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西伯利亞鱘(Acipenserbaerii)隸屬于鱘科(Aci-penserdae)，鱘屬(Acipenser)，是現存26種鱘類中的一種，具有生長速度快、適應性強、肉質好、魚籽醬品質高等優點。1996年，西伯利亞鱘首次被中國引進，目前其養殖量僅次于施氏鱘(Acipenserschrenckii)，居中國鱘養殖產量的第2位［1］。然而，近年來病害的發生已成為鱘養殖業可持續發展的瓶頸。因此，關于鱘病害的分離鑒定及其藥敏特性等基礎理論研究對鱘病害的有效防治顯得尤為重要。2006年6月中旬，中國浙江省千島湖鱘養殖場的西伯利亞鱘感染了嚴重的以“肌肉、腎臟、性腺、腸道充血、出血，肝臟有出血點，肛門紅腫并伴有血水流出”為主要病癥的細菌性敗血癥，經分離鑒定其病原主要是嗜水氣單胞菌，具有較強致病力，患病鱘魚死亡率高［2］。外膜蛋白(outermembraneprotein，OMP)是革蘭氏陰性菌外膜的主要結構，是氣單胞菌重要的粘附因子和保護性抗原，與細菌的毒力也密切相關，其數量、種類及毒力大小隨著不同菌株及菌株的不同培養條件而有所變化［3］。大量研究表明氣單胞菌的外膜蛋白含量豐富，生物學功能復雜，在對宿主的感染和免疫中扮演著重要的角色，是重要的保護性抗原，很容易被宿主的免疫防御體系識別為異物［4－6］。本試驗以由患敗血癥西伯利亞鱘(Acipenserbaerii)分離鑒定的嗜水氣單胞菌為試驗材料，研究了其外膜蛋白的組成及抗原性，同時比較了該菌與水產養殖中常見的3種氣單胞菌，即致病性豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)、溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)和無致病力的嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophlia)在外膜蛋白構成及免疫學特性等方面的異同，旨在發現西伯利亞鱘嗜水氣單胞菌與氣單胞菌屬其他細菌共有的外膜蛋白，為進一步篩選和研究致病性氣單胞菌的共同保護性抗原提供參考。   1材料與方法   1.1試驗材料   西伯利亞鱘嗜水氣單胞菌X1(Aeromonashydroph-lia)［2］，豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)［7］，溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)，無致病性嗜水氣單胞菌(Aero-monashydrophlia)。此4株細菌均由上海海洋大學農業部漁業動植物病原庫提供。保存于－80℃。純系新西蘭兔由上海第二軍醫大學提供。1.2方法1.2.1兔抗XI全菌血清的制備菌懸液的制備菌株XI接種于普通營養肉湯培養基中，28℃培養24h，加入0.2%福爾馬林溶液于30℃滅活24h，無菌檢測后離心，取菌體沉淀以10mmol/L磷酸鹽緩沖液重懸，用McFarland比濁法定細菌濃度為9×108CFU/mL。將制備的菌懸液用于新西蘭兔的免疫［10］，免疫完成后從新西蘭兔心臟一次性采血，制備抗血清。   1.2.2外膜蛋白的提取及SDS-PAGE檢測   4株菌株主要外膜蛋白的提取根據改進的十二烷基肌氨酸鈉(Sarkosyl)方法抽提結合超速離心純化的方法［8］進行。