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1牙齒組織的發(fā)育來源

顱面部發(fā)育是包含了多個(gè)不同發(fā)育來源的干細(xì)胞相互作用的復(fù)雜過程。牙齒包含至少2個(gè)胚層來源的組織，外胚層來源的口腔上皮形成牙釉質(zhì)，中胚層形成牙齒其余結(jié)構(gòu)，如牙髓、牙本質(zhì)和牙骨質(zhì)。而顱面部其他骨組織（如顱骨的扁骨）則主要來源于間充質(zhì)前體細(xì)胞、中胚層前體細(xì)胞及細(xì)胞基質(zhì)。牙齒組織發(fā)生始于胚胎發(fā)育第5周，并持續(xù)整個(gè)乳牙替換期。胚胎5周后，原始口腔上皮帶形成并在未來牙板上下頜部增厚。上皮帶內(nèi)陷形成前庭板和牙板。成釉器的形成始于牙板下方并經(jīng)歷了牙齒發(fā)育3個(gè)階段：蕾狀期、帽狀期、鐘狀期。在蕾狀期，上皮細(xì)胞遷移至外胚間充質(zhì)下方，外胚間充質(zhì)細(xì)胞排列更加緊密包繞牙蕾。接著，在帽狀期牙蕾細(xì)胞進(jìn)一步增殖形成帽狀結(jié)構(gòu)。上皮細(xì)胞形成成釉器，外胚間充質(zhì)細(xì)胞在成釉器下方增殖形成牙乳頭。包繞牙乳頭的地方形成牙囊。鐘狀期，成釉器內(nèi)表面進(jìn)一步加深，細(xì)胞開始分化。牙內(nèi)皮細(xì)胞與牙乳頭通過基膜相互作用。牙內(nèi)皮細(xì)胞與牙乳頭細(xì)胞停止增殖，細(xì)胞核遷移至基膜對(duì)側(cè)，細(xì)胞伸長。牙內(nèi)皮細(xì)胞成為牙釉質(zhì)前體細(xì)胞并釋放信號(hào)，牙乳頭成為成牙本質(zhì)細(xì)胞。成牙本質(zhì)細(xì)胞不斷分泌有機(jī)基質(zhì)，即前期牙本質(zhì)，成牙本質(zhì)細(xì)胞滲出突起，胞體向牙髓中央移動(dòng)。成牙本質(zhì)細(xì)胞分泌羥基磷灰石及礦物質(zhì)，前期牙本質(zhì)成為牙本質(zhì)。牙釉質(zhì)前體細(xì)胞形成牙釉質(zhì)，成為成釉細(xì)胞。牙根的發(fā)育與牙冠不同。內(nèi)釉上皮與外釉上皮細(xì)胞層從頸環(huán)開始向下方生長形成牙根赫威特上皮根鞘。赫威特上皮根鞘誘導(dǎo)牙乳頭分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞形成根部牙本質(zhì)。成牙骨質(zhì)細(xì)胞、牙周膜纖維細(xì)胞及牙槽骨成骨細(xì)胞這3種細(xì)胞對(duì)牙齒在牙槽窩中起到支持、平衡作用，并都來自牙乳頭，統(tǒng)稱為牙周組織。牙周膜的干細(xì)胞和前體細(xì)胞具有多種自我更新及分化潛能。

