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作者：趙玉秀 馬可 梁宏陽 蘇桂民 趙碩 李愛靈 張?jiān)绿m 王輝 單位：北京天壇生物制品股份有限公司

以200901批釀酒酵母蛋白為抗原，將其與等體積的弗氏完全佐劑混合，乳化，經(jīng)背部皮下多點(diǎn)注射免疫青紫藍(lán)家兔；2周后，用等體積的抗原與弗氏不完全佐劑混合，乳化，經(jīng)相同部位注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫，共加強(qiáng)3次。末次免疫1周后，心臟采血，分離血清。

抗釀酒酵母蛋白IgG抗體的純化采用辛酸-硫酸銨沉淀法［6］純化抗釀酒酵母蛋白IgG抗體，SDS-PAGE分析抗體純度；免疫雙向擴(kuò)散法測(cè)定抗體效價(jià)；Westernblot法分析抗體的特異性（分別取4、8和16μg的釀酒酵母蛋白上樣，以兔抗釀酒酵母蛋白抗體為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗）。

酶標(biāo)抗體的制備采用Lowry法測(cè)定抗釀酒酵母蛋白IgG抗體的蛋白濃度，改良過碘酸鈉法［7］進(jìn)行HRP標(biāo)記。

雙抗體夾心elisa法的建立參考文獻(xiàn)［8］。采用棋盤滴定法確定包被抗體和酶標(biāo)抗體的工作濃度，對(duì)樣品孵育時(shí)間和酶標(biāo)抗體反應(yīng)時(shí)間等進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)條件。

抗原參考品標(biāo)準(zhǔn)曲線最佳線性范圍和最低檢測(cè)限的確定：將抗原參考品稀釋至400、200、100、50、25、12.5和6.25ng／ml，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)直線回歸方程計(jì)算，確定最佳線性范圍，并確定該法的最低檢測(cè)限。

特異性驗(yàn)證：用建立的雙抗體夾心ELISA法分別檢測(cè)小牛血清、人血白蛋白、MEM培養(yǎng)基、Vero細(xì)胞上清蛋白、乙型腦炎純化疫苗、凍干人用狂犬病疫苗樣品，驗(yàn)證該方法的特異性。

準(zhǔn)確度和精密度驗(yàn)證：用建立的雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)不同濃度的釀酒酵母蛋白抗原參考品（200、100、50、25、12.5、6.25ng／ml），重復(fù)10次，計(jì)算回收率和變異系數(shù)（CV），驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度和精密度。

適用性驗(yàn)證：用建立的雙抗體夾心ELISA法測(cè)定200906231、200906232和200906233批釀酒酵母重組乙型肝炎疫苗生產(chǎn)各工序樣品（由本公司乙肝疫苗室提供）中釀酒酵母HCP，驗(yàn)證該法的適用性。釀酒酵母蛋白抗原參考品的含量經(jīng)Lowry法測(cè)定3批釀酒酵母抗原蛋白的平均含量分別為1.61、1.64和1.63mg／ml。

抗釀酒酵母IgG抗體的鑒定純化的抗體經(jīng)SDS-PAGE分析，純度為91.7％；經(jīng)免疫雙向擴(kuò)散法測(cè)定抗體效價(jià)為1∶64；Westernblot分析表明，純化的抗體能與釀酒酵母蛋白多數(shù)條帶結(jié)合，具有良好的特異性，見圖1。

雙抗體夾心ELISA法反應(yīng)條件的優(yōu)化經(jīng)棋盤滴定法確定抗釀酒酵母IgG抗體的包被濃度為20μg／ml，酶標(biāo)抗體的工作濃度為1∶2000，樣品孵育時(shí)間和酶標(biāo)抗體反應(yīng)時(shí)間分別為60和40min。

抗原參考品的最佳線性范圍和最低檢測(cè)限：釀酒酵母抗原參考品的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，最佳線性范圍為6.25～200ng／ml，最低檢測(cè)限為6.25ng／ml。2.4.2特異性：用建立的雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè)小牛血清、人血白蛋白、MEM培養(yǎng)基、Vero細(xì)胞上清蛋白、Vero細(xì)胞乙型腦炎疫苗及PHK細(xì)胞狂犬疫苗，均無特異性反應(yīng)，表明該方法特異性良好。

準(zhǔn)確度和精密度：檢測(cè)不同濃度的抗原參考品回收率在97.6％～107.00％之間，變異系數(shù)均＜10％；檢測(cè)6.25和12.5ng／ml的抗原參考品回收率低，變異系數(shù)大，不能作為定量測(cè)定。見表1。因此最低定量檢測(cè)限為25ng／ml，低于25ng／ml只能做定性檢測(cè)。

適用性：檢測(cè)結(jié)果表明，3批乙型肝炎疫苗各生產(chǎn)工序中的釀酒酵母HCP均呈下降趨勢(shì)，表明該方法可有效地反映出各工序中釀酒酵母HCP含量，見表2。

目前，以釀酒酵母為宿主的生物制品有重組乙型肝炎疫苗、注射用重組人干擾素α2a、α2b等。重組乙型肝炎疫苗（釀酒酵母）采用免疫印跡法檢測(cè)其純度；注射用重組人干擾素α2a、α2b（釀酒酵母）則采用《中國藥典》三部（2010版）方法測(cè)定菌體蛋白殘留量。酶聯(lián)免疫法測(cè)定酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的重組制品，與免疫印跡法相比，耗時(shí)短，操作簡(jiǎn)單。本文建立的檢測(cè)生物制品中釀酒酵母蛋白殘留量的方法若制作成酶標(biāo)試劑盒，則會(huì)填補(bǔ)國內(nèi)的空缺。

本實(shí)驗(yàn)依據(jù)釀酒酵母重組疫苗的生產(chǎn)工藝制備了3批釀酒酵母蛋白，并制備了釀酒酵母蛋白參考品。以釀酒酵母蛋白為抗原免疫家兔，制備了兔抗釀酒酵母血清，采用辛酸-硫酸銨沉淀法，純化獲得了兔抗釀酒酵母蛋白IgG，經(jīng)SDS-PAGE和Westernblot分析，制備酶標(biāo)抗體，建立了釀酒酵母ELISA雙抗體夾心法，經(jīng)驗(yàn)證，線性關(guān)系良好，最低檢測(cè)限為6.25ng／ml，最低定量檢測(cè)限度為25ng／ml，精密度及準(zhǔn)確度良好，有望開發(fā)為酵母細(xì)胞HCP定量檢測(cè)試劑盒。