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牛血清白蛋白范文1
【關(guān)鍵詞】熒光光譜法 可卡因 牛血清蛋白 相互作用
【Abstract】Objective To study the interaction of bovine serum albumin（BSA） with cocaine at different temperature and mechanisms underlying.Methods The quenching of fluorescence was determined by measuring fluorescence quenching spectra and synchronous fluorescence spectra of BSA interacted with cocaine.The type of binding foece was estimated according to the themodynamic equation.Results The fluorescence of BSA interacted with cocaine was quenched regularly .The values of binding constants（Ks）to be 1.38×103 L/mol （30℃），and6.19×103 L/mol （37℃），amounts of binding sites（1），and themodynamic parameters（ΔH： 167.44 KJ/mol，ΔS： 612.71J/mol?K ，ΔG： -18.21 KJ/mol（30℃）and-22.50（37℃））were obtained by analyzing and processing the fluorescence quenching data according to Stern-Volmer equation， Lineweaver-Burk equation and themodynamic equation，respectively.Conclusion It was shown that the fluorescence quenching process of BSA with Cocaine was attributed to static quenching. The force of the reaction was mainly due to hydrophobic action.
【Keywords】Fluoro-spectroscopy； Cocaine；Bovine serum albumin；Interaction
可卡因 （ cocaine） 化學(xué)名為苯甲酰甲基芽子堿 ，又稱古柯生物堿。導(dǎo)致其濫用的主要原因是其強(qiáng)烈的中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮作用（ 欣） [1]。可卡因的濫用可導(dǎo)致機(jī)體多個(gè)系統(tǒng)、臟器的損傷[2]，嚴(yán)重者可誘發(fā)心律紊亂、全身抽搐、呼吸衰竭而致死。對于長期小劑量濫用所致的慢性中毒，主要是心理依賴性反應(yīng)， 生理依賴很輕[3]。
血清白蛋白是人和動物血清中含量最豐富的一種蛋白質(zhì)，與各種帶正電荷的物質(zhì)及電中性物質(zhì)均有一定程度的相互作用。各類藥物進(jìn)入人體首先與血清白蛋白結(jié)合，通過血漿的存貯和運(yùn)輸，到達(dá)受體部位產(chǎn)生藥理作用[4]。研究各種藥物與血清白蛋白的結(jié)合，來獲取藥物分子對蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的影響以及藥物的藥理等有用信息，已經(jīng)引起了生命科學(xué)、化學(xué)、藥學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)科研工作者的普遍關(guān)注。目前研究生物大分子與藥物小分子相互作用的方法主要有熒光光譜法[5]、紫外光譜法[6]、圓二色譜法[7]、拉曼光譜法[8]、電化學(xué)法[9]和核磁共振法[10]等。
熒光光譜法是研究生物大分子與藥物小分子化合物之間相互作用很有效的方法，發(fā)射峰的位置、熒光偏振、能量轉(zhuǎn)移、熒光壽命等指標(biāo)均可以對蛋白質(zhì)中熒光發(fā)色團(tuán)的結(jié)構(gòu)及其所處的微環(huán)境提供有用的數(shù)據(jù)信息[11]。
本文采用熒光光譜法，在模擬生理?xiàng)l件下，定性研究可卡因與牛血清白蛋白（BSA）的相互作用機(jī)理，分析其作用力類型，確定其結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，再通過同步熒光法確定可卡因?qū)SA構(gòu)象的影響方式，進(jìn)而分析可卡因?qū)θ梭w的作用和運(yùn)轉(zhuǎn)代謝情況，獲得蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象及其變化和可卡因的藥理效應(yīng)等信息。
1實(shí)驗(yàn)部分
1.1儀器與試劑
1.1.1儀器
Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer型熒光分光光度計(jì)（Aglient Technologies）；FA1104N電子分析天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海葉拓儀表有限公司）。
1.1.2試劑
牛血清白蛋白（BR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；鹽酸可卡因（BR，公安部物證鑒定中心）；三羥甲基氨基甲烷（Tris）（BR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；鹽酸（HCl）（AR，上海久億化學(xué)試劑有限公司）；氯化鈉（NaCl）（AR，西隴化工股份有限公司）。
1.1.3溶液配置
牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：準(zhǔn)確稱取純度大于99%的牛血清白蛋白0.335g于50ml容量瓶中，以pH =7.4的0.1 mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）-鹽酸緩沖液（其中含0.1mol/L NaCl維持離子強(qiáng)度）定容為50ml，濃度為1.0×10-4mol/L，低溫（≤4℃）保存于冰箱。
可卡因標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：用電子天平準(zhǔn)確稱取4mg標(biāo)準(zhǔn)品于100ml的容量瓶中，以pH =7.4的 Tris-HCl緩沖液（其中含0.1mol/L NaCl維持離子強(qiáng)度）溶解并定容，濃度為40.0μg/mL，低溫（≤4℃）保存于冰箱。
實(shí)驗(yàn)時(shí)所需濃度由Tris-HCl緩沖溶液（ pH =7.4，內(nèi)含0.1mol/L NaCl維持離子強(qiáng)度）稀釋而得。所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為怡寶純凈水。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
于編號為 0-7的4mL離心管中分別加入2mL 1.0×10-4mol/L的BSA溶液， 使用移液槍分別加入的40mg/L 鹽酸可卡因工作液0、10、20、30、40、50、60、70 μL，充分搖勻，并分別在T=30℃和T=37℃的條件下恒溫水浴1h 。采用1cm石英比色皿，選擇激發(fā)波長為292.03 nm ，狹縫寬度均為5nm ，光電管負(fù)高壓為400V，掃描速率1200nm/min，掃描并繪制300-500 nm 的熒光光譜，以及固定熒光激發(fā)與發(fā)射的波長差λ=15nm和λ=60nm的同步熒光光譜。
2結(jié)果與討論
2.1 熒光猝滅光譜