將4種菌株的全菌和外膜蛋白樣品分別進行SDS-PAGE檢測，用全自動凝膠成像系統掃描，Gel-ProAnalyzer軟件分析各分離蛋白的分子量。   1.2.3外膜蛋白的Western-blot分析   電泳結束后，凝膠均用Mini2ProteinⅡcell系統(BioRad)轉移至硝酸纖維素膜上，以免疫兔血清為一抗，未免疫兔血清為陰性對照，進行外膜蛋白的West-ern-blot分析。   2結果   2.1菌株X1與其他菌株外膜蛋白的SDS-PAGE圖譜的比較   如圖1所示，4株氣單胞菌外膜蛋白的SDS－PAGE主要蛋白帶較清晰，且有明顯的區別。其中西伯利亞鱘嗜水氣單胞菌菌株與豚鼠氣單胞菌菌株的蛋白質條帶較多，而溫和氣單胞菌與無致病力嗜水氣單胞菌的蛋白質條帶較少。西伯利亞鱘嗜水氣單胞菌菌株與豚鼠氣單胞菌菌株的蛋白質條件主要集中在120～72kDa，65～28kDa;溫和氣單胞菌菌株的蛋白質條帶主要集中在72～43kDa，無致病性嗜水氣單胞菌菌株的蛋白質條帶100～95kDa，43～34kDa。西伯利亞鱘嗜水氣單胞菌菌株主要有14條，分子量為120kDa、95kDa、75kDa、60kDa、58kDa、52kDa、50kDa、43kDa、40kDa、34kDa、36kDa、30kDa、28kDa、26kDa;豚鼠氣單胞菌菌株主要有11條，分子量為120kDa、95kDa、75kDa、58kDa、52kDa、43kDa、40kDa、34kDa、36kDa、28kDa、26kDa;溫和氣單胞菌菌株主要有9條，分子量為120kDa、95kDa、75kDa、58kDa、52kDa、40kDa、28kDa、30kDa、36kDa;無致病性嗜水氣單胞菌菌株主要有5條，分子量為95kDa、71kDa、52kDa、43kDa、34kDa、28kDa。圖中可以看出蛋白帶分子量為34kDa和28kDa為4株菌株所共有;蛋白帶分子量為120kDa、95kDa、75kDa、58kDa、52kDa、40kDa、36kDa為西伯利亞鱘嗜水氣單胞菌菌株、豚鼠氣單胞菌菌株和溫和氣單胞菌菌株所共有;蛋白帶分子量為43kDa、52kDa、28kDa為西伯利亞鱘嗜水氣單胞菌菌株與豚鼠氣單胞菌菌株所共有。   2.2菌株X1與其他菌株外膜蛋白的Western-blot印跡的比較   圖2顯示了兔抗西伯利亞鱘嗜水氣單胞菌全菌血清與西伯利亞鱘嗜水氣單胞菌菌株、豚鼠氣單胞菌菌株、溫和氣單胞菌菌株、無致病性嗜水氣單胞菌菌株主要外膜蛋白免疫反應結果。由圖2可知，兔抗西伯利亞鱘嗜水氣單胞菌全菌血清與4株菌株的外膜蛋白均可發生不同程度陽性反應。其中西伯利亞鱘嗜水氣單胞菌菌株有6條反應帶，分子量分別為75kDa、52kDa、43kDa、40kDa、34kDa、28kDa;豚鼠氣單胞菌菌株主要有5條反應帶，分子量分別為75kDa、52kDa、40kDa、43kDa、28kDa;溫和氣單胞菌菌株主要有4條發色帶，分子量分別為75kDa、40kDa、34kDa、28kDa;無致病性嗜水氣單胞菌菌株主要有3條發色帶，分子量分別為43KDa、34kDa、28kDa;由此可明顯看出28kDa、34kDa為4株菌所共有反應帶;43kDa為西伯利亞鱘嗜水氣單胞菌菌株、豚鼠氣單胞菌和無致病性嗜水氣單胞菌菌株所共有發色帶;75kDa為豚鼠氣單胞菌菌株、西伯利亞鱘嗜水氣單胞菌菌株與溫和氣單胞菌菌株共有反應帶。   