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作者：曾哲靈 奚光興 葛曉環(huán) 單位：南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院 南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院

1材料與方法

1.1材料與儀器苦瓜藤購自農(nóng)村；牛血清蛋白購自美國Sigma公司；葡萄糖、考馬斯亮藍(lán)G-250、磷酸、苯酚、濃硫酸、鹽酸溶液、氫氧化鈉、無水乙醇等試劑皆為國產(chǎn)分析純。KQ5200E型超聲波清洗器（40KHZ，200W）昆山超聲儀器有限公司；HH恒溫水浴箱中大儀器廠；765pc型紫外-可見分光光度計(jì)上海光譜儀器有限公司；R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海申生科技有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵鄭州長城科工貿(mào)有限公司

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1苦瓜藤多糖的提取工藝流程新鮮的苦瓜藤曬干后，剪成2~3cm的小段，粉碎機(jī)粉碎，60℃條件下烘干至無游離水，取一定量的苦瓜藤藤粉末，按一定條件超聲波提取后，離心取上清液，過濾，50℃真空旋轉(zhuǎn)濃縮提取液，加入4倍體積的無水乙醇，4℃下醇沉8~12h，醇沉兩次，離心，乙醚洗滌，烘干，得苦瓜藤粗多糖。

1.2.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備[14-15]準(zhǔn)確稱取105℃烘至恒重的葡萄糖標(biāo)品1g，蒸餾水定容至1L，移取2mL，用25mL的容量瓶定容，得0.08mg/mL葡萄糖標(biāo)液。分別吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL葡萄糖標(biāo)液于25mL比色管中，補(bǔ)足蒸餾水至2.0mL，加1.0mL6%苯酚，再加入5.0mL濃硫酸，搖勻，靜置冷卻至室溫，在490nm處測定吸光度值。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。葡萄糖含量與吸光度值經(jīng)回歸處理，回歸方程為：A=14.373C-0.0133，R2=0.9969(n=8),糖含量在8～64μg線性良好，見圖1。

1.2.3苦瓜藤多糖得率的測定[16]取提取液上清液，過濾，定容至250mL，分別吸取0.1mL提取液，補(bǔ)足水至2.0mL,測定吸光度值，根據(jù)測得的吸光度值A(chǔ)，參照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出多糖濃度，進(jìn)而得到得率。

1.2.4超聲波提取單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1提取溫度準(zhǔn)確稱取5.0g苦瓜藤粉末5份，料液比為1:40(g/mL)，pH為7，分別取30、40、50、60、70℃，超聲提取20min，離心取上清液，過濾，計(jì)算多糖得率，每個(gè)因素做四個(gè)平行。

1.2.4.2料液比準(zhǔn)確稱取5.0g苦瓜藤粉末5份，溫度為60℃，pH為7，料液比分別為1:20、1:30、1:40、1:50、1:60(g/mL)，超聲20min，余下操作如1.2.4.1。

1.2.4.3提取時(shí)間準(zhǔn)確稱取5.0g苦瓜藤粉末5份，溫度為60℃、料液比1:30(g/mL)，pH為7，分別超聲10、20、30、40、50min，之后操作如1.2.4.1。

1.2.4.4pH準(zhǔn)確稱取5.0g苦瓜藤粉末5份，溫度60℃、料液比1:30(g/mL)、超聲時(shí)間30min，研究不同pH條件3、5、7、9、11下的多糖提取得率，余下操作如1.2.4.1。

1.2.5苦瓜藤多糖超聲波提取的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[17]在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，因素水平表見表1。

1.2.6熱水提取法單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)熱水提取法單因素實(shí)驗(yàn)，并優(yōu)化工藝，比較分析兩種提取方法的優(yōu)劣。以料液比、提取時(shí)間、提取溫度這3個(gè)單因素為研究目標(biāo)。

1.2.6.1料液比準(zhǔn)確稱取5.0g苦瓜藤粉末5份，溫度70℃，料液比分別為1:20、1:30、1:40、1:50、1:60(g/mL)，熱水提取90min，之后操作如1.2.4.1。

1.2.6.2時(shí)間準(zhǔn)確稱取5.0g苦瓜藤粉末5份，溫度70℃、料液比1:50(g/mL)，分別浸提30、60、90、120、150min，之后操作如1.2.4.1。