2種子細(xì)胞在牙髓再生中的策略

2.1利用干細(xì)胞進(jìn)行牙髓再生

利用干細(xì)胞進(jìn)行牙髓再生的定義是將外源性干細(xì)胞植入宿主根管系統(tǒng)中進(jìn)行牙髓再生。被移植的細(xì)胞或來源于宿主體內(nèi)或來源于異體細(xì)胞。這些細(xì)胞經(jīng)過簡單分離或通過培養(yǎng)擴(kuò)增后用于牙髓再生。由于干細(xì)胞能夠?qū)ξh(huán)境變化做出反應(yīng)，進(jìn)行細(xì)胞分化及細(xì)胞分裂，因此干細(xì)胞治療能夠有效地修復(fù)組織缺損。有許多研究表明，體內(nèi)移植牙髓干細(xì)胞或其他種類干細(xì)胞可以在異位形成牙髓樣組織。Huang等的研究報(bào)道了將根尖牙乳頭干細(xì)胞或牙髓干細(xì)胞植入牙根并埋入小鼠背部，可以觀察到牙髓樣組織形成及牙本質(zhì)的沉積。Cordeiro等報(bào)道了人脫落乳牙干細(xì)胞復(fù)合凝膠植入牙片后埋入小鼠背部皮下，可以觀察到血管化牙髓樣組織形成。細(xì)胞移植有許多優(yōu)點(diǎn)，如可控制移植的細(xì)胞數(shù)量及優(yōu)化最適宜牙髓再生的干細(xì)胞亞群。經(jīng)分選的細(xì)胞具有更強(qiáng)能力，促使在根管中形成神經(jīng)、血管及牙本質(zhì)。Iohara等報(bào)道牙髓細(xì)胞中CD31-/CD146-或CD105+細(xì)胞亞群，比其他前體細(xì)胞具有更高自我更新能力及分化潛能。一些非牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞，如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞也能形成牙髓樣組織。盡管獲得這些細(xì)胞會(huì)給患者造成創(chuàng)傷，但當(dāng)牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞無法獲取時(shí)，這些細(xì)胞可成為替代的候選細(xì)胞。關(guān)于干細(xì)胞移植進(jìn)行牙髓再生的研究報(bào)道，主要集中于不同種類的干細(xì)胞復(fù)合支架材料，體內(nèi)移植后進(jìn)行原位或異位牙髓樣組織再生觀察的基礎(chǔ)性工作。真正進(jìn)入牙髓組織再生臨床前或臨床試驗(yàn)的研究報(bào)道較少。盡管這些基礎(chǔ)研究工作具有科學(xué)意義，但在細(xì)胞移植技術(shù)在向臨床治療的轉(zhuǎn)化過程中仍然遇到很多問題。首先，用于治療的干細(xì)胞來源問題。如果使用的是源于非人種屬的干細(xì)胞，將會(huì)由于免疫排斥的問題受到限制。具有免疫原性的細(xì)胞移植可能會(huì)引起免疫排斥及感染。細(xì)胞冷凍儲(chǔ)存系統(tǒng)可能出現(xiàn)細(xì)胞流失，并增加額外花費(fèi)。而傳統(tǒng)組織工程技術(shù)中的種子細(xì)胞來源、培養(yǎng)技術(shù)、對(duì)支架的復(fù)合程度、植入體內(nèi)后潛在的免疫原性、細(xì)胞活性等因素都限制了該技術(shù)的實(shí)際臨床應(yīng)用。