按照實(shí)驗(yàn)方法分別測定了30℃、37℃ 溫度下不同濃度的可卡因?qū)εＱ灏椎鞍椎臒晒忖绻庾V，30℃ 時(shí)的猝滅光譜見圖1。由圖1可知，隨著可卡因濃度的逐漸增加，牛血清白蛋白的熒光特征峰逐漸降低。這是由于BSA中存在的色氨酸和酪氨酸，使其具有內(nèi)源熒光[12]，當(dāng)固定BSA的量而不斷增加可卡因的濃度時(shí)，可卡因與BSA之間的相互作用導(dǎo)致BSA內(nèi)源熒光強(qiáng)度有規(guī)律性的猝滅。
2.2 熒光猝滅機(jī)理及猝滅常數(shù)的測定
引起B(yǎng)SA熒光猝滅的原因可能有動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種。動態(tài)猝滅過程遵循 Stern-Volmer 方程[13]：
F0/F = 1 + Ksv[Q] = 1 + Kqτ0[ Q ] （1）
式中，F(xiàn)0和F表示不存在和存在猝滅劑時(shí)熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度，[Q]為猝滅劑的濃度， Ksv為動態(tài)猝滅常數(shù)（又稱為 Stern-Volmer 猝滅常數(shù)）， Kq 是由擴(kuò)散過程控制的雙分子動態(tài)猝滅速率常數(shù)。τ0為沒有猝滅劑存在下熒光分子平均壽命，生物大分子熒光壽命約為10-8s[14]。
靜態(tài)猝滅過程遵循下式：
F0/F = 1 + Ks[Q] （2）
式中，Ks是靜態(tài)猝滅常數(shù)（即配合物的締合常數(shù)）。隨溫度升高動態(tài)猝滅常數(shù)增大，而靜態(tài)猝滅常數(shù)減小，可由此判斷熒光猝滅類型。
以F0/F對相應(yīng)的[Q]作圖，得到可卡因?qū)SA之間猝滅的 Stern-Volmer 曲線，繼而得到不同溫度下可卡因?qū)SA熒光猝滅的 Stern-Volmer 方程。由 Stern-Volmer 方程得到在30℃和37℃時(shí) Ksv分別為：Ksv30 =2.1162×104 ； Ksv37 =1.3099×104 。
由于生物大分子的熒光壽命約為10-8s，由方程：
Ksv = Kqτ0 （3）
可以得到不同溫度下的可卡因和BSA之間猝滅過程的速率常數(shù) Kq數(shù)量級均為1012。Kq大于各類猝滅劑對生物大分子的最大動態(tài)猝滅速率常數(shù)2.0×1010 L/mol？S[15]，所以加入可卡因?qū)е翨SA熒光猝滅不是由動態(tài)碰撞引起的，可以初步判斷猝滅過程是以靜態(tài)猝滅為主，而隨溫度升高，Stern-Volmer 方程的斜率（即動態(tài)猝滅常數(shù)）逐漸減小，進(jìn)一步表明猝滅過程是以靜態(tài)猝滅為主。
2.3 結(jié)合常數(shù)及結(jié)合點(diǎn)數(shù)的測定
當(dāng)小分子與大分子結(jié)合時(shí)，其表觀結(jié)合常數(shù)K與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n可由下式求得[16]：
K + n （4）
式中：K為結(jié)合常數(shù)；n為結(jié)合點(diǎn)數(shù)。
對30℃和37℃時(shí)的lg[（Fo-F）/F]-1-lg[Q]-1作雙對數(shù)圖，如圖3。
根據(jù)截距和斜率求得不同溫度下的結(jié)合常數(shù)K和結(jié)合點(diǎn)數(shù)n（見表1）。由表可知在實(shí)驗(yàn)條件下結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n接近1，說明鹽酸可卡因與BSA可形成1個(gè)結(jié)合點(diǎn)數(shù)。而在30℃和37℃時(shí)的K值處于同一數(shù)量級，則更加印證了可卡因?qū)SA的猝滅方式為靜態(tài)猝滅。
2.4 BSA與可卡因結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)和作用力的確定
分子間的作用力包括氫鍵、范德華力、靜電引力、疏水作用力等4種。當(dāng)溫度變化不大時(shí)，反應(yīng)的焓變ΔH可認(rèn)為是常數(shù)。根據(jù)反應(yīng)前后的熱力學(xué)參數(shù)焓變H和熵變S的相對大小， 可以確定分子間的相互作用力類型： 當(dāng)H0時(shí)為疏水作用力[5]。由熱力學(xué)公式： （5） （6） （7）
結(jié)合K，分別計(jì)算出不同溫度時(shí)可卡因與BSA作用的自由能變ΔG、焓變ΔH和熵變ΔS（結(jié)果見表2），可得30℃，37℃時(shí)的可卡因和BSA的熱力學(xué)參數(shù)ΔH均為167.44KJ/mol，自由能變（ΔG）分別為-18.21，-22.50KJ/mol，ΔS均為612.71J/mol?K。
根據(jù)Ross等總結(jié)出的判斷生物大分子與小分子結(jié)合力性質(zhì)和生物大分子自身結(jié)合力性質(zhì)的熱力學(xué)規(guī)律[17]，推斷出可卡因與BSA之間的作用力以疏水作用力為主。
2.5 同步熒光光譜
對于蛋白質(zhì)的同光熒光光譜，λ=15nm時(shí)僅表現(xiàn)為酪氨酸殘基的熒光，λ=60nm時(shí)則顯示色氨酸殘基的熒光。因芳香族氨基酸殘基的最大發(fā)射波長與所處環(huán)境極性有關(guān)，若其最大發(fā)射波長改變，說明殘基所處的微環(huán)境發(fā)生了改變，由發(fā)射波長的改變可判斷BSA中芳香氨基酸殘基所處微環(huán)境的變化[12]。
由λ為15nm和60nm的同步熒光光譜（如圖4）可知，酪氨酸殘基和色氨酸殘基的特征熒光光譜峰均隨可卡因濃度的增加而產(chǎn)生猝滅，但對酪氨酸和色氨酸特征峰的位置影響不大，表明可卡因?qū)εＱ宓鞍讟?gòu)象的改變不大[18]。相比之下，色氨酸殘基熒光猝滅程度比酪氨酸殘基更顯著，表明結(jié)合位點(diǎn)更接近于色氨酸殘基。
在可卡因與牛血清白蛋白相互作用的過程中，隨可卡因濃度升高，牛血清白蛋白的熒光強(qiáng)度呈有規(guī)律下降。在可卡因?qū)εＱ灏椎鞍椎臒晒忖邕^程中，隨溫度升高，猝滅常數(shù)降低，猝滅方式為靜態(tài)猝滅。兩者以物質(zhì)的量比1：1結(jié)合，作用力類型為疏水作用力；同步熒光掃描結(jié)果顯示，可卡因?qū)εＱ灏椎鞍椎臉?gòu)象影響不大，兩者的結(jié)合點(diǎn)可能位于色氨酸上。
3 結(jié)語
本文采用熒光光譜法研究可卡因與牛血清白蛋白之間的相互作用。結(jié)果表明：可卡因?qū)SA的熒光猝滅為靜態(tài)猝滅，兩者相互作用的結(jié)合常數(shù)K分別為1.38×103 L/mol （30℃）和6.19×103 L/mol （37℃）、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n為1、熱力學(xué)參數(shù)ΔH、ΔS、ΔG分別為167.44KJ/mol、612.71J/mol?K、-18.21 KJ/mol（30℃）和-22.50 KJ/mol（37℃）。根據(jù)分子間相互作用力和熱力學(xué)參數(shù)間的關(guān)系，可推斷兩者的相互作用力主要是疏水作用力。從同步熒光光譜法可知：由于兩者之間的反應(yīng)，BSA的熒光強(qiáng)度顯著降低，并推測可卡因和BSA的結(jié)合點(diǎn)位于色氨酸殘基上。
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牛血清白蛋白范文2
1結(jié)果與分析
1.1BSA與AP-AuNPs的物理吸附結(jié)果電泳檢測蛋白質(zhì)可以通過物理作用吸附在納米顆粒表面。從圖1可以看出，從左至右，隨著BSA濃度的增加，BSA與AP-AuNPs的吸附量也隨之增多。通過與純的AP-AuNPs相比較我們認(rèn)為，圖中與AP-AuNPs在同一水平位置的條帶為沒有吸附上BSA的AP-AuNPs，圖中微滯后的條帶為吸附上一條BSA的AP-AuNPs。選取吸附1個(gè)BSA的樣品進(jìn)行分析。
1.2蛋白酶K酶切AuNPs-BSA的電泳檢測結(jié)果本文中選取蛋白酶K(proteinaseK,ProK)對吸附在AP-AuNPs表面的BSA進(jìn)行酶切。與AP-AuN-Ps-BSA相對比，隨著ProK濃度的增加，AP-AuNPs-BSA的遷移率逐漸的增大，但最終還是小于AP-Au-NPs的遷移率，說明吸附結(jié)合在AP-AuNPs表面的BS段隨著ProK濃度的增加而減少，但是還是有部分BSA的片段吸附在AP-AuNPs的表面，沒有受到ProK的酶切(圖2)。
