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【摘要】探討定坤丹口服液與定坤丹水蜜丸對(duì)雌性去勢(shì)大鼠模型的性激素調(diào)節(jié)作用，并對(duì)兩種 劑型的藥效進(jìn)行對(duì)比。方法：將雌性 SD 大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（給予補(bǔ)佳樂(lè) 0. 12 mg/kg）、定坤丹水蜜丸組（給藥劑量為 1. 75 g/kg）以及定坤丹口服液高、中、低劑量組（給藥劑量分 別為 10、5、2. 5 mL/kg）。除空白組外，其余大鼠采用手術(shù)去除雙側(cè)卵巢的方法建立去勢(shì)大鼠模型，術(shù) 后 1 周開(kāi)始灌胃給藥，每天灌胃 1 次，連續(xù)灌胃 4 周。給藥期間觀察大鼠一般狀態(tài)；ELISA 法檢測(cè)大鼠 血清中卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）、孕酮（P）、前列腺素 E2（PGE2）及前列腺素 F2α（PGF2α）水平的變化情況；取全血放入促凝管中測(cè)定凝血功能；摘取子宮計(jì)算臟器系數(shù)，并通過(guò) HE 染色法檢測(cè)大鼠子宮的病理變化。結(jié)果：給藥期間，與模型組相比，定坤丹口服液中劑量組大鼠體 質(zhì)量明顯增加（P < 0. 01），與定坤丹水蜜丸組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0. 05）；子宮指數(shù)結(jié)果顯示， 與模型組相比，定坤丹口服液各劑量組、定坤丹水蜜丸組及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠子宮指數(shù)均較模型組顯著 升高（P < 0. 01）；凝血功能結(jié)果顯示，與模型組相比，定坤丹口服液高劑量組大鼠的 PT 值顯著降低 （P < 0. 05），定坤丹口服液高、中劑量組及定坤丹水蜜丸組大鼠的 TT 值較模型組明顯降低（P < 0. 01， P < 0. 05），定坤丹口服液與定坤丹水蜜丸組大鼠 PT 及 TT 值相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0. 05）；ELISA 結(jié)果顯示，與模型組相比，定坤丹口服液各劑量組、定坤丹水蜜丸組大鼠血清 P、E2、PGE2 水平均不同 程度升高，LH、FSH、PGF2α 水平均不同程度降低（P < 0. 05 或 P < 0. 01），其中定坤丹口服液高劑量組 大鼠 PGE2 水平、中劑量組大鼠 FSH 的水平優(yōu)于定坤丹水蜜丸組（P < 0. 01，P < 0. 05）；病理檢查結(jié)果 顯示，與模型組相比，各給藥組大鼠子宮均有不同程度的萎縮，水蜜丸組及定坤丹口服液高劑量組大 鼠子宮萎縮情況減輕，間質(zhì)細(xì)胞排列密集，兩者相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：定坤丹口服液與定坤丹水 蜜丸對(duì)去勢(shì)大鼠模型均有顯著的治療作用，能升高大鼠血清 P、E2、PGE2 水平，降低 LH、FSH、FGF2α 水 平，二者藥效無(wú)明顯差異。

【關(guān)鍵詞】定坤丹口服液；定坤丹水蜜丸；去勢(shì)大鼠模型；卵巢功能不全；藥效對(duì)比

定坤丹由紅參、鹿茸、西紅花等藥物組成，具有滋 補(bǔ)氣血、調(diào)經(jīng)舒郁的功效，主要用于氣血兩虛、氣滯血 瘀所致的月經(jīng)不調(diào)、行經(jīng)腹痛、崩漏下血、赤白帶下、血 暈血脫、產(chǎn)后諸虛和骨蒸潮熱等，被廣泛應(yīng)用于婦科疾 病，如卵巢功能不全、月經(jīng)病、不孕癥和更年期綜合征 等［1］。目前定坤丹產(chǎn)品主要有口服液、水蜜丸與大蜜 丸 3 種劑型，其中定坤丹口服液具有口感好、吸收快且 起效迅速的優(yōu)點(diǎn)，而定坤丹水蜜丸則具有作用緩慢、藥 效持久且容易保存的優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)復(fù)制雌性去勢(shì) 大鼠模型，使大鼠處于卵巢功能缺失狀態(tài)，從而引起大 鼠雌激素分泌紊亂，以此來(lái)探究定坤丹口服液及定坤 丹水蜜丸對(duì)卵巢功能的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)對(duì)二者的藥效 進(jìn)行對(duì)比。