2.2無細(xì)胞移植的牙髓再生治療

牙髓再生的臨床轉(zhuǎn)化，不僅要滿足安全、有效兩個(gè)基本條件，還應(yīng)考慮到簡便、實(shí)用和經(jīng)濟(jì)的原則。哈佛大學(xué)干細(xì)胞與再生生物學(xué)研究中心的研究發(fā)現(xiàn)，在多種組織再生過程中都存在體內(nèi)干細(xì)胞的遷移和募集現(xiàn)象，稱為干細(xì)胞歸巢（stemcellshoming）。這些募集的機(jī)體自身干細(xì)胞都不同程度地參與了創(chuàng)傷愈合和組織再生的過程。現(xiàn)已證實(shí)，機(jī)體干細(xì)胞歸巢可以通過2種完全不同的途徑來實(shí)現(xiàn)：一種是非血流依賴性的運(yùn)動(dòng)，主要是近距離的細(xì)胞募集，例如缺損組織相鄰干細(xì)胞龕中的干細(xì)胞可以感應(yīng)損傷產(chǎn)生的信號(hào)分子，通過主動(dòng)的變形蟲樣運(yùn)動(dòng)，到達(dá)組織缺損區(qū)域，發(fā)揮再生作用；另一種是血流依賴性遷徙，主要是遠(yuǎn)程機(jī)體干細(xì)胞龕（例如骨髓）中干細(xì)胞的動(dòng)員和歸巢，包括細(xì)胞感受信號(hào)刺激，動(dòng)員機(jī)體干細(xì)胞龕中干細(xì)胞入血，隨血流（bloodflow）遠(yuǎn)程遷徙，最后到達(dá)損傷區(qū)域局部毛細(xì)血管，穿透血管壁，參與組織修復(fù)過程。由于減少了潛在的污染、過高的成本、免疫排斥以及復(fù)雜的體外規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)等缺點(diǎn),利用細(xì)胞因子和趨化因子等實(shí)現(xiàn)細(xì)胞歸巢,可放大宿主自我修復(fù)潛能,因此細(xì)胞歸巢技術(shù)似乎比細(xì)胞移植具備更多的優(yōu)勢(shì)。現(xiàn)在已經(jīng)證實(shí)干細(xì)胞巢/巢存在于體內(nèi)很多成體組織或器官中,包括腦、骨髓、外周血、血管、骨骼肌肉、皮膚、牙齒、心臟、腸、肝、卵巢上皮和睪丸等。盡管干細(xì)胞歸巢的生物機(jī)制尚未完全闡明，但歸巢的干細(xì)胞參與組織修復(fù)再生的現(xiàn)象已經(jīng)引起了學(xué)者的高度關(guān)注，并在動(dòng)物研究中得到證實(shí)。Kim等學(xué)者通過細(xì)胞歸巢技術(shù)觀察到牙髓樣組織的異位再生。他們通過對(duì)臨床拔除的人離體牙進(jìn)行根管預(yù)備，包括牙髓拔除及機(jī)械預(yù)備，通過高溫滅菌去除牙齒中的生物活性及有機(jī)成分，采用生長因子復(fù)合膠原支架植入離體牙內(nèi)，經(jīng)過3~6周大鼠皮下體內(nèi)移植，可以觀察到全長根管內(nèi)形成牙髓血管、牙本質(zhì)及神經(jīng)復(fù)合物。該研究首次描述了通過內(nèi)源性細(xì)胞歸巢技術(shù)進(jìn)行牙髓再生。他們選用一些生長因子如成纖維細(xì)胞生長因子，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，神經(jīng)生長因子（NGF）以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（,BMP-7）用于牙髓再生。細(xì)胞歸巢的含義來源于骨髓移植后，造血干細(xì)胞（HSC）在體內(nèi)的遷移，從骨髓到外周最終到達(dá)干細(xì)胞龕內(nèi)。細(xì)胞歸巢技術(shù)的最大優(yōu)勢(shì)在于能夠利用宿主體內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行組織再生，從而避免外源性細(xì)胞處理過程。

3生物支架材料在牙髓再生中的應(yīng)用

不論是細(xì)胞移植還是自體細(xì)胞歸巢進(jìn)行牙髓組織再生，生物支架材料的選擇都是非常重要的考慮因素。使用能維持干細(xì)胞生存以及血管神經(jīng)再生的支架材料，使組織工程牙髓進(jìn)入臨床應(yīng)用變得更為現(xiàn)實(shí)。牙髓組織再生的支架材料應(yīng)該具有如下特征：有合適的空隙率，便于植入干細(xì)胞或前體細(xì)胞及生長因子傳遞營養(yǎng)物質(zhì)；具有可控的生物降解性，植入機(jī)體內(nèi)的支架材料可被自體組織取代；優(yōu)良的生物機(jī)械性，可供軟硬組織附著的良好的生物活性；良好的生物相容性，無免疫排斥。目前牙髓組織再生的研究多集中于異位再生。天然多聚材料因含有天然的細(xì)胞外基質(zhì)成分而具有良好的生物相容性及生物降解性。Zhang等使用膠原海綿、多孔陶瓷及纖維狀鈦網(wǎng)復(fù)合牙髓干細(xì)胞進(jìn)行研究，4周后可以觀察到牙本質(zhì)涎蛋白的表達(dá)，裸鼠皮下植入細(xì)胞支架材料6~8周后，可以看到支架材料表面有牙本質(zhì)涎蛋白的表達(dá)及結(jié)締組織再生，而陶瓷組織則有鈣化組織形成。聚乳酸（PLA）、聚羥基乙酸(PGA)和二者共聚物，是目前組織工程領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的材料之一。El-Backly等將從兔牙牙髓中提取的DPSC復(fù)合于PLGA上，并植入家兔皮下，12d后觀察到牙骨質(zhì)及管狀牙本質(zhì)的形成。Huang等將人SCAP及DPSC分別與PLGA復(fù)合并接種于長約6～7mm，孔徑約2.5mm的牙本質(zhì)管中，一端使用三氧礦物聚合物封閉1mm后植入裸鼠皮下，3月后觀察發(fā)現(xiàn)，在管腔內(nèi)充滿有血管化的牙髓樣組織;在牙本質(zhì)管內(nèi)壁上有連續(xù)的牙本質(zhì)樣物質(zhì)沉積。這些材料的生物相容性好，降解速率可控，具有良好可塑性，能滿足不同復(fù)合方法和置入條件的需要。膠原是一種天然的蛋白質(zhì)，可從動(dòng)物的皮膚、骨骼、韌帶等組織中提取，因其優(yōu)越的生物相容性、生物可降解和弱抗原性而被廣泛應(yīng)用于組織工程支架材料。Prescott等將DPSC聯(lián)合牙基質(zhì)蛋白(dentinmatrixprotein1，DMP1)與膠原支架復(fù)合后，接種于牙本質(zhì)片上并植入裸鼠皮下，6周后觀測到了牙髓樣組織生成。通過細(xì)胞歸巢技術(shù)，膠原凝膠溶液復(fù)合多種生長因子（如PDGF,FGF,VEGF等）可以觀察到牙髓組織異位再生。