1.3SDS洗脫及吸附在AP-AuNPs表面肽段的PAGE膠鑒定十二烷基硫酸鈉(SDS)是一種陰離子表面活性劑。用10%的SDS對AP-AuNPs-BSA(酶)進(jìn)行處理。通過2%的瓊脂糖凝膠電泳我們看出，10%的SDS可以將吸附在AP-AuNPs表面的蛋白片段洗脫下來(圖3A)。然后將洗脫后的樣品進(jìn)行SDS-丙烯酰胺(PAGE)凝膠電泳，來對洗脫下來的蛋白多肽片段進(jìn)行鑒定。從圖3B中我們可以看出，經(jīng)過SDS洗脫的后的樣品中，在分子量約26kD處，有一條帶出現(xiàn)，經(jīng)與其它的樣品比較，我們認(rèn)為，該條帶則為吸附在AP-AuNPs表面的BS段。
2討論
本實(shí)驗(yàn)選取BSA與AP-AuNPs通過簡單的物理吸附作用結(jié)合在一起，通過瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可以看出，BSA可以穩(wěn)定地吸附在AP-AuNPs的表面。在經(jīng)過蛋白酶K酶切的電泳結(jié)果可以推測，BSA穩(wěn)定的吸附在AP-AuNPs的表面是BSA中的一段氨基酸序列吸附在AP-AuNPs的表面所導(dǎo)致的。在經(jīng)過SDS洗脫及SDS-PAGE電泳結(jié)果證明，BSA與AP-AuNPs是通過BSA的一段固定的多肽序列結(jié)合在AP-AuNPs所到導(dǎo)致的。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果的發(fā)現(xiàn)，對于功能化的納米顆粒在生物體內(nèi)高效、穩(wěn)定的應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
3材料與方法
3.1AP合成AP合成的方法參照文獻(xiàn)(Zhangetal.,2011)。簡要概述：稱取3.084g(15mmol/L)的聚異丁烯馬來酸酐置于500mL的圓底燒瓶中，2.7g(15mmol/L)的十二胺干粉溶于100mL的四氫呋喃后與聚異丁烯馬來酸酐混合，超聲，使得溶液完全澄清。將混合液55~60℃加熱、攪拌1h。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶液濃縮到30~40mL后攪拌、過夜。次日，將溶液完全抽干，加入40mL的氯仿重新溶解。最終得到單元結(jié)構(gòu)濃度(Cmononier)為0.5mol/L的兩性聚合物。
3.2有機(jī)相AuNPs的合成合成方法參照文獻(xiàn)(Linetal.,2008)。簡要描述：稱取2.17g四辛基溴化銨溶于80mL的甲苯中。稱取300mg氯金酸溶于25mL的超純水中。將兩者混合至分液漏斗中，輕微震蕩后棄水相，將有機(jī)相轉(zhuǎn)移到圓底燒瓶中。稱取334mg硼氫化鈉溶于25mL的超純水中，并迅速的加入到有機(jī)相中，攪拌60min后轉(zhuǎn)移到250mL的分液漏斗中，分別加入NaCl、NaOH洗滌3次，棄水相后在轉(zhuǎn)移到250mL的圓底燒瓶中，磁力攪拌，過夜。加入10mL十二烷硫醇，65℃水浴加熱，攪拌3h。分裝在40mL的小瓶中，2000r/min離心5min，收集上清。加入等體積的甲醇，2000r/min離心5min，棄上清，晾干，加入氯仿重新溶解。
3.3AP包裹AuNPs包裹的方法參照文獻(xiàn)(Zhangetal.,2011)。簡要概述：根據(jù)每個(gè)AuNP的有效表面積每平方納米含有200個(gè)polymer單元結(jié)構(gòu)比例混合。每個(gè)AuNP的有效表面積的計(jì)算方法為：Aeff=4•仔•(deff•2-1)2，其中的deff為油相納米金顆粒的有效動力學(xué)直徑。由于AuNP和polymer的體積小，密度大，使得它們在溶液中分布比較密集。由于氯仿?lián)]發(fā)的太快，在進(jìn)行真空抽氣時(shí)不能夠?qū)olymer均勻的包裹在AuNP表面。在進(jìn)行包裹時(shí)，先加入少量的氯仿有利于將polymer均勻的包裹在AuNP表面，真空抽氣直到將氯仿全部抽干。加入適量的SB12緩沖液進(jìn)行攪拌，直到混合物完全溶解且澄清。這樣就將油相的AuNP轉(zhuǎn)移至水相中(AP-AuNP)。
3.4BSA與AP-AuNPs的物理吸附實(shí)驗(yàn)取PCR管分別編號1~10，按表1中比例加入AP-AuNPs與BSA混勻，反應(yīng)體系為30滋L，不足由超純水補(bǔ)齊。室溫下反應(yīng)30min。
牛血清白蛋白范文3
[關(guān)鍵詞] BrdU；免疫組織化學(xué)染色；胰酶抑制劑；牛血清白蛋白；漂片法
[中圖分類號] R392-33 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2012）02（b）-0016-03
Improvement in technique of BrdU immunohistochemical staining by bleach section
GUO Jingjing1 SHAN Lidong2 WU Gang3
1.Department of General Surgery, Huashan Hospital Baoshan Branch of Fudan University, Shanghai 200431, China;
2.Department of Neurobiology and Medical Psychology, School of Preclinical Medicine and Biological Sciences,Medical School of Suzhou University, Jiangsu Province, Suzhou 215123, China;3.Department of General Surgery, Huashan Hospital Affiliated to Fudan University, Shanghai 200040, China
[Abstract] Objective To reduce the tissue slice breakage, explore the technique of 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) immunohistochemical staining by blocking buffer in bleach section. Methods BrdU, which was detected by ABC immunohistochemistry on bleach section of brain slides, was used to incorporate the new born cells which were promoted proliferation by motor-driven wheel running. The different blocking effects of Goat serum, trypsin inhibitor and bovine serum albumin were compared in the process of immunohistochemistry. Results In the group of motor-driven wheel running in the dentate gyrus of the hippocampus in rats, the number of BrdU-positive cells was more than the control group. The breaking rate of slides was reduced obviously, especially in the groups with bovine serum albumin and trypsin inhibitor, after being added different blocking reagents. But cells in trypsin inhibitor group were appeared without specific staining. Conclusion Bovine serum albumin is preferable blocking buffer.