1 材料

1. 1 動(dòng)物

健康雌性 SD 大鼠，SFP 級(jí)，200 只，體質(zhì)量 180～ 200 g，由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供，許可證 號(hào)：SCXK（京）2019－0010。大鼠飼養(yǎng)于清潔恒溫環(huán) 境，平均溫度 25 ℃，平均濕度 37%，15～20 次/h 全新 風(fēng)，光照12 h明、12 h暗。

1. 2 主要藥物、試劑與儀器

定坤丹口服液（山西廣譽(yù)遠(yuǎn)國(guó)藥有限公司，批號(hào)： 4112011002）；定坤丹水蜜丸（山西廣譽(yù)遠(yuǎn)國(guó)藥有限公 司，批號(hào)：3282011096）；補(bǔ)佳樂(lè)戊酸雌二醇片（Bayer， 批號(hào)：583A）。 大鼠孕酮（P）ELISA 試劑盒（批號(hào)：202104）、大鼠 雌二醇（E2）ELISA 試劑盒（批號(hào)：202104）、大鼠促卵泡 刺激素（FSH）ELISA 試劑盒（批號(hào)：202104）、大鼠黃體 生成素（LH）ELISA 試劑盒（批號(hào)：202104）、大鼠前列 腺素 E2（PGE2）ELISA 試劑盒（批號(hào)：202104）、大鼠前 列腺素 F2α（PGF2α）ELISA試劑盒（批號(hào)：202104）均購(gòu) 自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司；C5 微孔板檢測(cè)儀（美國(guó) 伯騰）。

2 方法

2. 1 去勢(shì)大鼠模型的建立

全部大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、 定坤丹水蜜丸組（水蜜丸組）以及定坤丹口服液高劑量 組（高劑量組）、定坤丹口服液中劑量組（中劑量組）、定 坤丹口服液低劑量組（低劑量組）。雌性大鼠腹腔注射 10%水合氯醛溶液麻醉，仰臥位固定于大鼠板上，剃毛 消毒后，沿腹部正中線距陰道口 2. 5 cm 處切開(kāi)，使用 剪刀在正中定位處打開(kāi)約 1. 5～2 cm 的皮膚切口。除 空白組外，其余大鼠分離兩側(cè)輸卵管進(jìn)行結(jié)扎，結(jié)扎后 完整摘除兩側(cè)卵巢，分兩層縫合切口，用無(wú)菌生理鹽水 沖洗傷口，碘伏消毒；空白組大鼠僅切開(kāi)，不結(jié)扎。術(shù) 后連續(xù) 3 d 各組大鼠腹腔內(nèi)注射青霉素 4 萬(wàn) IU/d 以預(yù) 防感染，6 d 后拆線，結(jié)扎術(shù)后大鼠可正常存活即為去 勢(shì)大鼠模型復(fù)制成功。

2. 2 分組給藥

術(shù)后 1 周開(kāi)始灌胃給藥，按人與大鼠體表面積換 算系數(shù)確定給藥劑量。高、中、低劑量組分別灌胃定坤 丹 口 服 液 10、5、2. 5 mL/kg，陽(yáng)性對(duì)照組予補(bǔ)佳樂(lè) 0. 12 mg/kg，水蜜丸組給予定坤丹水蜜丸 1. 75 g/kg，空 白組和模型組大鼠灌服等劑量蒸餾水，每天灌胃 1 次， 連續(xù)灌胃4周。每周稱量大鼠體質(zhì)量，調(diào)整給藥劑量。