4生長因子在牙髓再生中的考慮

牙髓干細(xì)胞在牙髓組織中的增殖、分化、生存及活力受到多種信號(hào)分子、受體及轉(zhuǎn)錄因素的調(diào)控。不論采用干細(xì)胞移植技術(shù)還是基于細(xì)胞歸巢技術(shù)進(jìn)行牙髓再生研究，生長因子對(duì)牙髓細(xì)胞的作用均不可忽視。不同的信號(hào)通路參與調(diào)控牙髓再生的全過程，由多條信號(hào)通路交織成的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)在牙髓再生過程中發(fā)揮著必不可少的作用。牙髓細(xì)胞表達(dá)多種不同的生長因子，這些生長因子協(xié)同在病理生理?xiàng)l件下調(diào)節(jié)牙髓的血管形成及牙本質(zhì)形成。血小板衍生生長因子（PDGF）是由血小板釋放的生長因子，在血管形成及細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮作用。有研究表明，PDGF能促進(jìn)人牙髓組織中成纖維細(xì)胞增殖，并增強(qiáng)成骨細(xì)胞中VEGF表達(dá)并促進(jìn)牙髓損傷部位血管形成。體內(nèi)研究中，將根管處理后的人牙埋入大鼠背部，可以觀察到PDGF能促進(jìn)牙髓牙本質(zhì)樣組織形成。BMP2與VEGF是牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體中發(fā)現(xiàn)的生長因子，參與牙髓愈合反應(yīng)過程。最近的研究表明VEGF與BMP2以劑量依賴方式相互作用，并在牙髓血管形成中發(fā)揮作用。轉(zhuǎn)化生長因子在牙齒及牙本質(zhì)發(fā)育過程中發(fā)揮作用。研究表明，TGF-β1能刺激Ⅰ型膠原合成，增強(qiáng)堿性磷酸酶活性，促進(jìn)牙髓細(xì)胞增殖。Melin等學(xué)者研究表明TGF-β1參與調(diào)節(jié)牙髓組織的細(xì)胞增殖、遷移、細(xì)胞外基質(zhì)形成過程。TGF-β1對(duì)根尖牙乳頭來源及其他類型的細(xì)胞均有趨化作用。在細(xì)胞招募階段，TGF-β1這種趨化性可以吸引更多的干細(xì)胞或前體細(xì)胞至牙齒受損部位。

5結(jié)語

綜上所述，如何通過組織工程技術(shù)進(jìn)行牙髓再生治療，獲得有活力的牙髓組織這一問題已經(jīng)受到越來越多的關(guān)注。學(xué)者們開展了許多體內(nèi)外研究，無論是干細(xì)胞移植還是無細(xì)胞移植的牙髓再生，已經(jīng)獲得了一些肯定的結(jié)果，但真正做到牙髓再生的臨床轉(zhuǎn)化工作，還有許多問題亟待解決。如何通過簡單、低成本、易于操作的牙髓治療方式讓牙髓恢復(fù)活力，成為目前學(xué)者們競相思考的問題。

作者：李琳 王佐林 單位：同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔生物醫(yī)學(xué)及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室牙體牙髓教研室