[Key words] BrdU; Immunohistochemical staining; Trypsin inhibitor; Bovine serum albumin; Bleach section
5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine, BrdU）是胸腺嘧啶核苷的類似物，在細(xì)胞周期的S期摻入到增殖或分裂細(xì)胞的核內(nèi)，只要細(xì)胞不消亡，BrdU 將永久地存留在胞核DNA 中，且在體或離體都能通過免疫組織化學(xué)的方法檢測到，可用于標(biāo)記BrdU暴露期間進(jìn)行DNA合成的細(xì)胞[1]。故BrdU陽性細(xì)胞可被看作是具有增殖活性的細(xì)胞。
1 材料與方法
1.1 材料
動物：SD大鼠，雌雄不拘，體重220~230 g，蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。試劑：BrdU（ Roche Diagnostic Co.）。
1.2 分組
踏轉(zhuǎn)輪運(yùn)動對成年大鼠海馬齒狀回細(xì)胞增殖的影響。實(shí)驗(yàn)分兩組，①踏轉(zhuǎn)輪運(yùn)動組：轉(zhuǎn)輪速度為10 m/min，每天訓(xùn)練2次（09:00，15:00），每次訓(xùn)練30 min，連續(xù)6 d；②對照組：動物置于轉(zhuǎn)輪中，速度為0。放置次數(shù)與時(shí)間同運(yùn)動組。在染色過程中每一組又分為三個(gè)亞組，分別為加入羊血清組、胰酶抑制劑組和牛血清白蛋白組。
1.3 BrdU標(biāo)記
踏轉(zhuǎn)輪運(yùn)動的第4天開始給藥，于每次運(yùn)動前1 h腹腔注射BrdU（50 mg/kg，美國ROCHE公司），2次/d，連續(xù)3 d。末次給藥后24 h處死動物，從前囟后3.3~5.1 mm作連續(xù)冰凍切片，進(jìn)行BrdU染色。
1.4 BrdU免疫組織化學(xué)
切片經(jīng)2 mol/L HCl（室溫30 min）變性， 用0.01 mol/L PBS 充分漂洗后轉(zhuǎn)入0.1%胰酶中（37℃ 15 min）消化后，0.01 mol/L PBS漂洗（5 min×3次），分別加入羊血清組、胰酶抑制劑組和牛血清白蛋白組，室溫下30 min, 然后加入小鼠抗BrdU單克隆抗體（1∶200，Biosource）室溫孵育16 h，0.01 mol/L PBS漂洗（5 min×3次），轉(zhuǎn)入羊抗小鼠二抗（1∶200，Vector）室溫孵育2 h，再用0.01 mol/L PBS漂洗（5 min×3次），移入親和素生物素試劑（avidin-biotin complex，ABC，1∶200）室溫孵育2 h，最后用含0.03% H2O2的0.05% DAB顯色3~5 min， 0.01 mol/L PBS終止顯色。常規(guī)脫水、透明、封片。鏡檢BrdU陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
隨機(jī)選取每只大鼠位置相同的5張不連續(xù)切片，光學(xué)顯微鏡下（×200）計(jì)數(shù)每張切片雙側(cè)海馬齒狀回顆粒細(xì)胞層（granular cell layer，GCL）免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)。陽性細(xì)胞的均數(shù)作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。用SPSS 10.0軟件作方差分析（one-way ANOVA）檢測組間差異性。
2 結(jié)果
2.1 踏轉(zhuǎn)輪運(yùn)動對成年大鼠齒狀回細(xì)胞增殖的作用
經(jīng)過6 d的踏轉(zhuǎn)輪運(yùn)動訓(xùn)練后，各組BrdU陽性細(xì)胞見圖1。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，海馬齒狀回BrdU陽性細(xì)胞數(shù)，對照組為（22.55±1.91）個(gè)/切片，踏轉(zhuǎn)輪組為（57.89±1.90）個(gè)/切片，兩組相比差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.001）。由此可見，踏轉(zhuǎn)輪運(yùn)動可增加BrdU陽性細(xì)胞，促進(jìn)齒狀回細(xì)胞增殖。
a、a′為對照組， b、b′ 為踏轉(zhuǎn)輪組。a、b分別是a′、b′的高倍視野
圖1 踏轉(zhuǎn)輪運(yùn)動6 d后海馬齒狀回BrdU陽性細(xì)胞數(shù)
2.2 不同的封閉液對組織片染色效果的影響
末次給藥后24 h處死動物，從前囟后3.3~5.1 mm作連續(xù)冰凍切片，將切片隨機(jī)分成三組。在染色過程中，這三組分別加入羊血清、胰酶抑制劑和牛血清白蛋白作為封閉液和終止胰酶作用的抑制劑。各組BrdU陽性細(xì)胞如圖2所示。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，三種方法均能使BrdU著色，但各組的本底顏色和非特異性著色程度不同：羊血清組中雖然陽性細(xì)胞與非特異性著色細(xì)胞有明顯區(qū)別，但非特異性著色細(xì)胞顯色度較深，且遍布整個(gè)視野。胰酶抑制劑組陽性細(xì)胞與非特異性著色細(xì)胞也有明顯差異，而且非特異性著色細(xì)胞顯色度較淺，整個(gè)本底相對較為干凈、清爽。牛血清白蛋白組幾乎見不到非特異性著色細(xì)胞，本底顏色非常淡。
除了本底顏色和非特異著色的觀察外，筆者還重點(diǎn)觀察了組織切片的破損情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：牛血清白蛋白和胰酶抑制劑組無切片破損，而羊血清組有少部分腦片破損。細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示：羊血清組為（23.22±2.38）個(gè)/切片，胰酶抑制劑組為（22.54±2.12）個(gè)/切片，牛血清白蛋白組為（23.14±3.12）個(gè)/切片，各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。
3 討論
自從20世紀(jì)末神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)現(xiàn)以來，其目前已經(jīng)成為神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。而研究在體或移植后的神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、遷移、分化中常用的標(biāo)記新生細(xì)胞的方法有BrdU、3H、Ki-67、 PCNA（proliferating cell nuclear antige）[2-3]，前兩者在細(xì)胞增殖時(shí)整合入細(xì)胞以后，即使在細(xì)胞靜止期仍能表達(dá)；后兩者是細(xì)胞增殖過程中表達(dá)的內(nèi)源性蛋白，當(dāng)細(xì)胞處于靜止期時(shí)，它們并不表達(dá)。因此，BrdU和3H是常用的追蹤細(xì)胞的標(biāo)記物，而BrdU的檢測又較3H更為方便、簡單，所以BrdU是最為常用的標(biāo)記細(xì)胞增殖的標(biāo)記物。
豐富環(huán)境對神經(jīng)發(fā)生有影響，而在各種環(huán)境因素中，運(yùn)動對其影響較為顯著[4-5]。本課題的前期研究建立了踏轉(zhuǎn)輪運(yùn)動的模型[6]，并發(fā)現(xiàn)運(yùn)動對神經(jīng)發(fā)生的作用具有強(qiáng)度依賴性，這早于國內(nèi)外的相關(guān)報(bào)道[7-8] 。故本課題選用運(yùn)動作為促進(jìn)細(xì)胞增殖的方法，觀察了不同的染色方法對切片及結(jié)果的影響。
組織切片BrdU染色時(shí)，常用的方法有貼片法和漂片法。漂片法與貼片法相比有一定的優(yōu)點(diǎn)：前者能使抗體從兩側(cè)滲透，更有利于抗體與抗原充分反應(yīng)，相應(yīng)的在洗片時(shí)，也能使未結(jié)合的抗體充分漂洗干凈；漂片法比貼片法所使用的抗體數(shù)量少，而且必要時(shí)抗體還可以回收，重復(fù)利用。標(biāo)本量大時(shí)，漂片法比貼片法更省時(shí)、省力。但是，用漂片法進(jìn)行BrdU染色時(shí)，由于在加入抗體前要用鹽酸和胰酶對腦片進(jìn)行預(yù)處理，經(jīng)過處理（尤其是胰酶處理）后，進(jìn)行染色的腦片極易破損，從而導(dǎo)致整個(gè)染色過程無法正常完成，或最終所得到的腦片極少。因此，在本實(shí)驗(yàn)中針對胰酶的消化作用，筆者分別選用了與二抗同源的羊血清、牛血清的主要成分白蛋白（牛血清白蛋白）及胰酶抑制劑來抑制（或終止）胰酶的消化作用。
