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摘要：探討植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、基本培養(yǎng)基、蔗糖質(zhì)量濃度以及相關(guān)添加物對(duì)鐵皮石斛莖段原球莖的誘導(dǎo)、增殖、分化以及根部生長(zhǎng)等方面的影響。方法：通過(guò)正交試驗(yàn)方式，要求沒(méi)有添加激素下，對(duì)鐵皮石斛莖段原球莖進(jìn)行消毒處理、試驗(yàn)培養(yǎng)基的配備、對(duì)原球莖進(jìn)行誘導(dǎo)、對(duì)原球莖進(jìn)行增殖和分化處理、生根的培養(yǎng)等，分析不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、基本培養(yǎng)基配比對(duì)于莖段原球莖的誘導(dǎo)影響，不同基本培養(yǎng)基、馬鈴薯泥以及蔗糖濃度增殖分化原球莖效果，以及香蕉泥、萘乙酸（ＮＡＡ）和馬鈴薯泥對(duì)鐵皮石斛莖段原球莖生根效果。結(jié)果：１）最適宜誘導(dǎo)鐵皮石斛莖段原球莖的培養(yǎng)基組合是ＮＡＡ０１ｍｇ／Ｌ＋１／２ＭＳ（ＭｕｒａｓｈｉｇｅａｎｄＳｋｏｏｇ）培養(yǎng)基＋６芐氨基腺嘌呤（６ＢＡ）４ｍｇ／Ｌ。２）鐵皮石斛莖段原球莖增殖最佳的培養(yǎng)基是：ＭＳ＋蔗糖３０ｇ／Ｌ；分化的最佳培養(yǎng)基是：馬鈴薯泥１０％＋蔗糖１０ｇ／Ｌ＋１／２ＭＳ。３）鐵皮石斛莖段原球莖的生根最佳培養(yǎng)基組合是馬鈴薯泥１０％＋１／２ＭＳ＋ＮＡＡ１ｍｇ／Ｌ＋香蕉泥１０％。結(jié)論：在沒(méi)有添加激素的前提下，基于正交試驗(yàn)方式發(fā)現(xiàn)變化蔗糖含量和基本培養(yǎng)基能夠?qū)﹁F皮石斛莖段原球莖增殖和分化效果進(jìn)行調(diào)節(jié)，并找出了最理想的組合模式。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛；原球莖；植株再生；誘導(dǎo)；增殖；分化；馬鈴薯泥；香蕉泥

鐵皮石斛是蘭科石斛多年生草本植物，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)記載，其味甘，歸胃、腎經(jīng)，性微寒；具有滋陰清熱，益胃生津等功效。近代研究表明鐵皮石斛的多糖具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、抗氧化以及降血糖等方面的作用。通過(guò)人工培養(yǎng)技術(shù)可以有效的擴(kuò)大其生長(zhǎng)產(chǎn)量，組培工廠化的生育苗一般需要保證配方的穩(wěn)定，增殖系數(shù)比較高，種苗的質(zhì)量有保障。近幾年以來(lái)出現(xiàn)了很多鐵皮石斛組織培養(yǎng)的企業(yè)，通過(guò)莖段原球莖的途徑可以讓最終生產(chǎn)出的種苗都來(lái)自同一顆木本，這樣就可以讓其后期的種苗整齊一致，而且還可以有效的提高增殖系數(shù)。

１.材料與方法

１.１材料野生的鐵皮石斛是此次試驗(yàn)最重要的素材

其對(duì)于生長(zhǎng)環(huán)境以及氣候等方面的要求標(biāo)準(zhǔn)非常高，很多時(shí)候都是將其種植在溫室大棚中［１］。這樣可以有效控制其生長(zhǎng)所需的濕度、溫度以及透光度等條件，在此選擇生長(zhǎng)健康的，沒(méi)有病蟲(chóng)災(zāi)害的當(dāng)年嫩莖將其除葉作為試驗(yàn)材料［２］，如圖１所示。

