藜蘆醇抑制BCSCs增殖并誘發細胞自噬。
2 白藜蘆醇引起人K562凋亡、紅系分化和自噬[2]。白藜蘆醇（Res）是一種天然植物抗毒素具有促白血病細胞凋亡和誘導球蛋白的作用，但它潛在的誘導紅系細胞分化的作用并不完全理解。在這里，我們調查了白藜蘆醇對人類紅系巨核細胞白血病細胞系K562 的影響。在處理細胞中， 抑制了細胞增殖，發生了細胞凋亡和細胞死亡。通過紅系細胞實驗，我們發現Res可能增加了血型糖蛋白的表達（GPA），HBA1、HBB，和γ-globin基因的表達并且加強了GPA，CD71，Band3蛋白質的表達。當Res的濃度增加了50或100μM時，Res也誘導K562細胞自噬。我們的研究結果表明，Res不僅能誘導凋亡也能誘導紅細胞分化和K562細胞自噬。這些結果認為Res可能是治療慢性粒細胞性白血病治療候選人。
3白藜蘆醇誘導的自噬抑制α-MSH引起的黑色素生成[3]。自噬通過自噬小體和溶酶體的協同作用降解細胞組件和細胞器。盡管自噬主要調節細胞組件的更新，但是自噬在黑素原生成上的作用還沒有得到很好的解決。在這里，我們表明， 抑制自噬會進一步抑制白藜蘆醇（RSV）的抗黑素原生成的活性，白藜蘆醇是一個著名的抗黑素原生成藥物。白藜蘆醇能夠強烈地增加黑色素細胞的自噬。然而，在黑色素細胞中，ATG5的損耗顯著抑制了白藜蘆醇介導的黑素原生成以及白藜蘆醇誘導的細胞自噬。此外，在α-MSH處理的細胞中，白藜蘆醇可下調酪氨酸酶和TRP1。然而抑制ATG5恢復了酪氨酸酶和TRP1的水平。最重要的是，電子顯微鏡分析表明，α-MSH和白藜蘆醇聯合處理細胞后，自噬體吞噬了黑色素或黑素體。總的來說，這些結果表明白藜蘆醇介導的自噬調節黑素原生成。
4白藜蘆醇抑制人鼻咽癌細胞內質網擴展和內質網天冬氨酰酶介導的凋亡[4]。自噬和內質網（ER）應激反應對腫瘤細胞保持惡性腫瘤和抵抗治療是重要的。在人類鼻咽癌（NPC）細胞，白藜蘆醇，非黃酮類藥物，可以誘導細胞凋亡。在這項研究中，將探究腫瘤特異性的ER應激反應和自噬在白藜蘆醇介導的細胞凋亡中的作用。透射電子顯微鏡（TEM）的圖像表示，白藜蘆醇明顯增加了自噬小體的尺寸，新月形的單層膜的液泡包含多薄片狀膜結構也增多。延長白藜蘆醇處理時間會引起ER膨脹的大量積累。使用EGFP-LC3B轉染和激光共聚焦顯微鏡的方法，我們發現了白藜蘆醇誘導的用內質網跟蹤紅素共定位的EGFP-LC3 斑點，暗示LC3II參與了ER擴張。用ATG7的siRNA抑制自噬或用bafilomycin A1阻斷自噬流，白藜蘆醇的促凋亡效應被增強，但那用siRNA有針對性的沉默IRE1和CHOP后白藜蘆醇的促凋亡效應沒有改變。使用半胱天冬酶抑制劑，我們了證實了ucasp12的上調和casp4的激活與白藜蘆醇誘導的促凋亡相關，通過caspase-9 / caspase-3途徑。有趣的是，casp12的敲出，但不敲出caspase-4，減弱了NPC細胞對白藜蘆醇介導的細胞凋亡的敏感性。此外，我們表明，白藜蘆醇加了神經酰胺，且存在劑量依賴。使用絲氨酸棕櫚先轉移酶 （SPT，新創神經酰胺的生物合成的關鍵酶）的抑制劑（L-cycloserine和myriocin），我們發現神經酰胺積累的增加與白藜蘆醇的促細胞凋亡的作用密切相關。本研究揭示了ER的擴張和ER casp12的一起上調可能表明白藜蘆醇具有深遠的生物效應和促進NPC細胞死亡。針對ER應激的不同狀態可能會提供一個合理的癌癥治療策略。
5葡萄種子提取物和白藜蘆醇通過AMPK活化和相關的生物反應抑制4-硝基喹啉氧化物引起小鼠的口腔癌變[5]。對口腔癌變的預防措施是迫切需要來保證降低全球性的惡性腫瘤相關的高發病率和死亡率。在這里，我們調查了，在4-nitroquinoline-1-oxide（4NQO）引起舌頭腫瘤C57BL / 6小鼠體內，葡萄籽提取物（GSE）和白藜蘆醇（Res） 的化學預防療效。用4 nqo處理老鼠8周，用ain - 76飲食或飲食含有0.2% GSE Res（w / w）或0.25%（w / w）處理隨后的8周，同時用4 nqo處理老鼠。在16周終止研究，對舌頭做組織結構上的評估，增生，組織發育不良，狀病變。然后用免疫組織化學分析分子靶點。GSE和Res喂養8周，雖然只是適度減少發病率，但明顯阻止了4 nqo誘導的腫瘤出現前的腫瘤病灶的多重性和嚴重性，沒有任何明顯的毒性。在4 nqo + GSE和4 nqo + Res處理組老鼠舌組織降低了擴散 （BrdU標記指數），但增加了凋亡（TUNEL-positive細胞）相對去4 nqo組。此外，舌組織4 nqo + GSE和4 nqo + Res組顯示增加了激活的代謝調控子phospho-AMPK（Thr172）和減少了自噬通流標志p62。這些發現表明，GSE和Res通過調制AMPK活化可以有效防止4 nqo誘導的口腔腫瘤發生，從而，抑制擴散和誘導凋亡和自噬。
6硫代物為白藜蘆醇生成提供了胞內池并引起腫瘤細胞衰老和自噬[6]。臨床前研究表明植物化學分成白藜蘆醇可以產生許多有益健康的好處，但白藜蘆醇快速的新陳代謝和低的生物利用度可能會限制他的應用。白藜蘆醇代謝物可能促進體內化合物的再生活動。我們分別用硫酸和葡糖苷酸偶聯白藜蘆醇來定量在人血漿和組織中的白藜蘆醇。志愿者和癌癥患者重復攝入白藜蘆醇。隨后用resveratrol-3-O-sulfate和resveratrol-4 -O-sulfate喂養小鼠，這些代謝物口服吸收，但生物利用度分別只有14%和3%。體內硫酸水解釋放的自由白藜蘆醇，占老鼠血漿白藜蘆醇總數的約2%。單硫酸酯代謝物能也轉入人類大腸細胞。細胞吸收的程度依賴于特定的膜轉運蛋白和抗增殖活動決定。硫酸代謝物誘導自噬和人類腫瘤細胞衰老; 硫酸酯酶抑制劑可廢除這些影響包含，并且減少細胞內白藜蘆醇。綜合在一起，我們的研究表明，白藜蘆醇是以穩定sulfate-conjugated形式被送到目標組織和在特定的細胞中化合物是逐漸地再生和這種模式可能使白藜蘆醇產生有益的影響。
7白藜蘆醇依賴Ca（2+）/AMPK/mTOR途徑誘導人肺癌A549細胞自噬性死亡[7]。白藜蘆醇有許多生物效應，包括抗腫瘤、抗病毒，和保護血管。最近的研究表明，白藜蘆醇通過誘導自噬發揮抗腫瘤效應， 但是其機制還是未知的。在這項研究中，我們調查了在人類肺癌A549細胞，自噬參與白藜蘆醇誘導細胞死亡過程中的作用和其潛在的分子機制。用MTT和克隆實驗來分析評估白藜蘆醇引起的生長抑制和細胞死亡。用自噬用磺酰尸胺，透射電子顯微鏡，自噬標記蛋白LC3的表達來檢驗自噬的激活。免疫印跡分析用于研究細胞自噬引起死亡的相關信號通路。用Fura2-AM染色檢測細胞內自由鈣。我們的研究結果表明，白藜蘆醇誘導A549細胞死亡是由自噬介導的。自噬抑制劑3-methyladenine，抑制了白藜蘆醇誘導的細胞自噬死亡。用siRNAs抑制自噬相關基因Atg5和Beclin-1 的表達，逆轉了白藜蘆醇誘導細胞死亡。白藜蘆醇的實施立即導致細胞內自由鈣的積累。自由鈣的積累導致phospho-AMPK和phospho-Raptor的激活和phospho-p70S6數量的減少。AMPK抑制劑和鈣離子螯合物可以逆轉這些影響。總之，我們證明白藜蘆醇通過Ca（2 +）/ AMPK-mTOR細胞自噬死亡信號途徑，誘導A549細胞死亡。