羊血清是免疫組織化學(xué)中常用的封閉液，但是，在本實(shí)驗(yàn)中并未取得預(yù)期的成果，雖然羊血清能終止胰酶的消化作用，但并未能有效地封閉非特異性染色。其原因目前仍不清楚，有待進(jìn)一步研究。胰酶抑制劑（取自火雞蛋清）組和牛血清白蛋白組非特異性染色較少，尤其是牛血清白蛋白組。其原因可能是二者的成分單一，純度較高。
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牛血清白蛋白范文4
【關(guān)鍵詞】 腦梗死 腦卒中 小牛血清去蛋白注射液
腦梗死作為臨床常見的突發(fā)病，目前尚無有效的治療方法，其發(fā)病率和致殘率極高，嚴(yán)重威脅著人們的健康，小牛血清去蛋白注射液對腦細(xì)胞缺血缺氧具有保護(hù)作用，其主要成分為磷酸肌醇寡糖和小分子激活肽［1］，其通過增強(qiáng)腦代謝儲備力，延長細(xì)胞生存時(shí)間，可以持續(xù)多靶點(diǎn)抑制缺血瀑布的啟動和運(yùn)行，并能抑制缺血再灌注損傷，同時(shí)能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)。本文對我院2006年10月-2007年11月應(yīng)用小牛血清去蛋白注射液治療腦梗死進(jìn)行了觀察，旨在探討小牛血清去蛋白注射液治療腦梗死患者的療效及對患者運(yùn)動功能和日常生活能力康復(fù)的影響。
1 資料與方法
1.1 病例入選標(biāo)準(zhǔn)
(1)發(fā)病1周內(nèi)的頸內(nèi)運(yùn)動系統(tǒng)腦梗死患者，診斷符合全國第四屆腦血管疾病會議通過的診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］，均經(jīng)螺旋CT或核磁共振檢查證實(shí)，肌力4級以下(包括4級)，F(xiàn)MA(Fugl-Meyer Assessment)的上下肢運(yùn)動功能評分總分≤50分；(2)年齡在30歲以上，首次發(fā)病或過去發(fā)病未留下神經(jīng)功能缺損者；(3)無嚴(yán)重并發(fā)癥及嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙和智力障礙者。
1.2 分組與治療
符合入選條件的入院病例共74例，按入院日期分為研究組和對照組，其中研究組38例，對照組36例。兩組患者治療前基礎(chǔ)情況相似，具有可比性；兩組病人均給以抗凝、降血壓、溶栓等基礎(chǔ)治療，研究組在基礎(chǔ)治療上加用小牛血清去蛋白注射液20mL溶于生理鹽水250mL中靜脈滴注，1次/日，2周為1個(gè)療程。對照組加腦蛋白水解物20mL溶于生理鹽水250mL中，1次/日，2周為1個(gè)療程。如出現(xiàn)消化道癥狀及顱高壓等嚴(yán)重并發(fā)癥時(shí)可對癥治療，有高血壓、冠心病、糖尿病者可繼續(xù)服用相應(yīng)的藥物。
1.3 療效評定
采用1995年全國第四屆腦血管病會議制定的評定方法［2］；(2)臨床神經(jīng)功能缺損程度評分(Mess)：采用1995年第四屆全國腦血管病學(xué)會議制定的腦卒中患者臨床神經(jīng)功能缺損程度評分草案及治療判斷標(biāo)準(zhǔn)［2］進(jìn)行評定；(3)偏癱的運(yùn)動功能評定采用Fugl-Meyer運(yùn)動功能(FMA)評分法［3］：上肢FMA最高分為66分，下肢FMA為34分，上下肢運(yùn)動總分為100分。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
數(shù)據(jù)以(±s)表示，采用χ2檢驗(yàn)。
2 結(jié)果
2.1 兩組患者的療效比較(表1)
研究組治療有效率高于對照組(χ2=5.01，P＜0.05)。
表1 兩組患者的療效比較（略）
與對照組比較χ2=5.01，P＜0.05
2.2 兩組患者治療前后神經(jīng)功能缺損程度評分比較(表2)
神經(jīng)功能缺損程度評分研究組和對照組患者治療后均低于治療前，對照組又明顯低于治療組(P＜0.05或0.01)。
表2 兩組治療前后神經(jīng)功能缺損程度評分比較（略）
與治療前比較 P＜0.01，兩組比較*P＜0.05
2.3 兩組患者治療前后FMA評分的比較 (表3)
研究組患者治療后上下肢FMA評分均高于治療前(P＜0.01或0.05)，對照組治療后上肢FMA評分高于治療前(P＜0.01)。
表3 兩組治療前后FMA評分比較（略）
與治療前相比P＜0.01；兩組比較*P＜0.05
2.4 不良事件和副反應(yīng)
兩組在治療過程中均未發(fā)現(xiàn)不良事件和副反應(yīng)。治療前后患者的肝腎功能及血尿常規(guī)無明顯變化，心電圖亦無明顯的改變。
3 討論
腦梗死是臨床常見病，其發(fā)病率和致殘率極高，嚴(yán)重威脅著人們的健康。腦卒中后如何促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)功能恢復(fù)一直是人類研究的課題，PET和MRI的出現(xiàn)，使大腦和脊髓的可塑性和功能重組得到了客觀的證據(jù)，證明了神經(jīng)元的內(nèi)在發(fā)育特性和內(nèi)部微環(huán)境是主要的內(nèi)因，而外部環(huán)境的豐富，中樞神經(jīng)刺激和藥物是主要的外因［4］。
小牛血清去蛋白注射液主要成分為磷酸肌醇寡糖(IPOS)和小分子激活肽。藥理研究表明：小分子激活肽是神經(jīng)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的主要成分，通過激活細(xì)胞代謝S6激活酶的活性，促進(jìn)缺氧狀態(tài)下神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)和再生［5］。另外一個(gè)主要成分磷酸肌醇寡糖能夠激活葡萄糖載體，能促進(jìn)葡萄糖向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，并且通過特殊的IPOS載體使得IPOS也可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而糾正能量代謝障礙；可以增加線粒體的呼吸能力和高能磷酸的合成而促進(jìn)細(xì)胞對氧的利用，從而促進(jìn)能量物質(zhì)ATP的生成。它能使神經(jīng)細(xì)胞由糖酵解的代謝途徑轉(zhuǎn)變?yōu)樘怯醒跹趸耐緩剑m正缺血神經(jīng)細(xì)胞的酸中毒，增強(qiáng)腦代謝的儲備能力，延長細(xì)胞的生存時(shí)間。
小牛血清去蛋白注射液能夠減輕腦缺血后再灌注損傷。通過抑制一氧化氮合成酶(eNOS)的活性，從而降低NO的過多形成，進(jìn)而延遲腦缺血后的細(xì)胞毒性水腫，延緩腦缺血損傷的進(jìn)程［6］。基礎(chǔ)試驗(yàn)表明，小牛血清去蛋白注射液能夠顯著減少大腦皮層含水量，同時(shí)，使氧自由基破壞反應(yīng)的產(chǎn)物丙二醛顯著減少［7］，說明小牛血清去蛋白注射液能夠減少氧自由基的生成。
本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用小牛血清去蛋白注射液治療腦梗死療效確切，其總有效率為92.11%，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。我們在研究中還發(fā)現(xiàn)小牛血清去蛋白注射液能夠改善腦梗死患者的日常生活能力，提高生活質(zhì)量，降低患者的致殘率，并且能促進(jìn)腦梗死后神經(jīng)功能的恢復(fù)，對腦梗死的康復(fù)具有增強(qiáng)作用，在治療過程中無不良反應(yīng)，不失為腦卒中后神經(jīng)功能恢復(fù)新的途徑。
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牛血清白蛋白范文5
【關(guān)鍵詞】 中藥活性成分； 牛血清白蛋白； 甘草次酸； 藥物-藥物相互作用