3討論   本試驗采用Sarkosyl法分離提取了西伯利亞鱘嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、溫和氣單胞菌及無致病性嗜水氣單胞菌的外膜蛋白，通過SDS-PAGE圖譜分析了4株菌主要外膜蛋白結構組成。研究發現，3株致病菌株外膜蛋白條帶較多，共有7條外膜蛋白，而無致病性菌株外膜蛋白條帶較少，這可能與致病菌抗原的特異性及致病性有關。細菌外膜蛋白具有良好的免疫原性，不僅可激發機體的體液免疫，而且還可引起細胞免疫，可與其他血清型的嗜水氣單胞菌有免疫交叉反應，具有異種血清型的免疫交叉保護作用，是一種潛在的共同保護性抗原［9］。嗜水氣單胞菌OMPs除具有免疫原性外，主要與粘附致病作用有關［10］。除了某一分子質量單位的OMPs具有較好的免疫原性外，近年來，越來越多的研究者正致力于發現存在于同屬甚至同科細菌中的共同OMPs［11］。本試驗中，SDS-PAGE圖譜顯示分子量為34kDa和28kDa蛋白帶為4株氣單胞菌菌株所共有;蛋白帶分子量為120kDa、95kDa、75kDa、58kDa、52kDa、40kDa、36kDa為西伯利亞鱘嗜水氣單胞菌菌株、豚鼠氣單胞菌菌株和溫和氣單胞菌菌株所共有，與Quinn等報道的40kDa是比較保守的孔蛋白，該蛋白廣泛地分布于多數致病性氣單胞菌的結果一致［12］。本試驗Western-blot印跡顯示28kDa蛋白為4株氣單胞菌所共有發色帶，可能是氣單胞菌的特有蛋白。43kDa蛋白為西伯利亞鱘嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌與無致病力嗜水氣單胞菌菌株所共有發色帶，而溫和氣單胞菌菌株無此蛋白帶;75kDa蛋白為西伯利亞鱘嗜水氣單胞菌菌株、豚鼠氣單胞菌菌株和溫和氣單胞菌菌株共有發色帶。Quinn等［12］利用親和層析技術分離純化了嗜水氣單胞菌40kDa和43kDa兩種主要外膜蛋白并預測該兩種外膜蛋白是嗜水氣單胞菌重要的粘附素。Rchoa-de-Souza等［13］］則分離純化并證明豚鼠氣單胞菌43kDa的外膜蛋白是主要的粘附素，能夠介導細菌牢固定植于HEp-2細胞，而43kDa蛋白的多克隆抗體能夠有效阻斷這種定植。在本試驗中，無致病力的嗜水氣單胞菌也有此蛋白，與前面的報道不太一致，需要進一步研究。而西伯利亞鱘嗜水氣單胞菌和豚鼠氣單胞菌均為鱘細菌性敗血癥致病菌，43kDa蛋白作為開發研制鱘敗血癥亞單位疫苗候選材料有應用價值。75kDa蛋白為西伯利亞鱘嗜水氣單胞菌菌株、豚鼠氣單胞菌菌株和溫和氣單胞菌菌株共有特異性抗原，而無致病力菌株無致病性嗜水氣單胞菌未發現此條帶，由此推測75kDa蛋白可能在致病性氣單胞菌感染過程中也起到重要作用，無致病力嗜水氣單胞菌無此75kDa蛋白，說明無致病力的菌株很可能無此毒力基因［14］。由此可以進一步探討75kDa外膜蛋白作為氣單胞菌主要保護抗原的可能性。結果表明:2005～2009年各年份產人工培殖冬蟲夏草的甘露醇含量分別為89.64、91.86、94.71、98.98、97.50mg/g。而康定兩地野生冬蟲夏草(2009年)的D-甘露醇含量分別為94.71、96.84mg/g。可見，人工培殖冬蟲夏草與野生冬蟲夏草的D-甘露醇含量基本相當。為人工培殖冬蟲夏草的藥用提供依據。#p#分頁標題#e#   全國主要產區冬蟲夏草D-甘露醇含量有亦較大差別。青海治多縣和甘肅綠曲縣產冬蟲夏草甘露醇含量最高分別為125.18mg/g和125.81mg/g，四川稻城縣和云南香格里拉縣產冬蟲夏草的甘露醇含量最低分別為68.57mg/g和68.17mg/g。可見不同產地野生冬蟲夏草的甘露醇含量亦有較大差異。