8白藜蘆醇在宮頸瘤中通過凋亡和自噬引起細胞死亡[8]。宮頸腫瘤是女性最常見的癌癥之一，與高危人瘤病毒（HPV）感染有關。天然多酚的化學物質白藜蘆醇， 基于他有可能作為化療藥物來治療癌癥已經引起了人們相當大的興趣。這項工作中，我們在幾種宮頸癌細胞系中，分析了白藜蘆醇誘導細胞死亡的類型。白藜蘆醇 （150 - 250年？mol / l）處理C33A（p53突變）和海拉細胞（HPV18陽性），以及在CaSki SiHa細胞系（HPV16陽性）48 h增加了停留在G1期周的細胞。Annexin-V流式細胞術分析，在所有的細胞系中，白藜蘆醇誘導了細胞凋亡，，尤其是在CaSki細胞。HeLa，，CaSki，SiHa細胞線粒體膜電位下降（凋亡）和C33A，CaLo（HPV18陽性），和Hela細胞系溶酶體滲透率增加（自噬）。此外，當我們使用IC50 of each line，我們發現白藜蘆醇產生了類似的效果，表明這種作用不依賴于白藜蘆醇濃度。有趣的是，白藜蘆醇處理后， HPV18陽性細胞系（CaLo和hela）p53的表達減少，然而HPV16陽性細胞系（CaSki和SiHa）和C33A細胞p53的表達卻增加。在除了SiHa細胞系外所有細胞，p65的表達（一個NF-κB亞基）下降。這些數據表明， 在來自宮頸癌的細胞系中，白藜蘆醇通過不同的機制來誘導細胞死亡。
9白藜蘆醇可以通過激活自噬，衰老或有絲分裂災難導致活細胞死亡[8]。在工業化國家癌癥的死亡率和發病率的最大原因。在天然產物的藥物化學領域，大量研究報道反式白藜蘆醇作為化學預防藥物的有趣屬性，能夠對抗對癌癥、炎癥和病毒感染。腫瘤生長抑制與白藜蘆醇聯系在一起能夠停滯細胞周期的進程和觸發細胞死亡。本文綜述集中闡述白藜蘆醇誘導的細胞死亡的途徑。白藜蘆醇能夠影響線粒體功能 （呼吸鏈、腫瘤蛋白、基因表達等），這些過程涉及到p53蛋白的磷酸化和乙酰化的形成。白藜蘆醇也影響死亡受體的分布，在神經酰胺豐富的膜平臺上捕獲并聚集受體分子，并在細胞中促進形成死亡誘導信號復合體。對于誘導細胞凋亡，白藜蘆醇能激活神經酰胺/鞘磷脂途徑，促進神經酰胺的生成和下游級聯激酶激活。白藜蘆醇可以通過激自噬，衰老或有絲分裂災難導致活細胞死亡等。此外，之前已有無數人嘗試用白藜蘆醇類似物來提高分子阻止細胞增殖和誘導細胞死亡的能力。此外， 天然酚類物質結構上的修飾有望產生有用的類似物，來研究構效關系。最后，在各種癌癥類型，白藜蘆醇的行為作為一個化療增強劑降低細胞對典型的抗癌劑的死亡閾值和抵消腫瘤細胞藥物抗性。
10白藜蘆醇在人肝癌Huh-7細胞株中引起細胞周期停滯和促進細胞凋亡[6]。白藜蘆醇已被證明具有抗癌，抗衰老，抗炎，抗菌，保護神經活性。在本研究中，我們在一個新的人類肝癌細胞株丙型肝炎病毒的系統Huh-7細胞中，研究了白藜蘆醇的抗增殖特性及其分子機制。結果表明，白藜蘆醇顯著抑制Huh-7細胞增殖（50%抑制濃度= 22.4μg /毫升）和有效地誘導細胞周期阻滯和細胞凋亡。它上調了p21 / WAF1 的表達，但細胞周期蛋白E、細胞周期蛋白A和周期蛋白依賴性激酶2的表達被抑制。白藜蘆醇也增加了促凋亡/抗凋亡蛋白的比例，這與線粒體膜去極化和半胱天冬酶活性的增加有關。白藜蘆醇對Fas ，Fas配體，細胞外信號調節激酶1/2（ERK1/2）和P38的表達沒有影響，但減少了磷酸化ERK 和p38的表達。此外，發現白藜蘆醇通過增加自噬相關蛋白Atg5，Atg7，Atg9，Atg12蛋白質，引發自噬性細胞死亡。這些結果表明，白藜蘆醇可能是丙型肝炎病毒感染肝癌的重要化學預防劑。
11白藜蘆醇通過AMPK- 和 p62/SQSTM1依賴的自噬性的慢性粒細胞白血病細胞死亡[7]。白藜蘆醇（RSV）是一個有吸引力的治療癌癥的候選人，因為它具有干預AMPK / mTOR途徑各級水平的能力。事實上，RSV是獨一無二的，它可以抑制mTOR和S6并且可以激活AMPK。我們的最近的數據表明，RSV引發了自噬性的細胞死亡（ACD），在慢性粒細胞性白血病（CML）細胞中，通過活化AMPK和JNK介導的 p62 / SQSTM1表達。在這里我們將討論白藜蘆醇如何調控CML細胞的ACD，也將探討白藜蘆醇通過AMPK/mTOR和 JNK/p62通路，抗CML和其他造血惡性腫瘤的可能性。
12白藜蘆醇引起U373神經膠質細胞瘤中自噬[6]。在真核生物中，自噬是一種細胞內蛋白質運輸過程，導致細胞器和長時間使用的蛋白質降解。自噬的下調與腫瘤發展相關。這項研究調查了在人類神經膠質瘤細胞中，天然化合物白藜蘆醇誘導的自噬，。神經膠質瘤細用白藜蘆醇處理，對細胞生長和自噬水平進行評估。白藜蘆醇抑制了U373神經膠質瘤細胞的生長和誘導細胞死亡。白藜蘆醇處理后，神經膠質瘤細胞穩定表達GFP融合LC3，細胞產生了更多GFP-LC3-labeled自噬小體，含有GFP-LC3-labeled自噬小體細胞的百分比增加。此外，在白藜蘆醇處理的神經膠質瘤細胞種， 用P38或ERK1/2抑制劑預處理，減少了自噬水平，這表明白藜蘆醇誘導的自噬被P38和ERK1/2途徑調控。Akt/ mTOR途徑與白藜蘆醇誘導的自噬無關。我們的研究結果表明， 通過誘導自噬白，藜蘆醇對神經膠質瘤細胞具有抗癌效果。
參考文獻：
1. Fu Y， Chang H， Peng X， Bai Q， Yi L， Zhou Y， Zhu J， Mi M. Resveratrol inhibits breast cancer stem-like cells and induces autophagy via suppressing Wnt/β-catenin signaling pathway. PLoS One. 2014;9（7）：e102535
2. Yan HW， Hu WX， Zhang JY， Wang Y， Xia K， Peng MY， Liu J. Resveratrol induces human K562 cell apoptosis， erythroid differentiation， and autophagy. Tumour Biol. 2014;35（6）：5381-8
3. Kim ES， Chang H， Choi H， Shin JH， Park SJ， Jo YK， Choi ES， Baek SY， Kim BG， Chang JW， Kim JC， Cho DH. Autophagy induced by resveratrol suppresses α-MSH-induced melanogenesis. Exp Dermatol. 2014;23（3）：204-6