Abstract：ObjectiveTo evaluate the influence of glycyrrhetinic acid (GA) on the binding of active ingredients of Chinese herbs with serum albumin. MethodsSpectroscopic method and capillary electrophoresis frontal analysis were utilized to determine the binding data. Stern-Volmer equation and Scatchard plot were used to process the data. ResultsBinding constant and sites etc of GA with BSA were got. Binding constants of active ingredients of Chinese herbs and influence of GA on the binding of them were aslo obtained. ConclusionThere are two kinds of binding sites (high and low) in BSA while binding with GA and the total binding sites are eight. The binding percentages of GA are up to 95% when the ratio of BSA to GA is 0.38. In the presence of GA， binding constants of active ingredients of Chinese herbs decrease up to 67%， which may exert an influence on their pharmacological action
Key words：Active ingredients of Chinese herbs; Bovine serum albumin; Glycyrrhetinic acid; Drug-drug interaction
近年來，中藥活性成分與血清白蛋白結(jié)合的研究已經(jīng)出現(xiàn)熱潮，如，桑色素［1］， 巖白菜素［2］， 芒果苷［3］， 大黃素［4］等。然而絕大多數(shù)研究以獲得活性成分的結(jié)合特征為目的，只有極少數(shù)研究探討中藥活性成分相互之間對結(jié)合的影響。如中國藥科大學(xué)李萍研究小組最近對中藥湯劑的整體成分與血清白蛋白的結(jié)合進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸補(bǔ)血湯成分間對各自與BSA的結(jié)合有顯著影響［5］，在金銀花整體活性物質(zhì)與牛血清白蛋白相互作用中，綠原酸等3種成分在整體成分與BSA結(jié)合時(shí)比單個(gè)成分與BSA結(jié)合程度低，而咖啡酸、蘆丁則相反［6］。可見，中藥活性成分與蛋白結(jié)合時(shí)相互之間確實(shí)存在協(xié)同效應(yīng)。甘草是最常用的中藥之一，也是常用食品添加劑；甘草中甘草酸含量較大（3%～10%）［7～9］，是甘草中最具特色的活性成分之一；甘草酸在體內(nèi)代謝后以甘草次酸的形式吸收進(jìn)入血液。因此，本文研究了甘草次酸對中藥活性成分與血清蛋白結(jié)合的影響，嘗試從成分之間血漿蛋白結(jié)合的協(xié)同效應(yīng)（藥物-藥物相互作用）探討甘草的配伍規(guī)律，同時(shí)對甘草及相關(guān)藥物的安全、合理用藥提供參考。
1 儀器與材料
1.1 儀器
F-4500型分子熒光分光光度計(jì)（Japan，Hitachi）；Tu-1800SPC型紫外-可見光分光光度計(jì)(北京普析公司)；1cm石英比色皿；微量注射器；微型旋渦混合器，精密天平（Germany，Sartorius），pHS-3酸度計(jì)。J-810圓二色分光光度計(jì)（Japan，Jasco）；彩陸毛細(xì)管電泳系統(tǒng)（北京，中科院化學(xué)所），配紫外檢測器和HW-001色譜工作站（中國，千譜軟件有限公司）；未涂層石英毛細(xì)管，52 cm ×50 μm i.d.，有效長度為44 cm（中國河北永年光學(xué)纖維公司）；超濾管，截留分子量15 000（PALL FILTER CO.， LTD， USA）；TGL－16型高速臺式離心機(jī)（湘儀）。
1.2 試劑
牛血清白蛋白（Roche），以水配成2.0×10-5 mol/L的儲備溶液，4 ℃保存?zhèn)溆茫?8β－甘草次酸（GA，≥97%，F(xiàn)luka， product of Spain）；槲皮素、金絲桃苷、蘆丁、槲皮苷、山萘酚、大黃酸、大黃素對照品，購自中國藥品與生物制品檢定所（中國北京）；甲基蓮心堿（由中南大學(xué)湘雅醫(yī)院藥劑科劉韶惠贈，HPLC純度大于98％）；中藥活性成分均以90%甲醇配成2.5×10-3 mol/L的溶液；pH 7.40的Tris-HCl緩沖溶液；Tris（淮安和元化工有限公司），氯化鈉二水磷酸二氫鈉（河南焦作），鹽酸（湖南師范大學(xué)化學(xué)試劑廠）。除已標(biāo)明者外，試劑均為分析純；水為雙重蒸餾水。
2 方法
2.1 光譜實(shí)驗(yàn)方法
2.1.1 熒光猝滅方法
在10 ml 容量瓶中依次加入2 ml 0.50 mol/L NaCl 溶液、2 ml pH 7.40 的Tris-HCl 緩沖溶液、2 ml BSA儲備溶液，以水定容為10 ml， 搖勻， 在一定溫度下靜置30 min。取該溶液1 ml于石英比色皿中，依次加入一定體積的中藥活性成分溶液（加入總量＜0.03 ml)，旋渦混勻。經(jīng)指定溫度下恒溫放置3 min后，在280 nm的激發(fā)波長下，掃描290～420 nm熒光光譜。在相同條件下，測其紫外光譜。甘草次酸對中藥活性成分的影響是在蛋白中先加入GA，然后按照上述方法進(jìn)行。在實(shí)驗(yàn)條件下活性成分在290～450 nm范圍內(nèi)吸收很小，熒光內(nèi)濾作用可以忽略，故直接對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果為3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值。
2.1.2 圓二色（CD）譜方法
光源系統(tǒng)用氮?dú)獗Ｗo(hù)(流量為5 L/min)，樣品池的光徑為0.1 cm。測量參數(shù)：掃描速率100 nm/min。分辨率0.1 nm，響應(yīng)時(shí)間1 s，累積次數(shù)3次，掃描波段為190～250 nm，BSA濃度為2×10-6 mol/L，實(shí)驗(yàn)時(shí)向BSA中分別加入不同量的甘草次酸，混合均勻后測量，得到其CD譜。
2.2 毛細(xì)管電泳前沿分析（CE-FA）方法
CE運(yùn)行緩沖是pH 7.40，67 mmol/L的磷酸鈉，由適量的二水磷酸二氫鈉溶解于水，然后在pH計(jì)上用2 mmol/L NaOH調(diào)節(jié)到指定的酸度，再經(jīng)過0.45 μm濾膜過濾。BSA儲備液（200 mmol/L）是通過溶解適量的BSA粉末于運(yùn)行緩沖中得到，并于4度冰箱保存。工作蛋白由儲備液用運(yùn)行緩沖稀釋而得。藥物儲備液（2 mmol/L）由運(yùn)行緩沖配制，內(nèi)含30％（V/V）以下甲醇。藥物工作液由其儲備液通過運(yùn)行緩沖稀釋而得，其中甲醇含量小于3％（V/V）。藥物的標(biāo)準(zhǔn)溶液也用于配制其校準(zhǔn)曲線，游離濃度由校準(zhǔn)曲線求得。所有測試溶液在應(yīng)用前進(jìn)行脫氣。
一系列BSA溶液中（20，30，35，40，45，50，55，60 μmol/L） ，加入等量的GA至 160 μmol/L，再加入緩沖至1 ml，渦旋混合30 s。然后在36℃水浴加熱孵化2 h，再于室溫下平衡2 h。若要進(jìn)行超濾，則于室溫平衡后進(jìn)行，即取適量平衡液于超濾管，然后16 000 r/min下進(jìn)行分離，濾液由CE進(jìn)行測定。試樣重復(fù)兩份，結(jié)果取平均值，毛細(xì)管電泳在室溫下進(jìn)行。
新毛細(xì)管要做預(yù)處理，以1 mol/L HCl 沖洗30 min，水沖洗5 min，1 mol/L NaOH沖洗30 min，然后水沖洗5 min，磷酸鹽緩沖沖洗15 min。為了獲得較好的峰形和遷移時(shí)間的重現(xiàn)性，毛細(xì)管在每天實(shí)驗(yàn)開始按照下列程序進(jìn)行沖洗和平衡：水沖洗2 min，1 mol/L氫氧化鈉沖洗2 min，水沖洗2 min，緩沖沖洗5 min。
在每次測量之間，毛細(xì)管以水沖洗2 min，1 mol/L氫氧化鈉沖洗2 min，水沖洗2
min，再以緩沖沖洗2 min。在這樣的條件下，可以保證消除蛋白的吸附。平衡后的BSA-GA液或超濾液重力進(jìn)樣60 s（毛細(xì)管進(jìn)出口高度差為30 cm）。運(yùn)行電壓為19 kV，常規(guī)極性運(yùn)行，典型電流為85 mA，紫外檢測波長為254 nm。