１.２方法

１.２.１消毒處理主要操作流程就是自來(lái)水沖洗流水沖洗濾紙吸干水分［３］。將其在超凈的工作臺(tái)上進(jìn)行修剪，剪成每個(gè)段都包含１～２個(gè)莖節(jié)，長(zhǎng)度約為３ｃｍ。接下來(lái)將其放在濃度為７５％的乙醇中浸泡，時(shí)間為３０ｓ，到時(shí)間后再將其放入濃度為０１％的升汞溶液中浸泡，時(shí)間為６ｍｉｎ［４］。最后就需要再?zèng)_洗１次，一般是采用無(wú)菌水，再通過(guò)無(wú)菌濾紙完成干燥處理，然后將終端的傷口進(jìn)行切除處理形成帶一個(gè)節(jié)的段，然后再將其接種到試驗(yàn)培養(yǎng)基。１.２.２試驗(yàn)培養(yǎng)基的配備以ＶＷ（ＶａｃｉｎａｎｄＷｅｎｔ）培養(yǎng)基、１／２ＭＳ（ＭｕｒａｓｈｉｇｅａｎｄＳｋｏｏｇ）培養(yǎng)基和ＭＳ作為試驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)，在添加相關(guān)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的時(shí)候需要根據(jù)不同的培養(yǎng)時(shí)期來(lái)配置不同比例和濃度，另外還需要考慮將香蕉和馬鈴薯等作為附加物添加到培養(yǎng)基內(nèi)部。在添加的過(guò)程中要注意對(duì)馬鈴薯進(jìn)行相關(guān)處理，先去掉外皮然后再進(jìn)行稱(chēng)重，再將其切成小塊，在使用之前還需要將其煮爛打碎成漿［５］；同樣對(duì)于香蕉的使用前也要進(jìn)行稱(chēng)重剝皮，然后研磨成香蕉泥才可以使用。所有的培養(yǎng)基都需要調(diào)節(jié)其ｐＨ值為５６，還需要添加瓊脂７ｇ／Ｌ，這樣保持在１２１℃的狀況下保持２０ｍｉｎ目的就是進(jìn)行有效的滅菌，然后等其冷卻凝固后再使用［６］。１.２.３原球莖誘導(dǎo)采用正交的試驗(yàn)方式對(duì)Ｎ乙酰天冬氨酸（Ｎａｃｅｔｙｌａｓｐａｒｔａｔｅ，ＮＡＡ）（０１、０５、１０ｍｇ／Ｌ）、６芐氨基腺嘌呤（６Ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ，６ＢＡ）（１、２、４ｍｇ／Ｌ）以及基本培養(yǎng)基（ＭＳ，１／２ＭＳ，ＶＷ）對(duì)原球莖誘導(dǎo)率產(chǎn)生的影響進(jìn)行研究分析，具體展開(kāi)過(guò)程中，首先對(duì)所有培養(yǎng)基依次添加３０ｇ／Ｌ蔗糖［７］。其次把莖段接種每個(gè)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，單次接種處理數(shù)量為３０瓶，１瓶對(duì)應(yīng)１個(gè)莖段［８］。１.２.４原球莖增殖和分化處理依然通過(guò)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)方式對(duì)馬鈴薯泥質(zhì)量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)５％、１０％、２０％）、蔗糖（不同含量１０、２０、３０ｇ／Ｌ）以及基本培養(yǎng)基（ＭＳ，１／２ＭＳ，ＶＷ）對(duì)原球莖增殖和分化產(chǎn)生的具體影響進(jìn)行研究分析。首先對(duì)適合原球莖增殖分化的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。其次采取頂部具備葉原基、顏色為淡綠色、沒(méi)有出現(xiàn)真葉分化的原球莖，并對(duì)其進(jìn)行切割形成直徑在１０～１５ｃｍ的小塊，切割完成后接種到不同的培養(yǎng)基當(dāng)中，單次處理接種數(shù)量為２０瓶，一瓶對(duì)應(yīng)１０塊原球莖［９］。見(jiàn)圖２。１.２.５生根培養(yǎng)為了能夠篩選出最佳適宜生根的培養(yǎng)基，采用正交設(shè)計(jì)的試驗(yàn)方式來(lái)研究馬鈴薯泥（質(zhì)量分?jǐn)?shù)５％、１０％、２０％）、萘乙酸（ＮＡＡ）（０１、０５、１０ｍｇ／Ｌ）以及香蕉泥（質(zhì)量分?jǐn)?shù)５％、１０％、２０％）的用量，每個(gè)培養(yǎng)基同樣需要添加蔗糖含量為２０ｇ／Ｌ。取高度范圍在１０～１５ｃｍ的小苗，將其依次接種到每個(gè)生根培養(yǎng)基當(dāng)中，單次處理接種數(shù)量為２０瓶，１瓶對(duì)應(yīng)１２叢小苗，每叢小苗上要保證具備３～４個(gè)芽［１０］。１.２.６培養(yǎng)試驗(yàn)所需條件對(duì)于試驗(yàn)所需條件也應(yīng)該給予嚴(yán)格的規(guī)定，各個(gè)培養(yǎng)階段的光照時(shí)間應(yīng)該滿(mǎn)足１２ｈ／ｄ，培養(yǎng)室內(nèi)部的溫度也應(yīng)該保持在（２７±２）℃，內(nèi)部光照強(qiáng)度也要維持在４０００～５０００ｌｘ。