4. Chow SE， Kao CH， Liu YT， Cheng ML， Yang YW， Huang YK， Hsu CC， Wang JS. Resveratrol induced ER expansion and ER caspase-mediated apoptosis in human nasopharyngeal carcinoma cells. Apoptosis. 2014;19（3）：527-41
5. Shrotriya S， Tyagi A， Deep G， Orlicky DJ， Wisell J， Wang XJ， Sclafani RA， Agarwal R， Agarwal C. Grape seed extract and resveratrol prevent 4-nitroquinoline 1-oxide induced oral tumorigenesis in mice by modulating AMPK activation and associated biological responses. Mol Carcinog. 2013 Nov 14. doi： 10.1002/mc.22099
6. Patel KR， Andreadi C， Britton RG， Horner-Glister E， Karmokar A， Sale S， Brown VA， Brenner DE， Singh R， Steward WP， Gescher AJ， Brown K. Sulfate metabolites provide an intracellular pool for resveratrol generation and induce autophagy with senescence. Sci Transl Med. 2013;5（205）：205ra133
白藜蘆醇范文5
[關鍵詞]白藜蘆醇;模擬日光照射;紅斑;表皮厚度;日曬傷細胞
[中圖分類號] [文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)09-1306-03
Protective effects of resveratrol on solar simulator ultraviolet irradiation induced photodamage
JIA Li-li1,2, LI Yuan-hong1, WU Yan1, ZHENG Ying-na1, GAO Xing-hua1
(1.Department of Dermatology, the First Hospital of China Medical University, Key Laboratory of Immunodermatology, Ministry of Health,China Medical University,Shenyang 110001, Liaoning China; 2. Department of Dermatology, the Fourth Hospital of Jilin University)
Abstract:ObjectiveTo investigate the protective effects of resveratrol on the back skin irradiated by solar simulator ultraviolet irradiation (ssUVR). Materials and methods Eleven healthy female volunteers were enrolled in this study. Six sites on the non-exposed back skin were marked for the experiment. Sites 1～4 were applied with resveratrol(Res)+antioxidant(Aox), antioxidant, resveratrol, vehicle, and followed by ssUVR at a dosage of 1.5 minimal erythema dose(MED) 30min later. Site 5 received ssUVR but without any test materials(positive control)and site 6 received neither ssUVR nor test materials (negative control). The subjects exposure to ssUVR once a day for 4 days.EI value were assessed pre- and after-irradiation. The skin biopsies were taken 24 hours after the last ssUVR. The specimens were stained with hematoxylin eosin (HE) staining. epidermal thickness (ET) was measured and the number of sunburn cell (SC) was counted under the microscope. ResultsOn negative control site, no erythema and sunburn cell (SC) was observed and EI value , epidermal thickness (ET) were 194.81 and 69.25 respectively.On positive control and Vehicle+UV sites, obvious erythema was developed, EI values,ET & SC significantly increased to 432.09,123.75 and 20.38 respectively. Whereas on Res+Aox+UV site, only slightest erythema was seen, EI value,ET and SCreached 335.42, 91.25 and 9.13 respectively, with the least changes comparing to other irradiated sites(P
Key words:resveratrol; solar simulator ultraviolet irradiation; erythema