3 結(jié)果
3.1 甘草次酸與BSA作用的研究
3.1.1 甘草次酸對BSA 的熒光猝滅光譜甘草次酸在與BSA 作用的過程中能顯著地猝滅BSA 的熒光，這種猝滅在GA加入便可迅速觀察到，這提示［10］BSA的一個(gè)高親和結(jié)合位點(diǎn)位于色氨酸殘基的附近。測得297 K甘草次酸對BSA的熒光猝滅光譜見圖1。在此過程中，GA/BSA=3時(shí)，最大發(fā)射峰由341 nm變?yōu)樽罱K的337 nm，略有藍(lán)移，顯示色氨酸殘基所處環(huán)境的疏水性增加。并最終移至334 nm，在研究范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度下降87.6％，說明GA和BSA發(fā)生了結(jié)合作用，并使BSA的構(gòu)象發(fā)生了變化。此外，可以觀察到色氨酸熒光下降幅度比酪氨酸大。見圖1。
3.1.2 熒光猝滅作用的Stern-Volmer分析見圖2。圖2是根據(jù)Stern-Volmer 猝滅方程（方程1）作圖，式中，F(xiàn)為有猝滅劑時(shí)BSA 的熒光強(qiáng)度， F0為無猝滅劑時(shí)BSA 的熒光強(qiáng)度， ［Q］為猝滅劑濃度，KSV 為動態(tài)猝滅常數(shù)，Kq 為動態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)， 各類熒光猝滅劑對生物大分子的最大動態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)約為2.0×1010 L·mol-1·s-1［1］；τ0 為無猝滅劑時(shí)熒光分子的平均壽命。從圖2可見，在pH 7.40時(shí)，猝滅呈現(xiàn)兩種不同的模式，這表明，GA與BSA的有兩類不同的結(jié)合位點(diǎn)。由斜率求的前半段（［GA］/ ［BSA］≈3），得在297K，Kq=2.47×1013 L·mol-1·s-1， R=0.999 1；在292 K， Kq=2.26×1013 L·mol-1·s-1， R=0.997 5；在287 K， Kq=2.11×1013 L·mol-1·s-1， R=0.998 8。而GA與BSA濃度比大于3之后也有較好的線性，297 K時(shí)Kq為2.74×1012 L·mol-1·s-1。很顯然，由于由于各類猝滅劑對生物大分子最大擴(kuò)散控制的碰撞猝滅常數(shù)為2.0×1010 L·mol-1·s-1，而由GA引起的BSA的猝滅速率常數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于此值，由此可見，GA對BSA的兩類猝滅不是動態(tài)而是靜態(tài)猝滅。
F0/F＝1＋KSV［Q］＝1＋Kqτ0［Q］ ①
3.1.3 結(jié)合常數(shù)假定小分子在生物大分子上有n個(gè)相同且獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)，則小分子與生物大分子的結(jié)合平衡可以由方程②［11］ 表示。
lg(F0-F)/F) =lgK+nlg［Q］②
這里，K表示某類結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合常數(shù)；n表示一個(gè)BSA中某類結(jié)合位點(diǎn)能夠結(jié)合的小分子數(shù)目，即結(jié)合位點(diǎn)數(shù)；［Q］表示游離小分子濃度，在研究中通常以其總濃度代替。根據(jù)方程②，以低濃度的GA（GA/BSA＜3）進(jìn)行試驗(yàn)，求得GA的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別為：在297 K， K =8.28× 105 L·mol-1， n =1.12 (R=0.998 5) ；292 K ，K =1.60× 105 L·mol-1 n =1.04 (R=0.996 0)；在287 K， K =1.60× 105 L·mol-1， n=0.986 (R=0.998 1) 。
CE-FA測定的藥物-蛋白結(jié)合數(shù)據(jù)通過Scatchard作圖（方程③）進(jìn)行處理，方程中，r是結(jié)合的藥物濃度于蛋白濃度的比率，Df是游離藥物濃度，K是結(jié)合常數(shù)，n是一個(gè)蛋白分子的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。藥物結(jié)合的百分?jǐn)?shù)（PB）用方程④進(jìn)行計(jì)算。
r/Df ＝－Kr＋nK
③
PB (℅) ＝100 (Dt－Df)/ Dt ④
圖3是GA與BSA結(jié)合的Scatchard作圖。圖中呈現(xiàn)兩類不同的線性，根據(jù)Scatchard方程，直線在X軸的截距即為結(jié)合的位點(diǎn)數(shù)，分別為3.0和5.3，所對應(yīng)的高低親和位點(diǎn)的結(jié)合常數(shù)分別為6.70×105 L·mol-1和5.49×104 L·mol-1，該數(shù)值與熒光法的結(jié)果相近。160 μmol/L的GA在不同濃度的BSA中的結(jié)合率如表1所示。蛋白與藥物濃度之比為0.375時(shí)，結(jié)合率已高達(dá)95.2％，因此，可以預(yù)測，GA在體內(nèi)是與血清蛋白高度結(jié)合的。表1 GA在不同濃度BSA中的結(jié)合百分?jǐn)?shù) （略）
3.1.4 甘草次酸與BSA結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)及作用力藥物小分子與生物大分子的作用力包括氫鍵，范德華力，靜電引力，疏水作用力等，藥物不同，與牛血清白蛋白作用力類型也不相同。當(dāng)溫度變化不大的時(shí)候，反應(yīng)的焓變可以視作常數(shù)，根據(jù)van't Hoff熱力學(xué)方程（方程⑤）可以計(jì)算出藥物小分子與生物大分子作用間的有關(guān)熱力學(xué)常數(shù)：G0=-RTlnK=H0-TS0; lnK=-H0/RT+S0/R ⑤
H0， G0， S0分別表示焓，自由能和熵的變化。根據(jù)方程②的結(jié)果，在pH 7.40，第一類結(jié)合位點(diǎn)的H0 = 117KJ/mol ，S0＝507 J/(K.mol)，H0>0 ，S0>0，可以推斷，GA與BSA的結(jié)合力在pH7.40是典型的疏水作用［12］
3.1.5 甘草次酸在BSA結(jié)合位點(diǎn)的確定血清白蛋白至少有三個(gè)特異的高親和藥物結(jié)合位點(diǎn)，分別稱為藥物結(jié)合的site Ⅰ～Ⅲ。血清白蛋白的重要結(jié)合位點(diǎn)位于site I 和siteⅡ，分別對應(yīng)于ⅡA和ⅢA亞結(jié)構(gòu)域。許多藥物對血清白蛋白的結(jié)合具有特異性，如苯基保泰松（PB）結(jié)合于site I，氯滅酸（FA）和布洛芬（IB）結(jié)合于siteⅢ，地高辛（digitoxin）結(jié)合于site Ⅲ，這些藥物可以用作位置探針（site-probe）。本試驗(yàn)利用PB、FA和IB作為位置探針，研究GA與這些藥物的競爭結(jié)合情況。在與BSA等物質(zhì)的量的PB、FA和IB存在下，利用方程進(jìn)行計(jì)算，相應(yīng)的結(jié)合常數(shù)K的數(shù)值分別為，1.72×105，R=0.999 6; 9.04×105，R=0.999 2；9.48×105， R=0.994 8。 考慮到在同樣條件下，無探針時(shí)結(jié)合常數(shù)K是8.28×105，顯然GA與BSA的結(jié)合受到PB的影響較大而幾乎不受FA和IB的影響。因此，可以推斷site I是GA的高親和結(jié)合位點(diǎn)之一。
3.1.6 甘草次酸與BSA結(jié)合距離GA的吸收光譜和BSA的發(fā)射光譜存在重疊。根據(jù)Fster［11］-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移理論。求重疊光譜的積分，J＝8.926×10-15 cm3·L·mol-1。用K2=2/3， N=1.36， Φ=0.15［1］，求得R0＝2.47 nm，而計(jì)算得能量轉(zhuǎn)移效率E＝0.514，最后可以得到GA到色氨酸殘基的距離r=2.45 nm。r和R0的數(shù)值均在理論的范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)移的距離r