1.2.6.3溫度準(zhǔn)確稱取5.0g苦瓜藤粉末5份，料液比1:50(g/mL)、浸提時(shí)間90min，分別在50、60、70、80、90℃條件下提取，之后操作如1.2.4.1。

1.2.7苦瓜藤多糖熱水提取的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L9(33)正交實(shí)驗(yàn)，因素水平表見表2。

1.2.8超聲波提取法與熱水提取法的比較分別取5.0g苦瓜藤粉末2份，分別用超聲波與熱水提取的最佳工藝各提取2次，測定其多糖濃度，得出多糖得率，比較兩種方法的提取效率。

1.3統(tǒng)計(jì)分析各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)平行4次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示。數(shù)據(jù)采用GraphPadPrism（5.01版）進(jìn)行分析，結(jié)果顯示單因素?cái)?shù)據(jù)的p值<0.05，具有統(tǒng)計(jì)顯著性。采用正交助手Ⅱ（3.1版）對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀、極差和顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1超聲波提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1.1提取溫度對(duì)苦瓜藤多糖得率的影響由圖2可見，苦瓜藤多糖得率隨著溫度的升高而上升，但到達(dá)60℃時(shí)趨于平緩，考慮到在高溫下部分多糖分子會(huì)發(fā)生鍵的斷裂，結(jié)構(gòu)破壞，其活性會(huì)遭到破壞。同時(shí)過高的溫度對(duì)設(shè)備要求較高，耗能大，故溫度選在60℃為宜。

2.1.1.2料液比對(duì)苦瓜藤多糖得率的影響由圖3可知，苦瓜藤多糖的得率隨著料液比先增高后下降，在1:30(g/mL)達(dá)到最大。1:30(g/mL)以后提取率下降的原因，可能是料液比過大,會(huì)增加超聲波破碎細(xì)胞的阻力,使細(xì)胞破碎程度下降,降低多糖的提取率;如果料液比過小,又沒有足夠的水溶解出苦瓜藤多糖,也會(huì)使提取率降低[18]。故料液比宜取1:30(g/mL)。

2.1.1.3超聲時(shí)間對(duì)苦瓜藤多糖得率的影響由圖4可知，隨著時(shí)間的增長，提取率逐漸上升，到30min時(shí)達(dá)到最大，時(shí)間再增加時(shí)提取率又會(huì)下降，造成這一現(xiàn)象的原因可能是超聲波作用的時(shí)間過長,也會(huì)使得部分多糖的高分支結(jié)構(gòu)受到破壞,使其溶于水的特性消失[18]，從而降低了多糖提取率。故時(shí)間宜取30min。2.1.1.4pH環(huán)境對(duì)苦瓜藤多糖得率的影響由圖5可見，多糖得率隨著pH增加而升高，可見多糖在酸性環(huán)境下不穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)易變化，或分解，造成提取率降低，而在堿性環(huán)境下比較穩(wěn)定，但是，過堿的環(huán)境對(duì)多糖的品質(zhì)會(huì)有一定的影響，且多糖得率從pH為7時(shí)增幅就不大，故pH宜取7。

2.1.2超聲波提取正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果超聲波提取苦瓜藤多糖正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知，四因素對(duì)苦瓜藤多糖得率的影響大小為：溫度>超聲時(shí)間>pH>料液比。其最佳提取工藝參數(shù)為A3B3C3D3，但由于pH和料液比為次要因素，為節(jié)約成本考慮，調(diào)整pH為7，料液比為1:30(g/mL)，其組合為A3B2C3D2。與A3B3C3D3做驗(yàn)證性比較，結(jié)果表明，A3B2C3D2的得率為2.36%，A3B3C3D3得率為2.38%，而表中A3B1C3D2的得率為2.35%。由此可見，從提取率和能源節(jié)約兩方面綜合考慮，A3B1C3D2可為最優(yōu)提取工藝。根據(jù)最優(yōu)提取工藝分別提取1、2、3次，結(jié)果表明，一次提取率為2.36%,兩次提取混合液為提取率為3.08%，三次提取混合液為3.44%，三次提取增幅很小，出于經(jīng)濟(jì)因素考慮，取2次提取為宜，因此，超聲提取苦瓜藤多糖的最優(yōu)工藝為：提取溫度65℃、料液比1:25(g/mL)、超聲時(shí)間35min、pH為7，浸提2次。#p#分頁標(biāo)題#e#