紫外線(ultraviolet, UV)照射可引起皮膚紅斑、水腫、色素沉著,日曬傷細胞形成,免疫抑制,甚至皮膚癌等[1]。研究表明白藜蘆醇具有抗炎,抗氧化,抑制血小板聚集,以及抑制各種癌細胞生長等多種生理功能[2]。本研究旨在觀察白藜蘆醇對模擬日光照射(solar simulator ultraviolet irradiation, ssUVR)誘導的急性光損傷的是否具有保護作用。
1材料和方法
1.1 志愿者:招募11名健康女性志愿者,每位志愿者均簽署了知情同意書。年齡45～58歲。入選標準:無系統性疾病或皮膚病;未接受系統性治療或皮膚局部治療;無光敏史;非妊娠或哺乳婦女。試驗于2009年1～2月(北方冬季)進行,以盡量減少外界環境中紫外線的影響[3]。
1.2 試驗材料:白藜蘆醇+抗氧化劑、抗氧化劑、白藜蘆醇、基質均由雅詩蘭黛公司(美國紐約)提供。基質霜為保濕霜,不含防曬劑,SPF值
1.3 實驗儀器:日光模擬器(GS2006 3.0E版,中國計量科學研究院,北京),氙燈光源,可發射出15倍太陽強度的模擬日光。窄波段反射分光光度計(Mexameter MX18),測量皮膚erythema index(EI)值,每個部位測三次,取平均值。
1.4 方法
1.4.1 試驗開始前測定每位志愿者最小紅斑量(minimal erythema dose,MED)[4]。
1.4.2 在志愿者背部6個部位進行如下操作:部位1～4分別涂抹白藜蘆醇+抗氧化劑、抗氧化劑、白藜蘆醇、基質半小時后予1.5倍MED的ssUVR,部位5僅予照射而不涂抹試驗樣品(陽性對照),部位6既不照射亦不涂抹試驗樣品(陰性對照)。詳見表1。各照光部位每日照射1次,連續照射4天。
1.4.3 試驗開始前和末次照射結束后測定EI值。
1.4.4 末次照射后24h對受試部位皮膚進行取材,行HE染色,用測微尺測量表皮厚度并進行日曬傷細胞計數。
1.5 數據處理:EI差值=末次照射后EI值-試驗開始前EI值
1.6 統計學分析:采用16.0版SPSS軟件包進行統計學分析。各組間數據比較采用方差分析。P
2結果
2.1 EI值:EI值反映皮膚的紅斑程度。試驗前6個部位EI值波動于184.15～200之間,差異無統計學意義(P>0.05)。研究結束時,5個照光部位EI值均顯著升高:以部位4及部位5升高尤為顯著,由治療前的200及189.57分別升至419.21及432.09;而部位1升高最少,由治療前的195.36升至335.42。部位1與部位4、5相比,EI差值的差異具有統計學意義(P
2.2 表皮厚度:表皮厚度反映皮膚的水腫程度。連續照射4次后,所有照光部位的表皮不同程度增厚。以部位4、5增厚最為顯著,而部位1、2、3表皮輕度增厚,與部位4、5相比具有統計學差異(P
2.3 日曬傷細胞:部位6為正常皮膚,無日曬傷細胞(胞核固縮,胞質粉染)。連續照射4次后,所有照光部位均有日曬傷細胞形成。部位4、5的日曬傷細胞最多,而部位1、2、3的日曬傷細胞相對較少,與部位4、5相比具有統計學差異(P
3討論
白藜蘆醇是植物界分布較廣的羥基二苯乙烯類化合物,在新鮮葡萄皮中的含量最高[5]。唐樺等[6]研究發現,不同濃度的白藜蘆醇對正常HaCaT細胞增殖無明顯影響。白藜蘆醇在體外對UAB 照射后的HaCaT細胞有保護作用,其機制可能與提高氧化酶活性、清除自由基有關。Afaq F等[7]表明白藜蘆醇能抑制UVB誘導的皮膚炎癥和水腫。
本研究觀察了白藜蘆醇對模擬日光照射誘導的皮膚急性光損傷的保護作用。研究結果顯示各照光部位EI值均不同程度升高。由于EI值反映皮膚的紅斑情況,可間接反映皮膚中血紅素的含量,因而EI值可用于皮膚顏色的定量分析。EI越大則皮膚越紅。經模擬日光照射后,未抹任檢測何物質的陽性對照部位及僅涂抹基質的照光部位出現了明顯的紅斑,EI值顯著升高,提示光照誘發皮膚顯著變紅。單獨涂抹抗氧化劑或白藜蘆醇部位紅斑較輕, EI 值上升幅度均較上述部位輕,提示上述兩種物質分別可一定程度地減輕ssUVR引起的皮膚紅斑;白藜蘆醇和抗氧化劑聯合外涂部位紅斑最輕,EI值升高程度顯著低于其它照光部位,提示白藜蘆醇聯合抗氧化劑能有效地保護急性ssUVR引起的皮膚紅斑。
紫外線照射后,皮膚的最初反應為血管擴張,表現為皮膚紅斑和水腫[8]。表皮厚度可以反應皮膚的水腫程度。Roy等[9]發現用2倍最小紅斑量的模擬日光照射皮膚,可引起皮膚厚度增加。本研究的病理結果顯示,在所有照光部位表皮均不同程度增厚,其中陽性對照部位和僅涂抹基質部位表皮增厚最為顯著,而涂抹白藜蘆醇聯合抗氧化劑和僅單獨涂抹白藜蘆醇或抗氧化劑的部位表皮輕微增厚,提示聯合外用白藜蘆醇和抗氧化劑或單獨外用二者之一均能有效地保護模擬日光照射誘發的表皮水腫。
紫外線照射能增加氧自由基的生成,而氧自由基能引起DNA損傷,角質形成細胞凋亡。日曬傷細胞是典型的凋亡的角質形成細胞,表現為胞核固縮,胞質嗜酸性[10]。研究表明紫外線照射的最嚴重后果是表皮中日曬傷細胞形成[11]。本研究結果顯示,經過1.5最小紅斑量的模擬日光連續照射4次后,各照光部位均有不同數量的日曬傷細胞形成,其中陽性對照部位和僅涂抹基質部位日曬傷細胞數量最多,而涂抹白藜蘆醇聯合抗氧化劑和僅單獨涂抹白藜蘆醇或抗氧化劑的部位日曬傷細胞數量相對較少,提示聯合外用白藜蘆醇和抗氧化劑或單獨外用二者之一均能有效地保護模擬日光照射誘導的日曬傷細胞形成。
4結論
單獨外用白藜蘆醇或抗氧化劑對模擬日光照射引起的急性的光損傷具有一定保護作用,當二者聯合外用時保護作用更強。
[參考文獻]
[1]Afaq F,Mukhtar H. Botanical antioxidants in the prevention of photocarcinogenesis and photoaging[J]. Exp Dermatol,2006,15:678-684.
[2]Mohammad Athar,Jung Ho Back,Xiuwei Tang,et al. Resveratrol: A review of pre-clinical studies for human cancer prevention[J]. Toxicol Appl Pharmacol,2007 November 1,224(3):274-283.
[3]Fitzpatrick TB. The validity and practicality of sun-reactive skin types Ⅰ through Ⅵ[J]. Arch Dermatol,1988,124:869-871.
[4]Farr PM,Diffey BL. Quantitative studies on cutaneous erythema induced by ultraviolet radiation[J]. Br J Dermatol,1984,111(6):673-682.
[5]劉芳,曲極冰,李紅,等.白藜蘆醇抗炎作用機制的初步研究[J].中國藥學雜志,2006,41(15):1138-1141.