2.結(jié)果

2.１不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、基本培養(yǎng)基配比對(duì)于莖段原球莖的誘導(dǎo)影響效果

在原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)的試驗(yàn)上接種消毒后的莖段，大約培養(yǎng)２０ｄ后腋芽就開(kāi)始出現(xiàn)逐漸膨大的跡象，３０ｄ后就會(huì)萌發(fā)出不定芽。然后在經(jīng)過(guò)２個(gè)月的培養(yǎng)后對(duì)生長(zhǎng)出的不定芽進(jìn)行切割，使其脫離莖段，然后將其轉(zhuǎn)接到相同的培養(yǎng)基當(dāng)中進(jìn)行３個(gè)月的后續(xù)培養(yǎng)，并對(duì)原球莖的誘導(dǎo)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其結(jié)果如表１所示。通過(guò)簡(jiǎn)單重復(fù)序列（ＳｉｍｐｌｅＳｅｑｕｅｎｃｅＲｅｐｅａｔ，ＳＳＲ）檢驗(yàn)，最終發(fā)現(xiàn)６ＢＡ和基本培養(yǎng)基為鐵皮石斛莖段原球莖誘導(dǎo)率帶來(lái)的影響更加突出，ＮＡＡ各個(gè)水平間并無(wú)明顯差異。而１／２ＭＳ和ＭＳ基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)率的平均值分別可以達(dá)到１７２０和２８４０，二者結(jié)果相差不大，但是和ＶＭ誘導(dǎo)率平均值４８０比較，相差顯著；另外，濃度為４ｍｇ／Ｌ的６ＢＡ其誘導(dǎo)率均值結(jié)果為２５３０，和１ｍｇ／Ｌ的誘導(dǎo)率存在較大差異。結(jié)合以上數(shù)據(jù)結(jié)果，可以得出：最適宜誘導(dǎo)鐵皮石斛莖段原球莖的培養(yǎng)基組合是ＮＡＡ０１ｍｇ／Ｌ＋１／２ＭＳ＋６ＢＡ４０ｍｇ／Ｌ。