2. 3 標(biāo)本采集

末次給藥結(jié)束后，禁食不禁水 12 h，10% 水合氯醛 溶液麻醉后進(jìn)行大鼠腹主動(dòng)脈取血，一部分放入抗凝 管中測(cè)定凝血功能，另一部分放入 EP 管中室溫靜置 2 h后3 000 r/min離心20 min，取上清，制備血清，?20℃ 保存。摘取大鼠子宮，并稱取子宮的質(zhì)量，計(jì)算子宮指 數(shù)。子宮組織用生理鹽水沖洗后，立刻置于 10% 甲醛 中固定。 子宮指數(shù) = 子宮質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%

2. 4 ELISA 法檢測(cè)

大鼠血清中 FSH、LH、E2、P、PGE2、 PGF2α含量 嚴(yán)格根據(jù) ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作， 檢測(cè)大鼠血清中 FSH、LH、E2、P、PGE2 和 PGF2α 的 含量。

2. 5 HE染色觀察

大鼠子宮組織病理變化 生理鹽水沖洗后，立刻將子宮置于 10% 的甲醛溶 液中固定，石蠟包埋，切片，HE 染色，200 倍光鏡下觀 察子宮內(nèi)膜損傷等病理形態(tài)學(xué)的變化情況。

3 結(jié)果

3. 1 各組大鼠一般狀態(tài)及子宮指數(shù)比較

造模期間，空白組大鼠皮毛光滑，攝食、飲水規(guī) 律，體質(zhì)量持續(xù)穩(wěn)定增長(zhǎng)；模型組大鼠毛發(fā)暗淡無(wú)光 澤 ，情 緒 易 激 惹 ，體 質(zhì) 量 較 空 白 組 明 顯 增 加（P < 0. 01）。給藥后，與模型組相比，中劑量組大鼠體質(zhì) 量繼續(xù)增加（P < 0. 01），水蜜丸組大鼠體質(zhì)量有增加 趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0. 05）；定坤丹口服 液各劑量組與水蜜丸組大鼠相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義（P > 0. 05）。模型組大鼠子宮指數(shù)較空白組明顯 降低（P < 0. 01）；定坤丹口服液各劑量組、水蜜丸組 及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠子宮指數(shù)較模型組顯著升高（P < 0. 01）；中、低劑量組與水蜜丸組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義（P > 0. 05）。見(jiàn)表 1。

3. 2 各組大鼠凝血功能指標(biāo)比較

模型組大鼠PT、TT較空白組顯著升高（P < 0. 01）； 高劑量組大鼠 PT值較模型組降低（P < 0. 05），高、中劑 量組及水蜜丸組的 TT值較模型組顯著降低（P < 0. 01， P < 0. 05）；定坤丹口服液各劑量組與水蜜丸組大鼠 PT 及TT值相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0. 05）。見(jiàn)表2。

3. 3 各組大鼠性激素指標(biāo)比較

與空白組相比，模型組大鼠血清 P、E2、PGE2 水平 顯著降低，F(xiàn)SH、LH、PGF2α 水平顯著增高（P < 0. 01）； 與模型組相比，定坤丹口服液各劑量組、水蜜丸組大鼠 血清 P、E2、PGF2α 水平均不同程度升高，LH、FSH、 PGE2 水平均不同程度降低（P < 0. 05，P < 0. 01），其中 中劑量組大鼠的 FSH 水平以及高、中劑量組大鼠的 PGE2 水平較水蜜丸組改變更明顯（P < 0. 05），其余指 標(biāo)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0. 05）。

3. 4 各組大鼠子宮病理形態(tài)的比較

與空白組比較，模型組大鼠子宮明顯萎縮，內(nèi)膜上 皮及子宮腺上皮細(xì)胞呈小圓柱狀，質(zhì)核比下降，子宮內(nèi) 膜層變薄，間質(zhì)細(xì)胞呈紡錘形，細(xì)胞變小，肌層萎縮變 薄；與模型組相比，各給藥組大鼠子宮均有不同程度的 萎縮，水蜜丸組及定坤丹口服液高劑量組子宮萎縮情 況減輕，間質(zhì)細(xì)胞排列密集，兩者相比無(wú)顯著差異。