[6]唐樺,孫磊,謝紅付,等. 白藜蘆醇對中波紫外線照射后人角質形成細胞的保護作用[J].中藥新藥與臨床藥理,2007,18(3):197-200.
[7]Afaq F,Adhami VM,Ahmad N. Prevention of short-term ultraviolet B radiation-mediated damages by resveratrol in SKH-1 hairless mice[J]. Toxicol Appl Pharmacol,2003,186: 28-37.
[8]Gavin JC,Geoffrey WD,Muller HK. Ultraviolet light induced injury: Immunological and inflammatory effects[J]. Immunolog Cell Biolog,2001,79: 547-568.
[9]Roy AP,John LMH, Anthony RY,et al. Theeffect of solar-simulated radiation on the elicitation phase of contact hypersensitivity does not differ between controls and patients with polymorphic light eruption[J]. J Invest Dermatol, 2005,124:1308 -1312.
[10]Cohen JJ. Apoptosis[J].Immunol Today,1993,14(3):126-130.
白藜蘆醇范文6
目的：探討白藜蘆醇（resveratrol， Res）體內外抗白血病作用的分子機制。
方法：采用HuT78、Jurkat和L1210 3種白血病細胞株，不同濃度Res作用不同時間后，應用甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium， MTT）比色法檢測細胞增殖情況，流式細胞儀檢測細胞凋亡，蛋白印跡法檢測Bcl2和Bax蛋白表達，免疫沉淀法檢測信號轉導子和轉錄激活子（signal transducers and activators of transcription，STAT）3及其磷酸化活性（phosphoTyr705STAT3， pSTAT3）。BALB/c小鼠隨機分為模型組和12.5、25、50 mg/(kg·d) Res組，皮下注射L1210細胞建立白血病模型。逆轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcriptionpolymerase chain reaction， RTPCR）檢測各組白血病小鼠外周血T淋巴細胞白細胞介素6（interleukin6， IL6）基因表達，流式細胞儀檢測IL6蛋白分泌，免疫組織化學法和蛋白印跡法檢測肝臟活性pSTAT3蛋白表達。
結果：Res能抑制白血病細胞HuT78、Jurkat、L1210的生長增殖，誘導細胞凋亡，同時明顯下調Bcl2/Bax比值、降低活性pSTAT3的蛋白表達；Res還能夠劑量依賴地下調白血病小鼠外周血T淋巴細胞IL6 mRNA表達及其胞內分泌，同時降低小鼠肝組織中活性pSTAT3蛋白表達水平。
結論：Res體內外均具有明顯的抗白血病效應，其作用機制可能與其對IL6及pSTAT3的影響有關。
【關鍵詞】 白藜蘆醇; 細胞凋亡; 白血病; 白細胞介素6; STAT3轉錄因子; 信號轉導接頭蛋白類; 小鼠; 體外研究
Methods: Three kinds of leukemia cell lines， HuT78， Jurkat and L1210 cells， were used in this study. After different doses of Res treatment， methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) colorimetry was used to detect the cell proliferation; apoptosis was detected by flow cytometry; Western blot and immunoprecipitation method were used to detect the Bcl2 and Bax proteins expression and the activity of phosphosignal transducer and activator of transcription 3 (pSTAT3). Besides， a total of 40 BALB/c mice were randomly pided into untreated group and 12.5， 25 and 50 mg/(kg·d) Res groups. Then， leukemiabearing model was established by L1210 cells subcutaneous injection. Interleukin6 (IL6) was detected to determine the secretion function of T lymphocytes of the mice; the IL6 mRNA expression in the liver tissue of mice was also detected by reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR)， and the expression of the pSTAT3 protein was measured by Western blot and immunohistochemical method.
Results: The results indicated that resveratrol could inhibit the proliferation of HuT78， Jurkat and L1210 cells and significantly induce the cell apoptosis. At the same time， the radio of Bcl2/Bax and expression of pSTAT3 protein were decreased either. Furthermore， resveratrol could reduce the expression of IL6 mRNA and intracellular content of IL6， and decrease the expression of pSTAT3 protein in the liver of leukemic mice at a dosedependent manner.
Conclusion: Resveratrol can function as an antileukemic agent through inducing apoptosis， modulating IL6 and STAT3 both in vitro and in vivo.
Keywords: resveratrol; apoptosis; leukemia; interleukin6; STAT3 transcription factor; signal transducing adaptor proteins; mice; in vitro study
白藜蘆醇（resveratrol， Res）化學名稱芪三酚，結構為3，5，4'三羥基二苯乙烯，分子式為C14H12O3。含有Res的常見中藥材有決明、藜蘆和虎杖等，食物有葡萄和花生等。Jang等［1］對Res在腫瘤發生、發展各階段的抑制作用進行了系統的報道，從而使Res成為腫瘤預防和治療領域的一個研究熱點。雖然Res的抗腫瘤作用已在諸多細胞系中得到證實［2， 3］，但其具體應用在不同的研究中存在較大差異，而且現有的研究多局限于功能水平。因此，闡明Res抗腫瘤作用的具體分子機制，是對其開發利用及理論研究的重要前提之一。本課題以3種不同來源的白血病細胞株及白血病腹水瘤小鼠作為研究對象，選用Res為干預藥物，采用體外細胞培養與整體動物實驗相結合的方法，以探討Res的抗白血病作用及其可能的分子機制。
1 材料和方法
1.1 主要材料 Res（純度98.36％，由陜西地區生產的虎杖中提取），購于陜西賽德生物股份有限公司；Bcl2和Bax抗體，購于Labvision公司；CD3藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）Cy5、CD4異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate， FITC）、CD8PE和IL6PE，購于Ebioscience公司；信號轉導子和轉錄激活子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）多克隆抗體及其磷酸化（phosphoTyr705STAT3， pSTAT3）抗體，購于Santa Cruz公司；鏈霉卵白素（histostainstreptavidinperoxidase， SP）免疫組化染色試劑盒，購于北京中杉金橋生物有限公司。小鼠淋巴細胞白血病細胞株L1210，由西安交通大學生命學院王一理老師惠贈；人皮膚T細胞淋巴瘤細胞株HuT78和人T淋巴細胞白血病細胞株Jurkat，由西安交通大學醫學院第一附屬醫院陳穎老師惠贈。BALB/c小鼠，6周齡，雄性，體質量（20±2）g，西安交通大學醫學院實驗動物中心提供，動物合格證號為SYXK（陜）2007003。