2.２不同基本培養(yǎng)基、馬鈴薯泥以及蔗糖濃度增殖分化原球莖效果

基本培養(yǎng)基對(duì)于鐵皮石斛莖段原球莖的增殖率和分化率影響都有著明顯的效果，其中ＭＳ的增殖率達(dá)到了１１８０，效果是最好的，相比ＶＷ和１／２ＭＳ的增殖率效果差異非常明顯。而分化率則是均值為５８６的１／２ＭＳ效果最佳，和ＭＳ的分化率呈現(xiàn)出較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。蔗糖對(duì)于鐵皮石斛莖段原球莖的增殖和分化效果也比較明顯，馬鈴薯泥的影響相對(duì)來(lái)說(shuō)均沒(méi)有達(dá)到顯著的差異，但是增加了１０％的馬鈴薯泥后鐵皮石斛莖段原球莖的分化苗變得更加粗壯。因此，可以得出的結(jié)論就是鐵皮石斛莖段原球莖增殖最佳的培養(yǎng)基是：ＭＳ＋蔗糖３０ｇ／Ｌ；分化的最佳培養(yǎng)基是：馬鈴薯泥１０％＋蔗糖１０ｇ／Ｌ＋１／２ＭＳ。該正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表２～３。

2.３香蕉泥、ＮＡＡ和馬鈴薯泥對(duì)鐵皮石斛莖段原球莖生根效果的分析

試驗(yàn)過(guò)程中將分化后的鐵皮石斛莖段原球莖接入馬鈴薯泥１０％＋蔗糖１０ｇ／Ｌ＋１／２ＭＳ中培養(yǎng)大約２個(gè)月的時(shí)間，苗高大約在１～１５ｃｍ上下然后將其接到生根的培養(yǎng)基４個(gè)月的時(shí)間，然后統(tǒng)計(jì)其生根的跟長(zhǎng)、根數(shù)以及苗柱高度（圖３）。根據(jù)統(tǒng)計(jì)，ＮＡＡ對(duì)于根長(zhǎng)以及根數(shù)的影響效果較好，對(duì)于苗柱的高度影響方面不是非常明顯；馬鈴薯泥對(duì)于苗柱高度的影響效果顯著，但是對(duì)于根長(zhǎng)和根數(shù)的影響效果卻不是很明顯；香蕉泥對(duì)于根長(zhǎng)的影響效果非常明顯，但是對(duì)于根數(shù)以及苗柱高度的影響卻不是很明顯。綜上所述，鐵皮石斛莖段原球莖的生根最佳培養(yǎng)基組合是馬鈴薯泥１０％＋１／２ＭＳ＋ＮＡＡ１ｍｇ／Ｌ＋香蕉泥１０％。見(jiàn)表４、表５。