2.2熱水提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1.1料液比對(duì)苦瓜藤多糖得率的影響由圖6可知，苦瓜藤多糖的得率隨著料液比先增高后下降，在1:50(g/mL)達(dá)到最大。1:50(g/mL)以后提取率略有下降，如果料液比過小,又沒有足夠的水溶解出苦瓜藤多糖,也會(huì)使提取率降低。故料液比宜取1:50(g/mL)。

2.2.1.2浸提時(shí)間對(duì)苦瓜藤多糖得率的影響由圖7可知，隨著時(shí)間的增長，提取率逐漸上升，到90min時(shí)達(dá)到最大，時(shí)間再增加時(shí)提取率又會(huì)下降，造成這一現(xiàn)象的原因可能是熱提時(shí)間會(huì)使得部分多糖的高分支結(jié)構(gòu)受到破壞,使其溶于水的特性消失，從而降低了多糖提取率[18]。故時(shí)間宜取90min。

2.2.1.3提取溫度對(duì)苦瓜藤多糖得率的影響由圖8可見，苦瓜藤多糖得率隨著溫度的升高而先升后降，在70℃時(shí)提取率最高，在高溫下部分多糖分子會(huì)發(fā)生鍵的斷裂，結(jié)構(gòu)破壞，其活性會(huì)遭到破壞[19]，故溫度選在70℃為宜。

2.2.2熱提法正交試驗(yàn)結(jié)果熱水提取苦瓜藤多糖正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4可知，三因素對(duì)苦瓜藤多糖得率的影響大小為：料液比>浸提溫度>浸提時(shí)間，其最佳提取工藝參數(shù)為A3B3C2。結(jié)果表明，A3B3C2的得率為2.32%，A3B3C2可為最優(yōu)提取工藝。根據(jù)最優(yōu)提取工藝分別提取1、2、3次，結(jié)果顯示，第一次提取率可達(dá)2.22%，二次提取混合液3.06%，三次提取混合液為3.43%，兩次提取比較完全，三次提取增幅不大，因此，熱水提取苦瓜藤多糖的最優(yōu)工藝為：提取溫度75℃、料液比1:55(g/mL)、提取時(shí)間90min，浸提2次。

2.3超聲波提取法與熱水提取法的比較在各自的最佳工藝條件下，超聲波提取35min提取率能達(dá)到2.36%，熱水提取90min提取率為2.32%。由此與熱水提法相比，超聲波提取法節(jié)約了將近60%的時(shí)間，效率約為水提法的2.5倍；兩種方法的兩次提取總量相當(dāng)，說明第二次提取時(shí)細(xì)胞粉碎程度比較完全，超聲波的影響已經(jīng)不太顯著，但總的來說，提取液的用量和提取溫度也比熱水提取法少的多，符合綠色節(jié)能的發(fā)展要求。

3結(jié)論

通過本實(shí)驗(yàn)的研究，得出苦瓜藤多糖超聲提取的最優(yōu)工藝為：提取溫度65℃、料液比1:25(g/mL)、超聲時(shí)間35min、pH為7，浸提2次，四因素對(duì)苦瓜藤多糖得率的影響大小為：溫度>超聲時(shí)間>pH>料液比。熱水提取苦瓜藤多糖的最優(yōu)工藝為：提取溫度75℃、料液比1:55(g/mL)、提取時(shí)間90min，浸提2次，三因素對(duì)苦瓜藤多糖得率的影響大小為：料液比>浸提溫度>浸提時(shí)間。通過兩種提取法的最佳工藝的比較發(fā)現(xiàn)，超聲波提取法的效率約是傳統(tǒng)熱水提取法的2.5倍，驗(yàn)證了超聲波提取的高效性。由單因素的結(jié)果可以看出，苦瓜藤多糖對(duì)熱、酸不是很穩(wěn)定，所以提取苦瓜藤多糖時(shí)要避免高溫、加熱過久，pH環(huán)境不可過酸，以便得到較多和較穩(wěn)定的多糖。苦瓜藤粗糖含有很多組分，這些都有待進(jìn)一步研究。