1.2 藥物處理及細胞增殖分析 Res溶于二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide， DMSO）成1 g/L，濾過除菌，－20 ℃貯存。用時以RPMI 1640細胞培養基稀釋至所需濃度，使DMSO終濃度不高于0.1%，此時對細胞生長活性無影響。臺盼藍染色法活細胞計數≥95%，調整細胞濃度為5 000個/ml，以6.25、12.5、25、50、100和200 μmol/L Res分別培養HuT78、Jurkat和L1210細胞12、24和48 h。加入5 mg/ml甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT），終濃度0.2 mg/ml，再培養4 h，棄上清，加入DMSO溶解沉淀，570 nm處測定吸光度（absorbance， A）值，計數細胞生長抑制率及半數抑制濃度（inhibiting concentration 50%， IC50）。
1.3 AnnexinV法檢測細胞凋亡 調細胞終濃度為1×105個/ml，用100 μmol/L Res培養HuT78、Jurkat和L1210細胞12、24和48 h，空白對照組加等體積RPMI 1640培養基。FITC標記的AnnexinV和碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色后，通過流式細胞儀(FACScan型，美國BD公司)定量檢測各組細胞凋亡情況。
1.4 蛋白印跡法檢測凋亡相關蛋白Bcl2、Bax的相對表達 以IC50Res培養各組白血病細胞24 h，蛋白印跡法分析Res對凋亡相關蛋白Bcl2和Bax的影響。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis， SDSPAGE），半干法轉膜1.5 h，加入相應一抗（1︰200稀釋）及辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）標記的二抗（1︰5 000稀釋），增強化學發光（enhanced chemiluminescence， ECL）法檢測，最后進行圖片掃描和分析，采用Quantity One軟件進行數據處理，以βactin蛋白為內參照進行半定量分析。
1.5 免疫沉淀法檢測活性pSTAT3蛋白表達 0.5%血清饑餓12 h，以25、50和100 μmol/L Res培養HuT78、Jurkat和L1210細胞24 h，并設空白對照組。提取細胞蛋白，以充分重懸的蛋白G瓊脂糖（protein G agarose）進行沉淀，BCA法測定蛋白濃度，分別取各組細胞50 μg總蛋白進行SDSPAGE電泳，pSTAT3稀釋倍數為1︰1 000，以非磷酸化抗體作內標參考。
1.6 動物給藥及模型建立 參見文獻方法［4］，40只BALB/c小鼠隨機分為L1210對照組和L1210+12.5、25、50 mg/(kg·d) Res組，每組10只，藥物干預組小鼠連續灌服Res 3周。給藥5 d后，腹腔接種L1210 （1～5）×107個/ml細胞一次，0.2 ml/只。腫瘤接種后繼續灌胃治療16 d，并于接種后第3天起，每天眼眶靜脈叢采血進行外周血白細胞計數及血涂片瑞吉氏染色，找到白血病細胞證實小鼠白血病模型建立成功。
1.7 逆轉錄酶聚合酶鏈式反應法檢測小鼠T淋巴細胞白細胞介素6 mRNA表達 治療結束后，收集各組小鼠外周血T淋巴細胞，逆轉錄聚合酶鏈式反應法（reverse transcriptionpolymerase chain reaction， RTPCR）檢測小鼠白細胞介素6（interleukin6， IL6） mRNA表達，按試劑盒說明操作。采用異硫氰酸胍一步法提取RNA，分光光度計測A260/A280比值在1.8～2.0之間。IL6和βactin引物序列由北京奧科生物技術有限責任公司提供。IL6上游引物5'CTG GTG ACA ACC ACG GCC TTC CCT A3'；下游引物5'ATG CTT AGG CAT AAC GCA CTA GGT T3'；擴增片段長度為600 bp。βactin上游引物5'ACC TCT ATG CCA ACA CAG3'；下游引物5'GTA ACA GTC CGC CTA GAA G3'；擴增片斷長度為266 bp。采用Promega公司的逆轉錄試劑盒，按說明書進行cDNA的合成。PCR擴增條件為25 μl PCR反應體系，包括10×PCR buffer 2.5 μl，10 mmol/L dNTP 2 μl，上下游引物各1 μl，Taq酶 2.5 U，cDNA 10 μl。預變性94 ℃ 3 min后，93 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共30個循環，循環結束后72 ℃ 5 min。取擴增產物5 μl在1.0%瓊脂糖凝膠中電泳（150 V恒壓電泳0.5 h），應用GelDoc2000型全自動凝膠成像分析儀照相并測定每條帶的光密度值，以βactin的表達量為內參照，計算并比較各組樣本目標片段的相對表達量。
1.8 流式細胞術檢測小鼠T淋巴細胞內IL6分泌 治療結束后，收集各組小鼠外周血T淋巴細胞，加入12十四酸佛波酯13乙酸鹽（phorbol 12myristate 13acetate，PMA）（使其終濃度為25 ng/ml）和布雷菲德菌素A（brefeldin A，BFA）（終濃度為10 ng/ml），混勻，37 ℃、5% CO2培養4～6 h，將10 μl CD4FITC、10 μl IL6PE、100 μl激活后的T淋巴細胞（2×106/ml）混勻，孵育1 min。加入溶血素，室溫暗處孵育10 min，固定，破膜，加入IL6PE（0.5 μg/106細胞）孵育30 min，流式細胞儀分析胞內IL6的分泌情況。
1.9 免疫組化法檢測小鼠肝臟活性pSTAT3蛋白表達 取各組小鼠肝臟，后固定1 d，20％、30％蔗糖梯度脫水，冰凍切片（8 μm），其余步驟依據試劑盒說明操作。以胞漿或胞核出現棕黃色連續或灶性顆粒狀分布為陽性表達。半定量分析活性pSTAT3蛋白的陽性表達率。
1.10 蛋白印跡法檢測小鼠肝臟活性pSTAT3蛋白表達 按照試劑盒說明方法提取小鼠肝臟組織細胞核蛋白，蛋白印跡法操作步驟同前。pSTAT3一抗1︰500稀釋，HRP標記的二抗1︰5 000稀釋，以非磷酸化抗體作內標參考。
1.11 統計學方法 計量資料數據以x±s表示，所有數據均用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析，采用多因素重復測量數據的方差分析或單因素方差分析進行組間比較。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 Res對白血病細胞的生長抑制作用 不同濃度Res作用12、24、48 h，其對白血病細胞的增殖抑制作用呈一定的時間劑量依賴性。Res對白血病細胞的增殖抑制最高生長抑制率約為82.66％（HuT78）、63.95％（Jurkat）以及70.69%（L1210）。Res作用HuT78、Jurkat、L1210細胞24 h的IC50分別為106.38、172.12和99.66 μmol/L。見表1。
2.2 Res誘導白血病細胞凋亡 100 μmol/L Res能以時間依賴性的方式誘導白血病細胞凋亡，同樣條件下，Res對HuT78細胞與L1210細胞的促凋亡作用強于Jurkat細胞。流式細胞術分析可見，100 μmol/L Res作用48 h時，（84.33±2.14）％的HuT78細胞發生了凋亡，Jurkat細胞和L1210細胞的凋亡率分別為（41.99±1.73）％和（50.94±2.56）％。見圖1和圖2。
2.3 Res影響白血病細胞凋亡相關蛋白Bcl2和Bax的表達 以各組細胞的IC50Res培養24 h，βactin作內標參考，蛋白印跡結果顯示，Res下調HuT78、Jurkat與L1210細胞Bcl2蛋白的表達水平，明顯增加Bax蛋白表達，Bcl2/Bax值顯著降低，與相應空白對照相比，差異有統計學意義（P
表1 白藜蘆醇對白血病細胞HuT78、Jurkat及 L1210的生長抑制作用（略）
Table 1 Growth inhibition of resveratrol to leukemia cells HuT78， Jurkat and L1210 in vitro
**P
圖1 流式細胞儀檢測100 μmol/L白藜蘆醇干預24 h后對白血病細胞凋亡的影響（略）
Figure 1 Effects of 100 μmol/L Res on apoptosis of leukemia cells after 24hour treatment in vitro detected by flow cytometry
The apoptotic and necrotic cell distribution is analyzed by Annexin V binding and PI uptake. Positioning of quadrants on Annexin V/PI dot plots is performed， and living cells (Annexin V-/PI-)， early apoptotic/primary apoptotic cells (Annexin V+/PI-)， late apoptotic/secondary apoptotic cells (Annexin V+/PI+) and necrotic cells (Annexin V-/PI+) are distinguished. Therefore， the total apoptotic proportion includes the percentage of cells with fluorescence Annexin V+/PI- and Annexin V+/PI+. A， C， E: HuT78， Jurkat and L1210 cells treated with 100 μmol/L resveratrol; B， D， F: Control of HuT78， Jurkat and L1210 cells.