3.討論

組織培養(yǎng)過(guò)程中，通過(guò)ＳＳＲ檢驗(yàn)，最終發(fā)現(xiàn)６ＢＡ和基本培養(yǎng)基為鐵皮石斛莖段原球莖誘導(dǎo)率帶來(lái)的影響更加突出，ＮＡＡ各個(gè)水平間并沒(méi)有明顯的差異。１／２ＭＳ和ＭＳ基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)率的平均值分別可以達(dá)到１７２０和２８４０，二者結(jié)果相差不大，但是和ＶＭ誘導(dǎo)率平均值４８０比較，相差顯著；另外，濃度為４ｍｇ／Ｌ的６ＢＡ其誘導(dǎo)率均值結(jié)果為２５３０，和１ｍｇ／Ｌ的誘導(dǎo)率存在較大差異。說(shuō)明不同的濃度在誘導(dǎo)鐵皮石斛莖段原球莖的培養(yǎng)方面產(chǎn)生非常大的差異，需要嚴(yán)格取樣來(lái)誘導(dǎo)培養(yǎng)。在組織培養(yǎng)過(guò)程中，香蕉和馬鈴薯作為添加物放置到培養(yǎng)基中，暫時(shí)無(wú)法判斷產(chǎn)生的物質(zhì)具體情況，但是可以實(shí)現(xiàn)對(duì)植物生長(zhǎng)的促進(jìn)效果，與其他研究結(jié)果相似［１１１３］，認(rèn)為馬鈴薯對(duì)促進(jìn)苗生長(zhǎng)有積極作用［１４１５］，香蕉乳對(duì)鐵皮石斛的生根也帶來(lái)積極影響，二者共同作用下，可以提高鐵皮石斛的生長(zhǎng)［１６］，有研究表明香蕉提取液可以作為培養(yǎng)基的緩沖劑，通過(guò)控制培養(yǎng)基的ｐＨ值，來(lái)進(jìn)一步誘導(dǎo)生根［１７１８］。鐵皮石斛的產(chǎn)地、種類(lèi)，培養(yǎng)過(guò)程中的溫度、光照強(qiáng)度、時(shí)間等都對(duì)誘導(dǎo)腋芽產(chǎn)生差異的效果［１９２１］。本研究中通過(guò)控制培養(yǎng)環(huán)境，提高研究的科學(xué)性，研究中對(duì)于試驗(yàn)所需條件也應(yīng)該給予嚴(yán)格的規(guī)定，各個(gè)培養(yǎng)階段的光照時(shí)間應(yīng)該滿(mǎn)足１２ｈ／ｄ，培養(yǎng)室內(nèi)部的溫度也應(yīng)該保持在（２７±２）℃，內(nèi)部光照強(qiáng)度也要維持在４０００～５０００ｌｘ。同時(shí)，沒(méi)有添加激素的情況下，有利于建立基本培養(yǎng)基及添加物對(duì)研究樣本的實(shí)驗(yàn)條件。在原球莖誘導(dǎo)、增殖、分化過(guò)程中，植物激素的作用顯而易見(jiàn)，一般情況下高濃度的細(xì)胞分裂素有利于誘導(dǎo)芽的產(chǎn)生，而低濃度的生長(zhǎng)素有利于根的形成，但是不同濃度的激素對(duì)芽、根產(chǎn)生異常影響，不利于后續(xù)鐵皮石斛的各種藥物機(jī)制和增殖研究。因此，本研究探討了不添加激素的情況下，鐵皮石斛的誘導(dǎo)、增殖和分化研究。在鐵皮石斛莖段原球莖的組織培養(yǎng)過(guò)程中，原球莖的分化屬于至關(guān)重要的一環(huán)，其分化效果對(duì)控制組培過(guò)程化的生產(chǎn)投入有著十分重要的意義。根據(jù)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)配合使用生長(zhǎng)素與特定濃度的細(xì)胞分裂素，可以有效改善鐵皮石斛原球莖分化效果，但是對(duì)于濃度有嚴(yán)格的要求，過(guò)高或者過(guò)低都不利于其分化。由于鐵皮石斛的組織培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，不同階段的培養(yǎng)基需要有不同的成份和條件，增殖與分化所用的培養(yǎng)基差異化也對(duì)鐵皮石斛莖段生芽到生根產(chǎn)生影響，本研究結(jié)果顯示，最適宜誘導(dǎo)鐵皮石斛莖段原球莖的培養(yǎng)基組合是ＮＡＡ０１０ｍｇ／Ｌ＋１／２ＭＳ＋６ＢＡ４ｍｇ／Ｌ，鐵皮石斛莖段原球莖增殖最佳的培養(yǎng)基是：ＭＳ＋蔗糖３０ｇ／Ｌ；分化的最佳培養(yǎng)基是：馬鈴薯泥１０％＋蔗糖１０ｇ／Ｌ＋１／２ＭＳ。鐵皮石斛莖段原球莖的生根最佳培養(yǎng)基組合是馬鈴薯泥１０％＋１／２ＭＳ＋ＮＡＡ１ｍｇ／Ｌ＋香蕉泥１０％，３個(gè)不同階段的培養(yǎng)基要求不一樣。同時(shí)在培養(yǎng)的過(guò)程中對(duì)于激素的使用也會(huì)引起種苗產(chǎn)生變異。本研究所進(jìn)行的試驗(yàn)在沒(méi)有添加激素的前提下，基于正交試驗(yàn)方式發(fā)現(xiàn)變化蔗糖含量和基本培養(yǎng)基能夠?qū)﹁F皮石斛莖段原球莖增殖和分化效果進(jìn)行調(diào)節(jié)，并找出了最理想的組合模式。

作者:廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 單位:廣東省第二中醫(yī)院