3.1.7 圓二色譜研究甘草次酸對BSA構(gòu)象的影響圖4是BSA在GA存在下的圓二色譜。由圖可見，BSA在210 nm和220 nm附近有明顯的負(fù)峰，GA加入使峰強(qiáng)度呈現(xiàn)減少的趨勢，GA濃度不大時(shí)，強(qiáng)度變化不大。根據(jù)文獻(xiàn)［11］計(jì)算方法，得不同GA濃度下BSA中α螺旋的比例的變化情況（表2），結(jié)果表明GA加入對BSA構(gòu)象產(chǎn)生影響，α螺旋的比例下降。表2 GA存在下BSA (2 μmol/L) 中α螺旋的變化（略）
3.2 甘草次酸對中藥活性成分與BSA作用的影響用熒光猝滅法對槲皮素、金絲桃苷、蘆丁、槲皮苷、山萘酚、大黃酸、大黃素、甲基蓮心堿與BSA的結(jié)合進(jìn)行了研究，同時(shí)探討了甘草次酸對活性成分結(jié)合的影響。所選取的黃酮（苷）和大黃酸、大黃素等都能明顯地猝滅BSA的熒光，猝滅數(shù)據(jù)直接按照方程①、②、⑥行處理，結(jié)果（3次平行試驗(yàn)）列于表3。從表可以看出，黃酮比相應(yīng)的黃酮苷的結(jié)合要強(qiáng)，苷元的結(jié)合要比對應(yīng)的苷的結(jié)合強(qiáng)。甘草次酸對黃酮苷的結(jié)合有很大的影響，結(jié)合常數(shù)下降54.6%～67.3%。甘草次酸的存在使山萘酚和槲皮素的結(jié)合常數(shù)有所下降，而對大黃酸、大黃素和甲基蓮心堿的結(jié)合常數(shù)影響較少。從結(jié)合常數(shù)看，黃酮苷一般在104，而其它幾種物質(zhì)與GA都為105，可見中藥活性成分與GA結(jié)合常數(shù)的相對大小可能是影響甘草次酸能否對其結(jié)合產(chǎn)生影響的一個(gè)重要因素之一。故甘草次酸可能對其它中藥活性成分的藥理作用產(chǎn)生影響。表3 甘草次酸對中藥活性成分與BSA結(jié)合的影響（略）
(F0-F)-1=F0-1+K-1F0-1［Q］-1 ⑥
4 小結(jié)
利用多種光譜技術(shù)和毛細(xì)管電泳前沿分析方法對甘草次酸與BSA的結(jié)合進(jìn)行了研究，獲得甘草次酸與BSA結(jié)合的結(jié)合常數(shù)、熱力學(xué)參數(shù)、作用力類型、位點(diǎn)數(shù)等參數(shù)，位置探針方法確定GA的結(jié)合位點(diǎn)，并通過能量轉(zhuǎn)移確定GA與色氨酸殘基的距離，同時(shí)以圓二色譜考察GA對BSA構(gòu)象的影響。結(jié)果顯示光譜方法獲得的結(jié)合常數(shù)與毛細(xì)管電泳前沿分析方法的結(jié)果基本一致，但是兩種方法在確定位點(diǎn)數(shù)時(shí)差距較大。結(jié)果還表明甘草次酸對中藥活性成分與BSA的結(jié)合有較大影響，可能對其它中藥活性成分的藥理作用產(chǎn)生影響。
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牛血清白蛋白范文6
[關(guān)鍵詞] 類風(fēng)濕因子； 膠乳凝集試驗(yàn)； 臨床應(yīng)用
[中圖分類號] R446.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1005-0515（2011）-12-345-01
類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor,RF)是在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人血清中發(fā)現(xiàn)。是一種以變性IgG為靶抗原的自身抗體，無種屬特異性。主要存在于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的血清和關(guān)節(jié)液中，它是一種抗變性IgG的抗體，屬IgM型。可與IgGFc段結(jié)合。RF有IgG、IgA、IgM等多種Ig類型，以IgM類型多見。檢測RF對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的診斷、分型和療效觀察有著重要的意義。
RF是一種主要發(fā)生于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)病人體內(nèi)的抗人變性IgG自身抗體，可與IgG的Fc段結(jié)合。膠乳凝集試驗(yàn)是將變性IgG包被于聚苯乙烯膠乳顆粒上，這種致敏膠乳在與待測血清中的RF相遇時(shí)，于一定時(shí)間內(nèi)發(fā)生肉眼可見的凝集。
1 對象與材料
1.1 研究對象 1)體檢健康組：在本院體檢中心體檢健康者410例，其中：男性：180例，女性：230例，年齡 25-75 歲。2)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎組：經(jīng)臨床診斷為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者42例，其中：男性：9例，女性：33 例，年齡 29-76歲。
1.2 標(biāo)本采集與保存 空腹采集靜脈血3ml，30min后離心分離血清，當(dāng)日完成檢測，或置2-8℃保存，第2天完成檢測。
1.3 方法與試劑 手工操作法。類風(fēng)濕因子(RF)測定試劑盒(膠乳凝集法)。
1.4 試劑主要成份 膠乳液成份：類風(fēng)濕因子膠乳、牛血清白蛋白、磷酸鹽緩沖液；陽性對照成份：羊抗人IgG抗血清、牛血清白蛋白、磷酸鹽緩沖液；陰性對照成份：牛血清白蛋白、磷酸鹽緩沖液。
1.5 測定原理 膠乳凝集試劑是由純化的人IgG和羧化聚苯乙烯膠乳共價(jià)交聯(lián)而成的抗原膠乳。RF膠乳超過20U/ml即出現(xiàn)肉眼可見的凝集顆粒。
2 實(shí)驗(yàn)與結(jié)果
2.1 定性實(shí)驗(yàn) 試劑自冰箱取出后恢復(fù)至室溫(18-25℃)；輕輕混勻膠乳試劑；核對陽性和陰性對照，在反應(yīng)板孔中加一滴未稀釋血清(20ul)；然后加一滴膠乳試劑在血清中；攪勻、輕輕搖動使其充分混合，二分鐘后于直射光下觀察結(jié)果。每次試驗(yàn)均設(shè)陽性與陰性對照。
2.2 半定量實(shí)驗(yàn) 血清以生理鹽水(0.9g氯化鈉溶解于蒸餾水中，稀釋至100ml)倍比稀釋。見表1。
2.3 結(jié)果判定 定性實(shí)驗(yàn)：2min出現(xiàn)肉眼可見凝集者為陽性(RF＞20U/ml)；無凝集出現(xiàn)者為陰性(RF＜20U/ml)。半定量試驗(yàn)：1:2稀釋血清出現(xiàn)凝集者為40U/ml；1:4稀釋血清出現(xiàn)凝集者為80U/ml；1:8稀釋血清出現(xiàn)凝集者為160U/ml；1:16稀釋血清出現(xiàn)凝集者為320U/ml。
2.4 參考范圍 正常人血清RF＜20U/ml。
2.5 初步臨床應(yīng)用 在健康體檢者的410例測定中，RF出現(xiàn)凝集(＞20U/ml)的19例占4.6%。已確定的42例類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中，RF出現(xiàn)凝集(＞20U/ml)的38例占90.4%。
3 討論 膠乳凝集法主要是測定IgM類RF(IgG、IgA類RF極少)，據(jù)全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程報(bào)道：70%-90%的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者的RF呈陽性。因此，RF測定是美國風(fēng)濕病學(xué)會1987年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。但是RF陰性也不能排除類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)診斷。除RA外，還有其他很多疾病RF亦可陽性，如干燥綜合征，混合性結(jié)締組織病，2型混合性冷球蛋白血癥，慢性活動性肝炎、亞急性細(xì)菌性心內(nèi)膜炎，全身性紅斑狼瘡，多種細(xì)菌真菌、螺旋菌等，健康人群中約有5%的人RF陽性。
本研究結(jié)果說明，膠乳凝集法90.4%的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者的RF呈陽性，健康人群中約有4.6%的人RF陽性。此結(jié)果與全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程報(bào)道的結(jié)論相符。此方法可定量或半定量，靈敏度高，血清用量少、操作簡單、便于在基層醫(yī)院推廣使用。
參考文獻(xiàn)
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