圖2 流式細胞儀檢測100 μmol/L白藜蘆醇干預不同時間后對白血病細胞凋亡的影響（略）
Figure 2 Effects of 100 μmol/L Res on apoptosis of leukemia cells after 12， 24， 48hour treatment in vitro detected by flow cytometry
**P
圖3 蛋白印跡法檢測白藜蘆醇干預24 h后對白血病細胞Bcl2和Bax蛋白表達的影響（略）
Figure 3 Effects of Res on expressions of Bcl2 and Bax proteins in leukemia cells after 24hour treatment in vitro detected by Western blotting
1: HuT78 control group; 2: Jurkat control group; 3: L1210 control group; 4: HuT78 IC50 Res group; 5: Jurkat IC50 Res group; 6: L1210 IC50 Res group.
2.4 Res對白血病細胞活性pSTAT3蛋白表達的影響 不同濃度Res處理各組白血病細胞24 h后，經反復檢測，Res作用前，在分子量89 kD處可見一較深的STAT3酪氨酸磷酸化蛋白帶，與對照相比，Res以劑量依賴的方式減弱HuT78與L1210細胞STAT3的酪氨酸磷酸化表達；而對于Jurkat細胞，只有100 μmol/L Res可見pSTAT3水平下調，余者變化不明顯。各組STAT3非磷酸化蛋白的表達水平無明顯變化。見圖4。
2.5 Res調控白血病細胞IL6的表達與分泌 Res劑量依賴性地下調白血病小鼠T淋巴細胞IL6 mRNA表達。此外，通過流式細胞術對胞內IL6水平的檢測可見，Res能以劑量依賴的方式降低白血病小鼠T淋巴細胞內IL6的分泌水平。見圖5和圖6。
2.6 Res下調白血病小鼠活性pSTAT3蛋白的表達 各組小鼠解剖后可見白血病小鼠肝臟明顯腫大。免疫組化結果顯示，pSTAT3呈強陽性表達，Res組肝組織中pSTAT3蛋白表達均下調。模型組陽性率為（86.55±5.26）％，12.5 mg/(kg·d) Res組陽性率為（78.3±3.32）％，與模型組比較差異無統計學意義；25、50 mg/(kg·d) Res組陽性率分別為（43.5±2.55）％和（23.5±3.31）％，與模型組比較，差異有統計學意義（P
蛋白印跡法結果顯示，灌服不同劑量Res后，荷瘤小鼠肝組織中活性pSTAT3蛋白表達呈劑量依賴性下調，同時，非磷酸化STAT3蛋白表達無顯著變化。見圖8。
圖4 免疫沉淀法檢測白藜蘆醇干預24 h后對白血病細胞活性pSTAT3和STAT3蛋白表達的影響（略）
Figure 4 Effects of Res on expressions of pSTAT3 and STAT3 proteins in leukemia cells after 24hour treatment in vitro detected by immunoprecipitation method
1: Blank control group; 2: 25 μmol/L Res group; 3: 50 μmol/L Res group; 4: 100 μmol/L Res group.
圖5 RTPCR檢測白藜蘆醇對小鼠T淋巴細胞IL6 mRNA表達的影響（略）
Figure 5 Effects of Res on the expression of IL6 mRNA in T lymphocytes in mice detected by RTPCR
1: Blank control group; 2: 12.5 mg/(kg·d) Res group; 3: 25 mg/(kg·d) Res group; 4: 50 mg/(kg·d) Res group.
圖6 流式細胞術檢測白藜蘆醇對小鼠T淋巴細胞內IL6含量的影響（略）
Figure 6 Content of IL6 in T lymphocytes in mice detected by flow cytometry Positioning of quadrants on FITC/PE dot plots was performed and intracellular IL6 (FITC＋/PE＋) were determined.
A: Blank control group; B: 12.5 mg/(kg·d) Res group; C: 25 mg/(kg·d) Res group; D: 50 mg/(kg·d) Res group. *P
圖7 免疫組化法檢測白藜蘆醇對小鼠肝臟中活性pSTAT3表達的影響(光學顯微鏡，×400)（略）
Figure 7 Effects of Res on expression of pSTAT3 protein in liver tissue in mice detected by immunohistochemistry
(Light microscopy， ×400)
A: Blank control group; B: 12.5 mg/(kg·d) Res group; C: 25 mg/(kg·d) Res group; D: 50 mg/(kg·d) Res group.
圖8 蛋白印跡法檢測白藜蘆醇對小鼠肝臟中活性pSTAT3表達的影響（略）
Figure 8 Effects of Res on expression of pSTAT3 protein in liver tissue in mice detected by Western blotting
1: Blank control group; 2: 12.5 mg/(kg·d) Res group; 3: 25 mg/(kg·d) Res group; 4: 50 mg/(kg·d) Res group.