4 討論

定坤丹始于清乾隆年間，為宮廷秘方，乾隆帝因其 可“安定坤富”而將其命名為“定坤丹”。該方由紅參、 鹿茸、西紅花等中藥組成，由四君子湯、四物湯、逍遙 散、八珍益母丸、理中丸、柴胡疏肝散等經(jīng)典名方化裁， 共行補(bǔ)益氣血、滋補(bǔ)肝腎、調(diào)經(jīng)舒郁、健脾行氣、溫中祛 寒、活血止痛之功效，用于氣血兩虛、氣滯血瘀所致的 月經(jīng)不調(diào)、行經(jīng)腹痛、崩漏下血、赤白帶下、血暈血脫、 產(chǎn)后諸虛和骨蒸潮熱等。 現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，定坤丹在原發(fā)性卵巢功能不 全（POI）的治療中具有良好的效果［2-3］。POI 的發(fā)病原 因包括遺傳學(xué)、免疫學(xué)、醫(yī)源性、環(huán)境和生活方式等因 素［4］。LH、FSH、E2、P作為女性卵巢功能不全的早期標(biāo) 志物，在疾病的發(fā)生過(guò)程中可表現(xiàn)為 LH、FSH 含量升 高，E2、P含量降低，其中 FSH 最為敏感［5］。女性的卵泡 發(fā)育、性激素水平的調(diào)節(jié)以及正常生殖功能的維持主 要依靠下丘腦－垂體－卵巢軸，E2、FSH 和 LH 是女性 生殖軸的重要激素［6］，其中 E2受 LH 和 FSH 的調(diào)節(jié)，共 同維護(hù)女性生殖系統(tǒng)正常的生理功能［7］。有研究表 明，前列腺素與子宮收縮有密切關(guān)系，其中研究較多的 是 PGF2α 和 PGE2，PGF2α 可促進(jìn)子宮收縮，而 PGE2 則對(duì)子宮收縮產(chǎn)生抑制作用［8-9］。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)摘除大鼠卵巢復(fù)制雌性去勢(shì)大鼠模 型，使大鼠處于卵巢功能缺失的狀態(tài)，并在此基礎(chǔ)上進(jìn) 行定坤丹口服液與定坤丹水蜜丸的藥效對(duì)比。實(shí)驗(yàn)結(jié) 果表明，定坤丹口服液和水蜜丸均能不同程度升高大 鼠血清 P、E2、PGE2 水平，降低 LH、FSH、PGF2α 水平， 證明定坤丹能夠通過(guò)調(diào)節(jié)大鼠雌激素紊亂的狀態(tài)從而 促進(jìn)卵巢功能的恢復(fù)，另外給藥后 TT降低也說(shuō)明出定 坤丹能夠促進(jìn)凝血功能的改善。 水蜜丸是指藥材細(xì)粉以水和蜂蜜按適當(dāng)比例混勻 為黏合劑制成的藥丸，其作用緩慢，藥效持久，優(yōu)點(diǎn)在 于使用的蜂蜜量較少，含水量低，可便于長(zhǎng)期保存和服 用。口服液劑是以中藥湯劑為基礎(chǔ)，提取中藥內(nèi)的有 效成分，并按照注射劑的加工工藝合成的口服液體制 劑，具有服用劑量小、味道好、吸收快、奏效迅速和質(zhì)量 穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)對(duì)定坤丹口服液和水蜜丸進(jìn) 行藥效學(xué)對(duì)比，結(jié)果顯示二者具有相似的治療效果，因 此可以在不同的應(yīng)用場(chǎng)景根據(jù)使用人群的偏好進(jìn)行選擇。

作者:張潤(rùn)濤 李佳 高喬 節(jié)笑笑 劉聰 倪艷 康永 張愛(ài)榮 趙惠淳 單位:山西省中醫(yī)藥研究院 山西廣譽(yù)遠(yuǎn)國(guó)藥有限公司