3 討論
白血病的常規療法主要是放療和化療，但是由于缺乏選擇特異性，往往對正常組織、器官（特別是骨髓和消化道）造成功能性或器質性的損傷。有研究顯示，Res對造血系統毒性小［5］，提示它在白血病的治療中具有潛在的應用價值。本研究通過對3種淋巴系白血病細胞的研究發現，Res具有良好的增殖抑制和誘導凋亡作用。
Bcl2基因是血液系統惡性腫瘤最為重要的抗凋亡基因，Bax基因能夠與Bcl2組成同源或異源二聚體，通過抑制Bcl2而發揮促進細胞凋亡的作用。現有研究已證實，Bax表達增加和（或）Bcl2表達抑制均可導致線粒體膜滲透性轉換，引起線粒體細胞色素C釋放，進而誘發Caspase激活以致細胞凋亡［6］。本研究顯示，Res能不同程度地減少白血病細胞抗凋亡蛋白Bcl2表達，增加Bax蛋白表達，使Bcl2/Bax比值降低，提示這可能是其誘導白血病細胞凋亡的分子機制之一。但是，白血病細胞凋亡是一個多基因相互作用的復雜事件，這一過程可能還涉及其他的調控基因和信號途徑。因此，本研究繼續探討了Res對IL6及信號轉導分子的調控作用。
研究顯示，炎癥往往導致細胞惡性轉化或者是致癌過程的起始階段，腫瘤細胞能持續產生大量IL6，急性淋巴細胞白血病和急性非淋巴細胞白血病患者血清IL6含量明顯高于正常水平，IL6可能通過自分泌機制與白血病的發病相關［7， 8］。這些發現使IL6與白血病的關系日益受到人們關注。Takada等［9］比較了幾種非甾體抗炎藥物，發現Res是其中最強的抗炎和抗增殖物質。本研究中，白血病小鼠T淋巴細胞內IL6水平顯著增高，提示其在白血病的病理進程中的確具有重要作用。Res干預后小鼠IL6 mRNA的基因表達明顯下調，不過，僅僅從mRNA水平檢測IL6的變化還不能揭示Res對IL6蛋白水平的影響。因此，本文進一步采用胞內細胞因子染色的方法檢測胞內IL6的分泌。PMA能夠刺激T細胞產生IL6，BFA則通過阻斷胞內高爾基復合體介導的轉運，使IL6聚集在胞內，再通過標記的CD4+分析特異性T細胞分泌IL6的情況。本研究發現，Res對胞內IL6的釋放具有較明顯的抑制作用。目前已經明確兩條信號通路——激活蛋白(activator protein， AP)和蛋白激酶C（protein kinase C， PKC）通路參與IL6的基因表達與調控，Res的作用是否與這兩條通路有關及其調控IL6的具體分子機制尚需進一步研究闡明。
STAT信號通路是IL6介導的信號轉導途徑之一。正常情況下STAT的激活是一過性的，但是白血病細胞中存在STAT的持續性激活，其中活化的主要是STAT1和STAT3。當STAT3被磷酸化激活后形成二聚體并轉入核內，通過與DNA作用元件結合，激活與生長增殖有關的基因轉錄或者增加抗凋亡蛋白（如Bcl2）的表達，最終引起癌變［10］。本研究中，Res劑量依賴地下調白血病細胞pSTAT3和Bcl2表達，提示其可能是通過阻斷STAT3信號轉導通路，使靶基因Bcl2表達受阻，進而誘導細胞凋亡，發揮抗白血病效應。此外，本研究還檢測了白血病小鼠肝組織中pSTAT3的水平。Res使STAT3的酪氨酸磷酸化活性表達降低、STAT3信號的組成性激活明顯減弱。Wung等［11］也證實Res能通過減弱STAT3磷酸化抑制IL6誘導的細胞間黏附分子1（intracellular adhesion molecule1， ICAM1）基因表達，與我們的研究結果一致。
本文通過體外細胞培養和動物實驗，較為全面、深入地探討了Res抗白血病、調控IL6及其信號通路的作用。雖然Res體內外均具有較好的抗白血病效應，并且與IL6及STAT3信號通路存在較為密切的相關性，但是由于不同信號轉導通路間存在網絡交叉，除了IL6外尚有多種細胞因子參與STAT3信號通路，Res是否還影響其他信號分子與轉導通路尚不清楚，而且Res對白血病細胞的作用具有高變性，不同細胞對其敏感性各不相同，這些問題都有待于進一步研究闡明。揭示Res發揮作用的具體分子機制，也許能為發展新的白血病治療策略提供更多啟示。
【參考文獻】
1 Jang M， Cai L， Udeani GO， et al. Cancer chemopreventive activity of resveratrol， a natural product derived from grapes. Science. 1997; 275(5297): 218220.
2 Yu HB， Pan CE， Wu WJ， et al. Effects of resveratrol on matrix metalloproteinase9 expression in hepatoma cells. Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao. 2008; 6(3): 270273. Chinese with abstract in English.
余海波， 潘承恩， 吳武軍， 等. 白藜蘆醇對肝癌細胞基質金屬蛋白酶9表達的影響. 中西醫結合學報. 2008; 6(3): 270273.
3 Fulda S， Debatin KM. Resveratrol modulation of signal transduction in apoptosis and cell survival: a minireview. Cancer Detect Prev. 2006; 30(3): 217223.
4 Zhou YP. Randomized block design with Excel software in drug toxicology research. Yao Xue Jin Zhan. 2005; 29(9): 425427. Chinese with abstract in English.
周一平. 用Excel軟件進行藥物毒理實驗的隨機分組. 藥學進展. 2005; 29(9): 425427.
5 Wang Q， Li H， Liu N， et al. Correlative analyses of notch signaling with resveratrolinduced differentiation and apoptosis of human medulloblastoma cells. Neurosci Lett. 2008; 438(2): 168173.
6 Radogna F， Cristofanon S， Paternoster L， et al. Melatonin antagonizes the intrinsic pathway of apoptosis via mitochondrial targeting of Bcl2. J Pineal Res. 2008; 44(3): 316325.
7 Li Y， Suo XH， Niu ZY. The changes and clinical significance of levels of IL2 and IL6 in pre and post chemotherapy of acute leukemia patients. Zhongguo Shi Yan Zhen Duan Xue. 2007; 11(3): 324326. Chinese with abstract in English.
李焱， 索曉慧， 牛志云. 急性白血病患者化療前后IL2及IL6水平的變化及臨床意義. 中國實驗診斷學. 2007; 11(3): 324326.
8 Yin HQ， Qiao ZH， Zhu L， et al. Levels of intracellular IL6 and IFNγ in children with acute lymphoblastic leukemia. Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi. 2006; 8(6): 461463. Chinese with abstract in English.
陰懷清， 喬振華， 朱鐳， 等. 兒童急性淋巴細胞性白血病細胞內IL6、IFNγ水平變化及其臨床意義. 中國當代兒科雜志. 2006; 8(6): 461463.
9 Takada Y， Bhardwaj A， Potdar P， et al. Nonsteroidal antiinflammatory agents differ in their ability to suppress NFkappaB activation， inhibition of expression of cyclooxygenase2 and cyclin D1， and abrogation of tumor cell proliferation. Oncogene. 2004; 23(57): 92479258.